粗蛋白影响因素

1 粗蛋白的测定：试剂的配制粗蛋白测定中所用的化学药品如浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、硼酸、硫酸铜、硫酸钾（硫酸钠）、硫酸铵、蔗糖等均为化学纯试剂，标定盐酸标准溶液用的无水碳酸钠为基准试剂。在配制试剂前一定要用p H 试纸或酸度计检测一下蒸馏水是否为中性，所用的烧杯、试剂瓶等配液设备清洗干净。

1.1 盐酸标准溶液的配制

配制的盐酸标准溶液尽量为低浓度，一般C（HCI）=0.02?0.05mol ? L -1。低

浓度虽然用量大，但可减少操作误差和读数误差。配制盐酸标准溶液一定要严格按照标准操作进行，基准无水碳酸钠已定于270?300C灼烧至恒重，称准至

0.0001g，做4?6个平行样，去掉最高值和最低值后取平均值，同时还要做空白试验。

盐酸标准溶液的配制量尽量不要太多、使用时间太长，防止水分蒸发和盐酸挥发而影响其浓度的准确性。

1.2 其他试剂的配制

400g ? L -1 氢氧化钠溶液、20g ? L -1 硼酸溶液、混合指示剂（1g ?L -1 甲基红乙醇溶液与5g ? L -1 溴甲酚绿乙醇溶液等体积混合）等主要是在称量时要做到快、准、稳，再就是防止使用时间太长，特别是混合指示剂不要超过3 个月。

2 粗蛋白的测定：试样的选取和制备

2.1 采样饲料原料及产品的容积和质量往往很大，因此所采集的样品必须具有代表性，否则，即使一系列的分析工作非常精密、准确，其意义都不大，有时甚至会得出错误的结论，所以应采用正确的采样方法。采样应从具不同代表性的区域取几个样点，然后充分混合为整个饲料的代表样品，然后再从中分出一小部分作为分析样品。在采样过程中应做到随即、客观，避免受人为和主观因素的影响。还有一点应该注意，就是所采集的样品必须具有一定数量。其采集数量的多少应视饲料原料和产品水分含量、颗粒大小、均匀程度以及平行样的数量而酌情定夺。

2.2 分样

所采集的样品往往较多，而检测时所用试样往往较少，因此要对所采集的样品进行缩分。在多数饲料公司以及检测机构中一般采用方便简单的四分法。有条件的单位可采用分样器进行分样。

2.3 粉样

饲料的样品一般为颗粒状，所以要对所分得的试样进行粉碎。粉碎所用的设备一般为咖啡磨或植物样本粉碎机，试样粉碎后一般过40 目筛，且一定要把粉碎后的试样及粉碎机中残留的部分清扫后充分混合均匀，避免粉碎的试样分级而影响分析结果的准确性。对于一些不易粉碎的粗饲料如秸秆渣等在粉碎机中会剩留极少难以通过筛孔，这部分一定不要丢掉，应尽力弄碎后一并均匀混入样品中，避免引起分析误差。

2.4 称样试样的用量标准中规定为0.5?1g，为保证分析结果的准确性，在分析过程中

应根据试样蛋白质含量的高低来决定所称试样的重量，如浓缩料、鱼粉、玉米蛋白粉、豆

粕等高蛋白的试样可控制在0.5 ?1g 之间，玉米、秸秆、苜蓿等低蛋白、粗饲料试样可适当增加到2 ?3g 左右，以增加测定结果的准确性。还应注意一点，在称量时尽量用电子分析天平，准确到0.0001g 且无损地放入凯氏烧瓶或者消化管中。

