降压肽的研究进展

降血压肽的分离纯化及活性研究
摘要：多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向，随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高，不断有新的肽类物质被发现并应用于防病治病之中。

本文介绍从玉米中提取肽类物质的分离纯化、活性检测主要方法及研究进展，并对其结构进行简单介绍。

关键词：玉米肽降血压酶解分离纯化结构
前言：我国的玉米年产量占世界总产量的20％，仅次于美围，但是我国的玉米加工主要是提取淀粉，只利用了玉米的50％～60％，其余的大部分以粗饲料或者当作“三废”处理和排放，不仅极大浪费了资源，而且造成环境污染。

而这些副产物中含有60％以上的蛋白质，这些副产物又称为玉米蛋白粉或为玉米黄粉，是一种有待开发的资源。

因此，研究利用玉米蛋白粉，开发新用途，提高玉米的综合利用价值成为当前的一个重要研究课题。

[1,2]
玉米肽主要来自玉米蛋白的水解产物，是由分子量很小但活性很高的短肽分子组成。

玉米多肽易消化、吸收，具有消除疲劳、抗高血压、抑制根系形成和醒酒的功能，可用于功能食品的开发。

玉米蛋白以其水难溶性及赖氨酸、色氨酸的严重缺乏致使其利用率低，但是其高比例的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸以及高含量支链氨基酸和中性氨基酸是植物蛋白中颇为少见的特色组成，正是这种不平衡的氨基酸组成使玉米蛋白成为功能活性肽的来源。

目前，关于降血压肽的制备及其结构与功能的关系成为功能活性肽研究的重要方向。

[3,4,5,6]
降血压肽又称为血管紧张素转化酶抑制肽是具有降血压作用的生物活性肽。

它通过与肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)中关键酶ACE 的活性部位结合，使ACE失活，达到降低血压的作用。

ACE是一种含锌二肽羧基肽酶，有2个结合Zn2+的位点，即ACE催化反应的活性基团部位。

降血压肽能够与ACE 活性部位的Zn2+竞争性结合，导致ACE的活性受到抑制，阻止ACE水解血管紧张素Ⅰ转变为血管紧张素Ⅱ，减少血管紧张素Ⅱ的生成；同时，阻止催化水解激肽，减缓激肽的破坏，从而发挥降低血压的作用。

[6,7,8,9]
1. 玉米降压肽的制备
一般，国外均用玉米醇溶蛋白做原料生产活性肽，但考虑到玉米蛋白粉中含有68％左右的醇溶蛋白，所以以玉米蛋白粉为原料制备玉米肽能降低生产成本，同时变废为宝，大大提高玉米蛋白粉的附加值和对玉米资源的综合利用率。

[10,11,12] 1.1玉米蛋白粉的酶解
1.1.1预处理天然玉米蛋白分子具有紧密的立体结构，由于氢键、疏水键、二硫键等作用，使肽链卷曲于蛋白分子内部近似于球状，很难被蛋白酶水解，因此必须对其进行预处理，破坏玉米蛋白质的二、三级或四级结构，打开氢键、二硫键及疏水键，使之变成无秩序的肽链状态。

蛋白变性方法有很多，包括添加亚硫酸钠、常压水温预热、添加乙醇等方法。

其中热处理由于具有经济、设备投资少，且经热变性的蛋白质不易回复等特点而倍受青睐。

[13,14]
1.1.2 玉米蛋白的水解方式玉米蛋白水解物的生产方式主要有化学降解法和酶降解法。

化学法是利用酸碱水解蛋白，虽简单价廉，但由于反应条件剧烈，生产过程中氨基酸受损严重，使L-氨基酸形成D-氨基酸，并能形成像Lys—Ala 这样的有毒物质，且难以按规定的水解程度控制水解，故较少采用；而酶法水解能在温和的条件下进行，能在一定条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且易于控制水解进程，因而能较好的满足肽的生产需要。

