玉米样品中转基因玉米Bt176含量检测

儿 刀加Ｉ Ｌ Ｂ ｈｎ ｕ ａ ｕ ｃ ｏ
Ａ ｓ ａ Ａ ｃ ｄ１ｔｔ ｓ ｉ ｉ ｏｄｔｔｎｔ ｄ ｃｏ 功 ｔ ｄｏＧ ＯＰ ｄｃ ｃ ｂ妞 ｃ ｃ ０ ｊ ｏｈ Ｐ ｆｔ ｆ ｅ ｃｏ， ｅ ｌｎ ｅ ｏ ｆ Ｍ ｒ ｕｔ 即加 ｄ ｉ 加ｏ ｔ ｒＩ ｇ ｅ ｅ ｉｙ ｃｃ ｅｉ ｈ 加 ｉ ｅ ｂｓ ｏ ｓ ｉｄ ｔ ｖｅ ｄ 伪 ｒａｇｒｓＳ ｅｉ ｅｅ ｃ ｓｕｔ胡ｄ ｖ ｓ ｃ ， ｄ ｅ ｎＳ ｃ ｃ ｅ ｏ ｉｂｉ ｔ ｍ ｓ ｕ ｃ ｏｅ Ｃ ｎｎ ｌ一 ｏ 汀ｃ ｅ ｔ ｉ； ｅ ｒ 肠ｇｌ， ｎ ． ｅ ｎ ｐ ｉ ａ ｔ ｅ ｔＰ 访 ｍ ｌ ｓ ｅ ｇ ｏ ｔ ｅ ｅ ｆ ｎ ｈ ｖ ｅ ｔ ｃ ｉ ｈ ｄ ｎｈ ｅ ｓ ｅ ｈ ｆ ｓ ｅ ｉ ｏ Ｍ Ｉ Ｃ ｎｏ ｄｖ ０ ｃ ｎｉ ｅａ ｕ ｍ ｔ ｄ ｄｔｔｎ Ｇ ０Ｐ ｕ ｉｓ ｅ ｅ １ ｄ ｕ仕 ｂｃ 记 ｈ ｓ ｉ ｔ． ａ ｄ ｄ ｅ ｏ ｏ ｒ ｃＯ ｆ ｄＳ ｏｔ ｍ ｅｐ ｏ ｅ ｓ ｓ ｅ ｕ ｅ ｓ ｌ Ｐ 尔ｉ Ｂｓ ｏ ｂ ｃ ｇ ｅ ｙ ｅ ｎ ｈ ， ａｓ ｎ ｎ ｇ ｔｎ ｑｅ ｏｔ ７ ｔ ３一 ｎ ｅｌｉｅ ａ０ Ｓ ｐＤｅ Ｂ１ ￣ ， ｐｌ ｒ ａ ａ Ｔｑ ａ Ｐ ｂ ｗ ｄｓｎｄ ｓ ｉ ｅ 七 ｇ ｃ ｔ １ ｅ ｃｆ ６ ｒ ａ ｎ ｅＰｌ 力 ａｍ ｒ ｅ ｎ ｒｄ ｎ ｏ ｅ ｓｉ ｅ ｆ Ｐ ａ ｒ ｇ ｏ ｅ ｒ ｃ ｌ ｓｅ ｉ ｏＢ ７． ｙ ａｔ Ｐ ｂ ｌ ａ ｃｒ ｓ ｆ ｔ ｇ ｅ ｎ ｅｏ ｅｏ ｅ ｅ ｅ ｅ ｅ ｓ ｄｔ ｔｎ ｆ ｔ ６Ｂ ｒ Ｌｉｅ 凡ｔ ｓ ｄ ｄ ｕｖ ｏＢ１６ ｎ ａｄ ｄｇｎｕ ｒ ｒ ｃ ｇ ｗ 化ｅ ｃｏ ｌ ｅ ｍＣ ｅａｒ ｎ ｅ ７ｅ ｎ ｓ ｆ ｅ ｎ ｎ － 切 ｌ ｅ ｗｔｔ ｋｏ恤ｃ爪 ｓ 甲 ｓ Ｂ ７ ｓｇ ｃ ｓ ｅ ｈ ｏｔ ｔｆｅ ｒ ｓ Ｐ 份 ｂ ｂｄ ｉ ｈ ｎ 场 。 