3 粗蛋白的测定：消化

3.1 催化剂及其用量在环境污染小、价格便宜、催化效果好的前提下，目前催化剂多为硫酸铜和无水硫酸钾（或无水硫酸钠）。其添加量不同公司差异较大，其中硫酸铜: 无水硫酸钾（或无水硫酸钠）主要有1 : 9、1 ：10、1 : 15和1 : 17等，国标为0.4g硫酸铜和6g无水硫酸钾（或无水硫酸钠），比例为1 ：12。若添加量加大，消化液易结块不易转移；添加量减少，消化时间加长或者消化不完全。建议大家按国标执行为好。亦可根据自己的经验以及试样的多少、消化的难易程度、蛋白含量的多少自行调整。

3.2 硫酸的用量浓硫酸的用量应视试样的重量、含水量及其所含蛋白高低而适当调整。

对于体积大重量轻的粗饲料、高蛋白饲料或者含水量较高的试样、淀粉含量多的精料, 应适当加大浓硫酸的用量，多为15mL 左右。这是由于此类样品，浓硫酸在对其脱水和碳化是消耗量加大，当加入的浓硫酸量不足或者刚刚够试样脱水和碳化时就会出现烧干现象。反之则需加入10mL 左右。若通风柜的排风量较大时应适当多加浓硫酸2mL 左右，以防止浓硫酸的蒸发而使其浓度降低，试样消化不完全从而导致所测得的数值偏低。

3.3 消化温度刚开始时以低温（200?300C ）加热，待试样焦化泡沫消失后，逐步缓慢提高温度（360?410C ）。起初低温加热是为防止试样起泡沫，而溢出烧瓶外或碳化后的颗粒粘附于烧瓶壁，导致消化不完全，所测结果偏低。对于富含脂肪或者在消化过程中易发泡的样品，可在消化前滴加少量消泡剂，如辛醇、液体石蜡等。

3.4 消化时间消化时间也是许多文献一直在探讨的问题，也有许多快速消化法的研究。其消化时间的标准为消化呈透明蓝绿色后，再加热消化15mi n。根据苏军等研究表明，消化液澄清后再继续消化30min 为宜。此试验只是针对于蛋白含量低于蚕蛹的样品，而对于蛋白含量高于蚕蛹的样品，如进口鱼粉、血粉、羽毛粉等并未进行试验性研究。因此我个人认为，可根据试样的重量、蛋白含量的多少以及消化的难易程度而适当调整消化液澄清后的消化时间。对于所称试样质量较多、蛋白含量高于蚕蛹或者难消化的试样，消化液澄清后继续消化的时间可控制在45m i n?2h不等，具体时间化验工作者可根据自己的工作经验而自行定夺。

3.5 消化液的转移及定容消化结束后，把凯氏烧瓶从电炉上取下，放在小铁筐内冷却。此时一定要注意安全，带稍厚手套防止烫伤。冷却至室温后加入蒸馏水10?20m L,在等冷却至室温后转移到100m L 容量瓶内。再转移是为减少损失误差，应在容量瓶口上加

上漏斗，且要用少量蒸馏水多次洗涤烧瓶和漏斗（即采用少量多次原则），否则会因偶然误差而导致测定结果偏低。转移完成后不要立即定容，应冷却至室温后再定容。若未冷却而定容，待冷却后，体积缩小，从而使吸取的试样分解液的量偏大，测定结果将偏高。若消化完毕冷却后，消化液不能当天定容需隔夜保存时，应先将凯氏烧瓶内加入少量的蒸馏水，防止消化液结晶，再把凯氏烧瓶口用塑料布包好，防止吸收空气中的氨而影响结果的准确性。消化液若结晶不易转移时，可将凯氏烧瓶放在电炉上加热一下，待结晶融化后再转移。

4 粗蛋白的测定：蒸馏

4.1 蒸汽发生器内水的体积及酸碱性

蒸汽发生器内的水的体积应控制在其容积的2/3 左右，并控制液面高度。水的体积过大易在沸腾后从蒸汽发生器中玻璃管中溢出烫伤工作人员；过少易产生的气体压力不足或蒸干蒸汽发生器发生事故。水加入的同时一同加入几滴硫酸和几滴混合指示剂，且保持水一直呈紫红色，以防止水中含有氨态的氮溢出而影响测定值。

