DNA提取方法

酶解法
溶菌酶 蛋白酶 蜗牛酶
2011-8-2
方法
SDS 的高盐提取法
Tsai 报道的方法 Edgcomb 改进法 玻璃粉吸附法
2011-8-2
SDS高盐提取法
1g土壤，研碎
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2.7 ml DNA提取液，20µl蛋白酶k
15～20min颠 倒几下
0.3ml 20% SDS 65℃水浴2h
2011-8-2
其它文献
氯化钙-SDS-酶法可以高效去除腐殖酸，所提取的 DNA 纯度较高； 可选择基于的高盐提取法和透析袋回收法。 杨建采用FastPrep法的DNA得率最高，但其成本 较高；
2011-8-2
其它文献
Eichner 调整法 （Eicher C A, Erb R W, Timmis K N, et al. Appl Environ Microbial[J]. 1996，62(10): 3787-3793.) ， Kuske 修订法 (Christense B, Fink J, Merrifield R B, et al. Proc Natl Acad Sci USA[J]. 1998，85(14):5072-5076.) ，
2011-8-2
总结 总结
用TENP和 PBS buffer或其他方法对土样预处理； 不同提取缓冲液对土壤DNA提取也有影响； 对提好的DNA进行真空抽干。
2011-8-2
总结
将土样分成几份，分别用不同的方法对土样进行预处理提 DNA，并对其进行检测，如果结果不好，就把几种经处理 的土样所提的DNA混合在一起，在进行下步实验。
2011-8-2
其他文献
杨建采用TENP和 PBS buffer对土样进行预处理 ；
熊开容等用冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法获得的DNA最 适合于酶解和PCR扩增的要求；
2011-8-2
其它文献
Tsai等采用EDTA和溶菌酶处理后再进行3次冻融处理， 95%细胞被裂解；
Julia等采用试剂盒FastDNA Spin Kit for Soil ( BI0101， Vista，CA)获得了理想的土壤微生物多样性。
加入用玻璃粉匀化后的粗提取液100µl， 用100µl含高盐的TE缓冲液洗涤并离心(130×g,10min） 连续3次，丁醇分离出DNA
2011-8-2
方法比较
方法 裂解液 裂解法 SDS 的高盐提取 法 DNA 提取液 蛋白酶 K 20% SDS 涡旋 10s,65℃水浴 Tsai 报道的方 法 Edgcomb 改进 法 玻璃粉吸附法 TE 缓冲液 使用 Sephadex G-200 离心柱 玻璃粉吸附
Tsai报 道方法
1g土壤，研碎 2mlPBS 37℃摇床 225r/min振荡30min 12000r/min 离心10min 1.5ml溶液I， 0.5ml溶菌酶， 37℃水浴2h， 2ml溶液II， -20℃冰浴， 65℃水浴循环三次 6000r/min离心10min，取上清， 等体积苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1抽提两次
2011-8-2
其它文献
Kuske等用玻璃珠研磨匀浆法裂解细胞，加入不同直径的 玻璃株，直径为710-1180µm玻璃珠珠可打碎土壤块和植 物细胞，106 µm玻璃珠可打碎细菌细胞； Kuske等用热裂解法、反复冻融法和玻璃珠研磨匀浆法从 土壤中提取DNA的效果，发现热裂解法和玻璃珠研磨匀浆 法联用效果较好。
12000 r/min离心10min，取沉淀 0.9ml DNA提取液0.1ml 20% SDS，涡旋 10s， 65℃水浴10min 收集上清，重复两次，合并上清，等体积苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1 乙醇沉淀12000r/min10min，100µl无菌水溶解
2011-8-2
6000r/m in10min 离心
2011-8-2
谢
谢！
2011-8-2
DNA 抽提
NaCL,EDTA, PBS 溶菌酶 溶菌酶 -20℃冰浴 -20℃冰浴 65℃水浴循环三 65℃水浴循环三 次 次 苯酚:氯仿:异戊 苯酚:氯仿:异戊 苯酚:氯仿:异戊 醇 醇 醇
2011-8-2
方法比较
SDS 的高盐提取 Tsai 报 道 的 方 Edgcomb 改 进 玻璃粉吸附法 法 法 法
2011-8-2
总结
重新纯化DNA； 重新沉淀DNA； 增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）； 减少DNA降解； 尽量取新鲜材料，低温保存材料； 避免反复冻融； 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配； 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。
2011-8-2
总结
G＋菌裂解前先用生物酶或机械方式破壁； 高温裂解时，时间适当延长，并可增加PK的用量； 低温沉淀，延长沉淀时间； 加辅助物，促进沉淀； 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。
环境DNA的提取方法 的提取方法 环境
Leabharlann Baidu
2011-8-2
汇报提纲
研究方法 本实验室方法 总结
2011-8-2
腐殖酸等 去除
破壁
预处理
2011-8-2
腐殖酸
PVPP PBS
2011-8-2
CTAB
细胞破碎
化学试剂法
表面活性剂 强离子剂
物理法
玻璃珠法 超声波法 冻融法 低渗裂解、 微波裂解 颗粒破碎等
12000r/min离心10min，100µl无菌水溶解
2011-8-2
Edgcomb 改进法
1g土壤，研碎 2mlPBS 12000r/min离心10min取沉淀 1.5ml溶液Ⅰ， 0.5ml溶菌酶，37℃水浴1.5h
加5mol/LNaCL 270µl溶于0.7mol/LNaCL的5mol/L CTAB270µl 2ml溶液II， 65℃水浴10min，将样品轻轻移至-20℃冰浴，65℃水浴三次 6000r/min离10min 取上清液等体积苯酚:氯仿:异戊醇25:24:1，抽提两次 乙醇沉淀， 12000r/min离心10min， 100µl无菌水溶解
2011-8-2
纯化
采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒对粗提的DNA样品进 行纯化； 将待纯化的粗提DNA溶液用50×TAE调整到1×TAE； 加入两倍体积的溶液I，70℃温浴，加入纯化柱内，离心， 0.5ml 75%酒精清洗两次，加入双蒸水离心，取上清液； 透析袋电洗脱纯化回收法。 （J萨姆布鲁克，E F弗里齐，T曼尼阿蒂斯 ）
2011-8-2
1g Sephadex G-200水化合 用含高盐的TE缓冲液洗5次,自然分离
玻 璃 粉 吸 附 法
用1ml无菌注射器紧贴洗涤器底部将悬浮液抽出注入 15ml的无菌螺帽塑料管中，不断离心(130×g,10min) 使颗粒塞紧管底直到形成1.1ml的压实柱
100µl含高盐的TE缓冲液冲洗，离心(130×g,10min ) 转移至新的无菌螺帽塑料管中
方 法 评 价
产 量低 , 且 电 泳 重复 性 很 好 , 可 保证一定的提取 去除 PCR 抑制 结果不明显 与回收效率及 DNA 纯化过 以满足大多数微 DNA 的提取质 剂， 生物分子生物学 量 , 提 取 和 纯 化 程中损失最少， 过程 DNA 不会 实验的工作需要 受到机械损伤， 提高了 PCR 的 适合从不同类型 敏感性，回收率 的土壤中提取总 达 75%-100% DNA