叨ｔ ｌ ｌ ｏ ｔ ６Ｕ七 ｔ ｕ ， Ｇ ｌ ｎ ｎｏ ｓ ｅ ｌａ ｌ ｓ ｉ ｈｅ ａ ｅｆ ｌ ｒ ｌｂ ｒ ｅｖ ｅ ｈ ｔ ｏｃ ｅ ｖａ ｍ ｅ ｓ ｅ ． ｈ ｅ ｔ ｏｃ ｈ ｔ ｄ Ｔｅｒ ｌ ｉ ｌ ｄｔ ｅ ｏ ｗ‘ａ ｒｅ 印ｅ ａ ｓ ｉ ｅａｄｓ Ｐ ， 址 ｈｗ ｓｓ ｔ ｏ ｅ ｔ ｓ ｕ ｓ ｓ ｄａ ｅ ｔ ｅｍ 山 ｄ ａ “ｕ ， ｃ ， ｎ ｔ ｌ ｌ ｌ ｗ ｃ ａ ｕｅ ｒ ｔ ａ ｉ ｅ ｊ ｌ ｍｅ ｉ ｓ ｖ ｉｄｆ ｉ 加 ｇ ｔｄｔ ｉ ｆ ｒ ｓ ｎ ｍ Ｓ１１． ｈ ｔ ｕ ０ｔｅｃｏ ｏ１ｎ ｅ１ 沙 刃ｈ ｌ ｅ ｎ ｔ ａｇ ｃ ｅ ｒ ａ ａ １ｅ ｌｓ Ｐ Ｋｙｏ ｅｗ ｒ Ｔａｓ ｍ ｍ １ ， １６Ｒ ａｔ ｅ Ｃ ｓ ｄ ｒ ｇ ｃ ａ ｅＢ ７， ｌ ｉ Ｐ 民伽明６ ｔ ｔ ｎｅ ２ｔ ｅ ． ｍ ａｖ ｓ ｔｉ ｅ ｅ ｔ
Ｌ Ｎ ４Ｄ Ａ提取
Ｌ ３探针和引物设计
叫泌、２呵卜 和众 ２呵汕 的 准样品 对５ １ ５ Ｌ ３ １ ５ 标 。
方程为：于Ｚ５ ２ ８７，， ｙ ｅｏ ｘ ２ １ ｘ和、分别为 Ｚ ． ＋ ４ ｓ３ 所有玉米 和转基因玉米Ｂ１ 的 ｔ ７ 浓度对数值， 和ｈ分别为 ６ ｙ ，
Ｄ Ａ提取参照 Ｄ Ａ提取试剂盒操作说明书。 ｚ 和Ｂ１ 基因的Ｃ 值， 卜 Ｎ ｅ ｎ ｉ ｔ７ ６ ｔ ｒ为方程的 相关系数。 因 提取的Ｄ Ａ用分光光度计进行质量分析。 Ｎ 此，只要测出 未知样品及ｉ基因 ｎ 和＆１ 乃基因的ｃ ｔ 值， 就可以获得玉米样品转基因玉米 Ｂ１ 的含量： ｔ７ ６ ＬＳＲｅ ｌ山刀 ＣＲ ａ一 ｅＰ
定 反 用 套 剂 ａ ａ又ｉｒ ＰＲ ａ 量 应 配 试 盒Ｔ Ｍ ｊ ｅａ Ｍ － ｑｎ ｎ ｓ ｃ ｓ ｖｌ
个梯度的标准样品进行ｒ ． ｅ Ｒ ｅ ｔ Ｐ ，每个样品设 ｌ ｍ ａｌ ｃ 个重复， 源基因和目 内 的基因（协和Ｂｌ 分 ｅ ｚ ｔ劝 根据转基因玉米 Ｂ ７ 的外源基因３端序列 置３ １ Ｔ６ ， 以及玉米基因组的旁测序列 （即 ａ ｎｍｅ 管扩增。两个基因实时荧光定量扩增图及标准曲线 Ｇ Ｂｌ ｕ ｂ ： ｌ ｋ ｒ 、 ， ｔ 。 月５５０ ７６乃，利用Ｐｍ ｒ ｘｒ阳论．软件（ ｌｄ 见图 １图２对 Ｃ 值统计分析结果见表 １从结果可 ｉ ｒ ｅＥｐ ｓ ０ ｅ 助ｐｅ ｉ 两个基因扩增稳定， 浓度较低的样品用较多 ｉ ｙｅ） Ｂ ｓｌ ｓ Ｏ ｓｌ 设计特异引 ｎ 物和探针， 序列如下毋ｔ６ １ 一 以看出， ７Ｆ ： 其ｔ ５橄 ｇｃ ｃ ｇ 枷ａ ３ Ｂ１ 一：５ｃ宜 ｔ ｃ ９ 的循环次数才能产生较高的荧光信号， Ｃ 值也相 ， ｄｇ ｇ ａ ｇ ， ｔ ６ 一 ａ 龟 ｃ － ， ７ Ｒ ，ａｇ ｇ 多 ． 