4.2 蒸馏装置的气密性在蒸馏操作开始前一定要检查一下蒸馏装置的气密性。各导管的接口及用久的橡皮管应重点检查。添加消化液和碱液的玻杯口要拧紧、液封，防止产生的氨气逸出。在检查气密性的同时还应打开冷凝水开关且要保持一定的流速，否则冷却不完全。这是很容易忽视的问题，特别是初学者。

4.3 试样分解液的移取要准确在移取试样分解液前先把容量瓶摇匀,把10mL 移液管用所要取的试样分解液润洗2 ?3 次后，再进行移取。移取时移液管应垂直于地面，视线与移液管刻度线平行。吸取完试样液后把移液管放到反应室内自然流入反应室，切忌把移液管放到小玻杯内及用吸耳球吹移液管。最后再用少量蒸馏水冲洗一下小玻杯，并把棒状玻塞塞紧。

4.4 氢氧化钠溶液的加入量

在蒸馏过程中，反应室内溶液应保持碱性，碱的加入量一般为10m L 左右，若

在消化时所加入的硫酸偏多，40% 氢氧化钠溶液的量也要随之增加，这样才能保证除用于和硫酸及硫酸铜反应外，还有足以使氨根转化为氨的碱量。加入的碱先放入小玻杯内，慢慢转动棒状玻塞，使碱缓慢流到反应室内，然后再将小玻杯内加入蒸馏水液封，切忌把棒状玻塞提起加碱—特别是初学者，这样会造成反应后生成的氨从玻口逸出，导致所测蛋白含量偏低。

4.5 蒸馏速度与气流蒸馏时产生的气流一定要均匀，切忌热力不稳、中途中断或蒸汽不足，否则反应室内温度会降低，易产生倒吸；气流过快硼酸吸收不完全。蒸馏的速度除与气流有关外还与冷却水的流速及电路的温度有关。蒸馏速度快，反应液易被蒸汽带出而使测定结果偏高；蒸馏速度慢，氨没有被完全蒸馏出来而结果偏低。那么以什么样的蒸馏速度为宜呢？据贾艳玲和冷柏忠(2000) 实践证明：蒸馏速度一般应控制在每分钟蒸馏出液体在5?7mL之间。

4.6 蒸馏时间蒸馏时间多为5m i n ，加入试样分解液及氢氧化钠后蒸馏4m i n , 使冷凝管末端离开硼酸液面后再蒸馏1m i n 。但是标准中并未规定从何时开始计时，据谢文飞(2003) 的试验证明，在蒸馏完4m i n 钟后再多蒸馏1 ?2mi n 对结果没有什么影响，所以可以从硼酸刚刚出现绿色时开始计时蒸馏4min( 硼酸出现绿色说明反映已经开始)。最终在4min 后是否蒸馏完全可用pH 试纸进行检测。在蒸馏时还应注意硼酸的吸收温度。硼酸是极弱的酸，只起吸收氨的作用，但要注意硼酸吸收液温度不应超过40C，否则氨的吸收减弱导致结果偏低。

4.7 反应室的冷却与洗涤首先在蒸馏完毕，将冷凝管末端用蒸馏水冲洗后，再将锥形瓶

移开进行滴定。清洗反应室时严禁将蒸馏瓶两侧的阀门同时关闭，以免发生爆炸。反应室清洗一定要彻底，一是防止残留液影响下次测定结果的正确性；二是给反应室降温。如果反应室温度很高，再加之加入的氢氧化钠与硫酸反应放出的大量热，易产生爆沸，

