溶血素制备

实验课要求
预习 不迟到、早退、不旷课、有事请假 穿白大褂、注意自我防护 不喧哗，不做与实验无关的事 不要急于开始做实验 不要急于写实验报告 实验完成后，自己把桌面收拾干净 值日要求：擦桌子，拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗
（劳动委员负责安排和监督） 认真完成实验报告
实验报告的要求
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、核酸
2.免疫动物的选择
（1）抗原与动物种属的关系：亲缘关系 （2）动物的个体状况：适龄、健康、体重 （3）抗原的性质：家兔对胰岛素不易产生抗体 （4）免疫血清用量和要求：大和小，R型和H型
3.免疫方法
（1）免疫原的剂量 （2）免疫间隔时间 （3）免疫途径
免疫耐受 抗体产生的规律 吸收和代谢速度
溶血素的制备
实验原理
将一定浓度的绵羊红细胞（SBRC）经一定 的方式注入动物体内，一段时间后，动物 血清中可出现特异性的抗绵羊红细胞抗体 （溶血素），该过程称为溶血素的制备。
主要的实验试剂和器材
离心机 离心管（无菌、回收）、玻璃滴管（无菌、回
收）、一次性注射器 生理盐水、酒精棉球 兔子、绵羊血
免疫途径 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉 耳缘静脉
SRBC浓度 10％ 15％ 20％ 25％ 30％
注射量 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml
注：第1次免疫之后做好标记，放到自己班级的笼中 第2-5次免疫用的SRBC悬液由实验准备老师替大家准备
时间安排
日期 9月18日 9月21日 9月24日 9月28日 9月30日 10月23日
溶血素的鉴定
鉴定效价 实验方法：直接凝集实验
直接凝集实验
--试管法
实验原理
在一定的电解质条件下，将已知的颗粒性抗原定量地与一 系列倍比稀释的待测血清等量混合，静置一定的时间后， 根据各管的凝集程度，判断待测血清的抗体效价。
此方法常用于抗体的半定量检测。
主要试剂与器材
待检血清 1％ SRBC 生理盐水 37℃水浴箱 加样枪 试管
为抗体（溶血素）效价。
结论
如：本次实验制备的溶血素效价为1:160。
注意事项
家兔性情温顺，不会咬人；但其容易受噪音影响，变得烦 躁，所以在免疫动物时，安静有利于实验。
兔子受到惊吓或烦躁不安而难以固定，抚摸兔子背部的皮 毛可以稳定其情绪。
制备免疫原和免疫动物时注意无菌操作。 心脏采血时，注射器不能刺入太深，也不能在心脏中左右
制备高效价特异性免疫血清是免疫学基本技术之一。 免疫血清的质量受多种因素影响，如免疫原、动物的种类、
接种途径和实验流程。
免疫血清制备的流程
制备免疫原
选择免疫动物
选择免疫方法
免疫血清的纯化
动物采血
免疫血清的鉴定
免疫血清的保存
1.免疫原的制备
--颗粒性免疫原的制备
绵羊红细胞、细菌
--可溶性免疫原的制备
题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果（现象）、结 论、注意事项、讨论（心得体会）
班级、姓名、学号 由学习委员统一收齐，按学号从小到大顺序放好，在下一
周上课时交 自己写、书写整齐 订成一本或每次分开
免疫血清的制备
前言
将适当的免疫原性物质经过一定方式注入动物体内，一段 时间后，动物血清中可出现特异性抗体，该过程称为免疫 血清的制备，这种含抗体的血清称为免疫血清或抗血清。
注：本次实验6人/组
实验步骤
制备免疫原 绵羊血3ml + 生理盐水3ml → 离心 2000rpm×5min → 弃上清（用玻璃滴管 吸，吸完后重新放回卷纸中） → 重复洗 涤两次 →按压积用生理盐水配成10％ SRBC悬液（注意无菌操作!）
免疫动物
时间 第一天 第三天 第五天 第七天 第九天
4.动物采血法
（1）颈动脉放血法 （2）静脉采血法 （3）心脏采血法
注：采血前，要预先测定抗体效价，若达到要求，应在末次 免疫后一周及时采血，否则效价会下降。
5.免疫血清的纯化
去除非特异性抗体和其它血清成分
7.抗血清的鉴定
效价、特异性、纯度、亲和力
8.抗血清的保存
①4℃保存：3个月或半年 ②冷冻保存：-20℃～-70℃、2～3年 ③真空干燥保存：4～5年
星期 五 一 四 一 三 五
免疫次数 1 2 3 4 5
采血
心脏采血 末次注射七天后采血。
将兔子仰卧位固定，用手摸出心跳最快的位点，用20ml 的注射器刺入心脏，回抽注射器，看有无血抽出。若无 血，则将注射器前进或后推一点，再回抽。将抽出的血 液放入有玻璃珠的50ml离心管中，37℃水浴20～ 30min，离心2500rpm*10min，收集血清，放-20℃ 保存。
实验步骤
将血清放在65℃×5min（灭活补体）。 取试管9只，排列于试管架上，依次编号。 按表格稀释血清和加样（ul）。
80 320
各管摇匀后置37℃×10min，离心500rpm×2-3min，观察 结果。
结果观察和判断
先看对照管，轻摇动，应为不凝集，红细胞均匀的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ散在 液体中。
再看实验管，轻摇动，在稍微静置一会儿。 ++++ 液体澄清，全部的絮状碎片沉于管底 +++ 液体轻度混浊，绝大多数絮状碎片沉于管底 ++ 液体半混浊，约半数絮状碎片沉于管底 + 液体混浊，仅少数细小的絮状碎片沉于管底 - 表现与对照管相同 结果判断：能产生明显凝集现象(++）的最高血清稀释度
1、电镜技术（示教） 2、免疫血清的制备 3、动物的致敏免疫接种 鸡胚接种（电教） 4、流式细胞术（示教） 5、单个核细胞分离及E花形成试验,淋转试验（6学时，周六）（显微镜） 6、动物实验性过敏反应观察及其动物采血 7、免疫球蛋白的纯化 8、IgG效价的测定（免疫扩散） 9、T细胞亚群测定，激光共聚焦显微镜技术（示教） 10、石蜡切片与酶细胞化学（显微镜） 11、酶联免疫吸附试验 12、凝聚试验 吞噬实验 13、斑点免疫渗虑试验免疫层析试验 14、放射免疫分析技术 15、免疫荧光标记技术
滑动针头，否则心脏戳穿而难以抽血。