一 ａｇ ｌ ｔ ｃｃ 一 ｐ ｂ沈电“ ｇｃ多ｃ ） ｔｔ ， ｏ ａａ ３ ｒ ｅ ｃ ｃ加ｇ ｃ 。玉米的内 ｃ ｇ ｔ 源基 应增大；另外同一参照样品重复间ｃ 值变异不大， ｉ ｅ 基因最大变异系数（Ｖ ） 夕 ， ｌ Ｃ ％ 为０ ２ Ｂ 乃 ９ｔ 因 Ｚｉ探针和引物序列参照中华人民共和国出入境 其中：ｎ ｅｎ ． 以样品 ６ ２ 浓度对数值对 检验检疫行业标准（ ０ ， ０） ２４ 探针５端分别用荧光报告 基因最大变异系数仅为。 ９。 ， ｔ 线， 其中２ｉ基因的 冶 ｎ 基团Ｆ Ｍ标记， 端用荧光淬灭基团Ｔ Ｍ Ａ标 Ｃ 值作标准曲 获取回归方程， Ａ ３ ， Ａ Ｒ 回归方程为：，１３ ｌ ７０， ｌ ｌ ７ ｘ２ １ ｔ ｙ ． ４＋ ， Ｂ 万基因的回归 ４ 记。所有探针和引物由Ａ Ｉ Ｂ 公司合成。
２方法验证和灵敏度检测 盒， 反应在２ 泌 的 ５ 体系中 进行， 其中ＺＴｑ ａｕ ２ ｘａ ｌ Ｍｌ ． － ｅ ａ Ｒ ｅ ｉＺ ｖ ｓ ｃ ａｔ ｎ ｌ ｍ ｒ Ｐ Ｍ ｓ ｌｘ ．泌， Ａ模板１ Ｌ ｌ ｒ ５ Ｄ Ｎ 卜， 正 为了验证该方法的特异性、 准确性和灵敏度， 设 反向引物各。 泌 （ 卜 ｏ ， ‘ ５ ２ ０ ２ ｍ 比）探针 １ １ 置５ 泌（ ０ 个己知的 转基因玉米样品，其中含Ｂｌ 的３ ｔ７ ６
２ １ Ｒ 血吃 ｅ ａ， ｏ３ Ｈ ｒａｄｚｅ ａ， ０３ ０ ；ｏ ｔ ｉ Ｚ ； ｅ ｎｅ ｔ ｉ ２ ； ． ｎ ．
基金项目 北京市科技计划重点项目Ｎ Ｚ ｓቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ） ： （Ｆ ｏ 一１
万方数据
转基因 玉米参照样品归ｔ ６ １ 购自刊 公司， ７ ） 业ａ 其
分子植物育种
Ｍ（ ｕ Ｐａｔ ｒｅｉ ， 址 ｌ ｎＢ ｄ ｇ ｌ ｃ ｅ ｅ ｎ
随着转基因产品的不断增加，在国际进出口贸 易中， 一些输入国 不仅要知道进口的产品是否含有 转基因成分， 而且还要查明该转基因成分来自 哪个 作物品系， 该品系是否获准进入本国， 其含量是否超