将反应液冲入冷凝管，造成实验失败。另外反应室温度高，反应剧烈，有部分氨硼酸吸收不完全而逸出，测得的结果将偏低。一般反应室温度降至不烫手即可。

4.8 锥形瓶的预处理锥形瓶往往用洗衣粉洗涤，再用自来水、蒸馏水冲洗。洗衣粉不易彻底冲洗干净，导致锥形瓶内壁环境偏于碱性；另外各地自来水的p H 不同，所制的蒸馏水p H

有时也会偏离中性，这样都会导致测定结果出现偏差。建议把锥形瓶进行预处理后再使用，其方法为：冲洗干净的锥形瓶加入20mL 蒸馏水、2 滴混合指示剂，再用

0.02mol ?L -1 的盐酸溶液或者0.02m o l ? L -1 的氢氧化钠溶液滴定至刚好由蓝色变为灰红色，然后倒掉该液体后，再加硼酸吸收液25?35m L和

混合指示剂2?3滴。若加入指示剂后硼酸为蓝色，则说明硼酸中混入碱性物质或蒸馏水偏碱性，需重新配制硼酸溶液。锥形瓶的预处理虽然比较繁琐，但是可减少由于锥形瓶本身环境的p H 偏离中性对测定结果的影响。

4.9 滴定滴定是整个实验过程的最后一步，至关重要，否则整个实验将前功尽弃。滴定前把盐酸标液瓶摇匀后，把酸式滴定管润洗2 ?3 次后加入盐酸标液排除气泡，记下刻度值，开始滴定。滴定时一定要控制好滴定速度，待接收液由浅绿色逐渐变成无色时要放慢滴定速度，逐滴加入盐酸标液，接收液变成浅红色时为滴定终点，切勿滴过量。

5 粗蛋白的测定：空白测定

5.1 试剂空白测定另取凯氏烧瓶或者消化管一个，加入硫酸铜、无水硫酸钾（或无水硫酸钠）、浓硫酸，其中每个药品的加入量与试样消化时的加入量相同，加热消化至溶液呈透明的蓝绿色。其后的操作步骤完全相同。这样可以校正试剂不纯所发生的误差。

5.2 试样空白测定称取0.5g 分析纯蔗糖代替试样，以后各种试剂的用量及操作步骤完全相同。其标准为，空白测定消耗0.1m o l ? L -1盐酸标液体积不超过0.2mL;消耗

0.02mol ?L-1盐酸标液体积不超过0.3mL。以上两个空白测定并不需要每次都要做，隔一段时间操作一次即可，但是在更换药品试剂、标准溶液时一定要做空白实验测定。若空白值超标，一般是由于所用试剂级别不够或不纯、蒸馏水不纯、玻璃器皿清洗不干净等原因造成。

6 粗蛋白的测定：蒸馏装置及操作准确性检测

在进行样品检测的同时，精确称取0.2000g 分析纯的硫酸铵代替试样，直接定容100m L 后进行蒸馏、滴定，测得硫酸铵含氮量为21.19% ±0.2%，以校正蒸馏装置的气密性和加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。

7粗蛋白的测定：计算时换算系数的处理

我们在计算蛋白含量时多乘以平均系数6.25，对于粗蛋白质中含氮量尚未确定的可以乘以

平均系数，对于已经确定的则不妥，以豆粕为例：如果测定豆粕和以豆粕为主要原料的浓缩饲料的粗蛋白质含量时，用6.25 作为蛋白质的换算系数的话，比大豆的实际换算系数5.70 扩大了0.54 倍，相对误差将在8% 左右，因

此对于已经确定的换算系数就用实际系数来换算，例如荞麦、玉米用系数 6.00 ，大豆、豌豆、蚕豆、燕麦、小麦、黑麦、箭舌草等用系数5.70 ，黄豆用系数5.71 ，大麦用系数5.83 ，棉籽、芝麻、葵花籽用系数5.30 ，花生用系数5.46 ，全脂大豆粉用系数5.72 ，牛奶用系数6.38 。以上是用凯氏定氮法测定饲料中蛋白质含量的一些体会、经验，与大家共同探讨。