反应产物较之原料蛋白与相同组成氨基酸具有特殊的理化性能与生理功能，成为蛋白制品的发展方向。

在生产蛋白水解物中酶的选择是关键，它不仅影响最后产品的得率、反应速度，而且直接影响产品的风味和理化特性。

蛋白质水解酶来源于植物、动物和微生物。

[15,16,17]
1.1.3 玉米蛋白水解物脱苦、脱色
蛋白质在酶法水解后经常会产生苦味，产生苦味的物质是一些短肽，称为苦味肽。

这使酶法水解蛋白在食品工业上的应用受到严重的限制。

这是因为蛋白水解物中的苦味是由肽而不是游离氨基酸引起的，且苦味能吸附在疏水性吸附剂上，表现为疏水性；象明胶这样的亲水蛋白质其水解物就没有苦味。

由于苦味肽疏水性较强，因而可以用疏水吸附剂有选择地去除苦味肽。

活性炭法是最常用的一种脱苦味方法。

除了活性炭外，其他用于脱苦味的吸附剂还有酚甲醛树脂、玻璃纤维和多糖凝肢等，但活性炭依然是最普遍使用的方法。

另外,活性炭对蛋白
水解物可以进行脱色。

[18,19]
2.玉米降压肽的分离纯化
在制备降血压肽的过程中，如何分离和纯化高活性的多肽极为关键。

由于降血压肽分子结构和制备方法的多样性，导致多肽片段的氨基酸组成、分子质量、pH值、带电量等均存在较大的差异，这为目标产物的分离纯化增加了难度。

在降血压肽生产研究过程中常用的分离纯化方法主要有：超滤膜分离、大孔吸附树脂、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、高效液相色谱、亲和色谱、毛细管电泳以及薄层层析等。

一般来说，根据需要分离的样品和目标产物的性质结合各种方法的不同原理来选用一种或几种方法进行分离纯化。

[20,21]
2.1超滤分离
超滤是一种膜分离过程，它利用一种压力活性膜，在外界推动力（压力）的作用下截留溶液中颗粒和分子量相对较高的物质，水份和水的溶质颗粒透过活性膜，从而达到分离不同分子量物质的效果。

由于该方法无相变、高效率、低能耗、工艺设备简单、回收率高和处理速度快等优点被广泛应用于样品的分级分离、浓缩和脱盐。

根据大量的研究表明，具有活性的降血压肽分子量均在1000 Da左右，因此，通过超滤膜初步分离降血压肽被广泛地运用。

张宇吴等采用超滤技术对花生降血压肽进行分离，利用截留分子量为5000 Da和1000 Da的超滤膜进行分级分离，获得分子量小于1000 Da的短肽降血压肽，其ACE抑制活性非常突出，IC50达到0.4 mg/mL。

[22,23]
2.2大孔吸附树脂
它是一种新型非离子型高分子吸附剂，具有吸附和筛选性能，容易再生，在分离纯化蛋白质、多肽和氨基酸等生物活性物质时具有条件温和、设备简单和操作方便等优点。

这类树脂孔表疏水性较强，可通过与小分子内疏水部分的吸附作用达到分离纯化的作用，在多肽的分离中采用DA201-C型非极性的大孔吸咐树脂，可取得较好的纯化效果。

[24,25]
2.3凝胶层析色谱
凝胶层析也称为分子筛层析，混合物经过凝胶层析柱时各组分随着流动相，按分子大小的不同达到分离的作用。

该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高，常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等物质。

在研究过程中，
人们根据降血压肽的分子量范围，选用不同型号的葡聚糖凝胶Sephadex系列进行分离纯化、得出ACE抑制活性较高的多肽化合物。

河村幸雄用和Sephadex G-10两种凝胶，从大豆蛋白水解产物中分离得到了较高活性的ACE抑制活性组分。

辛志宏等将小麦胚芽蛋白水解物经Sephadex G-15初步纯化再用RP-HPLC分离获得对ACE有强烈抑制作用的组分。

[26]
2.4离子交换色谱
离子交换是基于溶质分子带不同性质的电荷和不同的电荷量在固定相和移动相之间发生可逆交换作用的分离手段。

离子交换剂是由基质和带电功能基团构成，其基质主要包括离子交换交联葡聚糖（Sephadex）、离子交换琼脂糖（Sepharose）、离子交换纤维素（DEAE-Sephacel）和离子交换树脂，根据基质上所带的功能基团又可分为阳离子和阴离子两类交换剂。

在肽的纯化中，由于肽链相对于蛋白质较短，所带电荷强度极弱，生产研究过程中主要选用具有强带电基团的SP- Sephadex C-25进行分离，这种阳离子交换剂由于Sephadex基质的存在，在根据电荷强弱分离的同时，还具有分子筛的功能。

Astanwan等用SP SephadexG-25离子交换层析和SephadexG-25凝胶层析处理印度尼西亚干鱼酶解产物，获得了高ACE抑制活性的降血压肽。

[27]
2.5反相高效液相色谱
在经典的液相色谱法的基础上，引入气相色谱法的理论，采用高压泵、高灵敏度检测器和高效固定相，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这就是高效液相色谱法（HPLC）。