Ｙ ｇ ａ，ｏｓ Ｙｎ ａａ，ｏｓ 黄文胜等， 曲 ｅｌ Ｚ ａ ａ ｔｌ Ｚ ｂ ｔ． ； ｇ ． ； ２５ ０） ．本文根据已发 表的Ｂ１ 玉米其外源基因３ ｔ７ ６ ’ 末端序列以及与其相连的基因组序列 （ ｖｍｅ ｅ Ｔ ｅｉ ｔ ａ ｓ ｒ ．０ ｌ ２５ 设计特异引物和探针， ａ， ０） 建立了针对Ｂ１ 玉 ｔ７ ６
过 法 域 （ 本国 定的 值 桂枝等 ２ ５ 因 对某 ， ） 此针 个转 米定量检测技术，可以有效对玉米样品中转基因玉 ０ 。
基因作物品系的定量检测技术建立显得日 益重要。 米Ｂ１ 含量进行检测。 ｔ７ ６
转化体 特异检测方法 ｖ ｔ ｅｆ） 于检测外 伪 即一ｃｉ 由 Ｐ ｃ ｓ ｉ 源基 因末端（ 或３与玉米基因组Ｄ Ａ相接区伽ｔ ａ １材料与方法 ’ ５ 〕 Ｎ ｅ． ｒ ｇ 石 ｉ） 的ｓ 而表现强的特异性， 前多个作物转基因转 Ｌｌ材料 ｔ ｅ 目 化体都建立相应检测方法 （ｅ ｌ ｄ ｌＪ ｓ ｌ Ｂｒ ａ Ｈｓ ｅ ａ ｄ Ｏｏ ｔ 一 ｎ ｎ ｅ
ｗ 腼ｎｓ Ｄ，Ｔ ｎ ｉｙ ｎ ｉ 。 ｇ ｅｇ ｉ Ｌ ｂ ａｅ ｕ Ｘａ ￣
玫石 ｓ ｄ １比 ｊ ｓ ｔ目 ｅ邺 ， Ｎ ８ 甥 ｅ ｎ “ ． ｎ ｔｉ Ｉ 又 １ 】 司人 五 ５ ｏ ａ ｏ Ｂ 以８
＊ 介 ５ｍ ｉ 翻山 俐 口 恤侧２ ａｏ‘ 二 Ｃ 详 ｄ 色 份， 臼 】 ｂ 叨口 ｎ ＠岁
分子植物育种，０７ 第 ５ 第 ５ 第７ 刁１ 页 ２ 年， 卷， 期， １ ９ ５ Ｍｏ 】 Ｐ 仑 ｄ ｇ２０， ０５Ｎ 万 ７５７９ 】 ａ 】 吠 ｉ ， ７ｖ Ｉ， ｏ ，１一１ “ｕ ｒ 朋ｔ ｎ ０ 一
新思路、 新技术、 新方法 ｏｅ Ｔ ｎＯ Ｎ ｖ１ ｉ ｉ ＆Ｔ ｈＯ ｇ ｈ ｋ９ ｅ Ｉ ｃ ｏ ｎ ｙ
玉米样品中转基因玉米 Ｂ１ 含量检测 ｔ７ ６
吴明生， 田雷 云晓敏 贾希海 律宝春
北京市 种子管理 北京，侧〕 站 １洲 吕 １８
． 通讯作者， 曲 以２钾 的加口血 二 交） 曲 返 ．
摘 要 根据其检测特异性， 转基因产品检测技术可分为筛选、 基因、 构建和转化体特异性检测四 类。 于转 由 化体特异性检测方法的具有高度特异性， 前， 目 一些发达国家对于转基因产品 检测方法正逐步过渡到转化体 特异性序列的检测方法。 本研究针对转基因玉米Ｂｌ 的外源基因３端与玉米基因 ｔ７ ６ ， 组Ｄ Ａ相接区序列设 Ｎ 计具有转化体特异性的引物和荧光探针。利用实时荧光定量Ｐ Ｒ 以已 ｔｌ 含量样品为标准样品建立 ｃ ， 知Ｂ ７ ６ 内 外源基因 标准曲 利用该标准曲 线， 线对多个玉米样品Ｂ１ 玉米成分含量进行检测， ｔ７ ６ 结果显示该方法检测