其中，流动相为极性而固定相为非极性的色谱称为反相液相色谱法（RP-HPLC），如以十八烷基键合硅胶（ODS柱）作为固定相，水和乙腈等做为流动相的分配色谱过程。

由于操作简单，色谱过程稳定，加之分离技术的灵活多变性，RP-HPLC已成为高压液相色谱中应用最广的分支。

在肽的纯化中，RP-HPLC也是最常用且最有效的方法，它是根据肽的极性大小而达到分离的目的。

Masafumi等通过RP-HPLC对乳酪蛋白的酶解物进行分离获得一高ACE抑制活性的单一组分，经动物实验证实具有显著的降压效果。

[28,29]
3.玉米降血压肽结构的确定
分离得到的组分经RP-HPLC分析检测过为单一组分或纯度较高的肽后即可进行结构的确定。

对具有ACE高抑制率的活性物质通过HPLC /ESI-MS分析，确
定其分子量，通过氨基酸序列检测，确定所提纯的化合物的氨基酸组成。

[30,31] 4.降压肽活性结构分析
经体外实验证实具有ACE抑制活性的降血压肽，在体内并不一定都具有降压效果，因为降血压肽必须进入血液循环才能发挥其降压作用，如果是口服，经过消化道内酶的分解或者被ACE先行降解，都可能会变成无活性的短肽或氨基酸。

因此，只有通过体内实验如动物实验或者临床试验，才能更准确判断降血压肽的实际降压效果。

Hiroyuri Fjuita等通过降血压肽体外实验结果与体内实验效果的比较，将降血压肽分为3类：（1）抑制型肽，抑制型肽与体内ACE作用后，不会被ACE 再水解，可以保持它的抑制活性，动物实验的结果与体外实验的结果一致，均具有抑制ACE活性的作用；（2）底物型肽，底物型肽与体内ACE作用后，可被ACE 再次降解，生成新的小肽，从而失去原有的抑制活性，在动物体内没有降压效果；（3）药物前驱型肽，药物前体型抑制肽可被ACE或肠道内的酶水解为真正的降血压肽，这类降血压肽在体外实验中并不显示出较强的ACE抑制活性，但在动物实验中却可以体现出较显著的降压效果。

[32]
贾俊强等人通过对收集的270种降血压肽的氨基酸组成进行分析 ,研究降血压肽的构效关系以及如何选择蛋白酶和蛋白原料用酶解方法制备降血压肽。

结果表明:降血压肽中 ,N端氨基酸主要为Arg、Tyr、Gly、Val、Ala、Ile和Leu ；C 端氨基酸主要为Tyr、Pro、 Trp、Phe和Leu；与降血压肽的N端氨基酸特征相比,其C端氨基酸特征对降血压活性影响更为重要。

根据降血压肽的构效关系可以看出,在选择蛋白酶和蛋白原料制备降血压肽时,优先选择酶切位点为 Tyr、Pro、Trp、Phe和Leu羧基端的蛋白酶以及富含Tyr、Val、Ala、Ile、Leu、Pro、Trp 和Phe的蛋白。

[33]
目前，日本、美国、欧洲已捷足先登，推出具有各种各样功能的食品和食品添加剂，形成了一个具有极大商业前景的产业，国内对玉米降压肽的研究主要集中在利用单一酶或者复合酶水解来提高水解度和优化水解条件等方面以提高其利用率或降压活性，有关玉米降压肽中降压组分的分离提取、结构鉴定、降压机理的文章并不多见，而玉米蛋白水解物的结构和降压功能相关性的研究则更少。

主要原因①玉米蛋白水溶性极差是造成对其进行利用的难点，也是不能提高其水
解度的瓶颈，因此努力探索提高其水解度的途径是提高玉米蛋白利用率的首要任务；②尚需进一步摸索生物活性肽的简便分离方法以寻求降低成本、提高效益，从而保证工业生产的可行性；③尽管来源于玉米蛋白的生物活性肽国内有不少的报道，但是不能忽视的是已经或尚未发现的生物活性肽仍然存在，其生理功能方面的研究有待深入，比如建立有效的生理功能的筛选系统等。

[32,33]综上所述，在我国利用酶解玉米蛋白制成功能性食品的例子尚不多见，因此不仅开发其产品尤为重要。

加强在食品方面的应用研究也非常重要，特别是研究食品加工条件对生物活性肽的影响等；另外还应加强含有生物活性肽的功能性食品摄入量与人体代谢平衡之间关系方面的研究。

通过以上的国内外的综述，显现出植物蛋白质资源的高附加值产品的生产前景广阔，若能加快实现产业化，必将为动植物蛋白质资源的开发利用产生积极的推动作用。

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