ｔ７ Ｂ１ 玉米含 ６ 量为５％ｗ 哟 阴 ． （八 。 性玉米 。 样品由 本实 Ｉ ； ５℃２ ５ ｎ ｌ 变性９ ０ ， ０℃Ｉ ， 个循环。 退火６ ｎ ０ ｌ ４
验室收集。
２结果与分析
． ２１标准 曲线建立
１ 生化试荆 ． ２ Ｄ Ａ提取试剂盒购自 Ｎ 香港基因晶片有限公司，
利用Ｄ Ａ提取试剂盒提取含量为５ ｔｌ Ｎ ％的Ｂ７ ６ Ｎ， ｒ ｅ 玩购自 应用生物系统公司 （ｐｌ Ｂ ｓ－ 转基因玉米样品的Ｄ Ａ 通过四倍稀释制备五个玉 ｔＭ 美国 Ａｐｅｉ ｙ ｉ ｏ ｄ ０ Ｌ２ ０ ５ ｔｎ， Ｄ 其余试剂由 Ｏｓ Ｂ Ａ 。 上海生物工程有限公司提供。 米总基因组浓度分别为 ８ 侧卜 、 喇汕、
名ｅｊ 几
Ｑ 平均值
ｔ Ｃ ｍｅ ．ａＵ 叨 Ｖ 】ｅ
２ 名７ ３ ６ ２ 名５
标准偏差
Ｓ Ｄ
变异系数
Ｃ ％） Ｖ（
结 准 检测 性 Ｂ１ 玉 检 极限 度达 ．１ Ｌ同 方法 作 单， 合 基因 果 确， 特异 强， ７ 米 测 浓 到０ 帽林 。 时该 操 简 适 转 样品 ｔ６ ０
大批量检测。 关键词 转基因玉米， １ ，ｅ ｌ ｅ Ｒ 定量检测 ｔ６ Ｂ ７ Ｒａ ｌ ． ， ｌｍ Ｐ Ｃ
ｕ ｎ ｔ ｖ ｅ ｃｏ ｏＧ ｅ ｉ ｌ Ｍｏｉ ｄ ｔ Ｍａ Ｑ ａ ｉ ｉ Ｄ ｔ ｔｎ ｆ ｎｔａｙ ｄ ｅ Ｂ１６ ｉ ｅ ｔ ａ ｅ ｅ ｉ ｅ ｃｌ ｉ ｆ ７ ｚ
实时荧光Ｐ Ｒ扩增采用Ａ Ｉ Ｃ Ｂ 公司提供的试剂
Ｂ ｌ６ １ ｘ ｔ７ ％二 创 】 ０ ％． 公伙１０
川 ０Ｌ。扩增程序采用两步法： ｍ Ｆ） 预变性 ９ ℃ １ 个， ５ ０ 含量分别为。 ％、 ０％ ． ０ 和众 ％， ５ ２ ． ５ １ ０ 另外两个分
表 １转基因玉米Ｂ１ 标准样品Ｃ 值分析表 ｔ７ ６ ｔ
Ｔ 肠Ｉ ｖｌ ｂ ｔ ａ Ｃ ａ此助司ｓ ｏＢｌ６ ｄｒ即 ｌ ｙｓ ｔ 咖 ａ 的 ｌ ｊ ｆ ７ ｄ ｐ ｓ ｅ
样品编号 细 们ｌＮ ｐ Ｏ ｅ
ｌ
样品 浓度（ 基因组刀 ２林 ） 留 ５Ｌ
Ｇｅ ｏ ｎ ｍｅＣ ０ ｅ 七 ｔ ｎ ０ Ｃ口 书ｉ ｏ
１飞 ． 色 １ 月 ，
检测基因
Ｔ ｇ吸． 公 ｅ９此