NEB常用酶介绍
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室温连接反应 为方便起见，连接反应可以在室温（20-25 ℃）条件下进行。粘性末端连接：在 20 μl 反应体系中加入 1 μl T4 DNA 连接酶，反应 10 分钟。平齐末端连接：在 20 μl 反应体系中加入 1 μl T4 DNA 连接酶反应 2 小时，或者加入 1 μl 高浓度 T4 DNA 连接酶反应 10 分钟。 另外，NEB 快速连接试剂盒 [NEB #M2200S（30 次反应），或 NEB #M2200L（150 次反应）] 可在 室温下 5 分钟内完成平齐和粘性末端的连接。
注意事项
与 E. coli DNA 连接酶需要 NAD+ 作辅因子不同，T4 DNA 连接酶的辅因子是 ATP。
稀释后的 T4 DNA 连接酶应于 -20℃、50% 甘油贮存缓冲液（稀释缓冲液 A，NEB #B8001）中保 存。如稀释后马上使用，也可用 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液稀释。
NcoI
识别位点
在不同反应缓冲液的活性 NEBuffer 1NEBuffer 3.1: 100% CutSmart Buffer: 100%
特性 重组酶、省时酶。
反应条件 NEBuffer 3.1，37℃。 热失活：80℃ 20 分钟。
浓度 10,000 和 50,000 units/ml。
甲基化敏感性 对 dam、dcm 和哺乳动物 CpG 甲基化均不敏感。
NotI
识别位点
在不同反应缓冲液的活性 NEBuffer 1.1: <10% NEBuffer 2.1: 50% NEBuffer 3.1: 100% CutSmart Buffer: 25% 特性 重组酶、省时酶。 反应条件 NEBuffer 3.1，37℃。 热失活：65℃ 20 分钟。 浓度 10,000 和 50,000 units/ml。 甲基化敏感性 对哺乳动物基因组 DNA CpG 甲基化敏感。 注意事项 彻底消化超螺旋质粒需要的 NotI 酶量为消化线性 DNA 的 5 倍。
T4 DNA 连接酶
特性
■ 高效连接粘性末端和平末端 ■ T/A 克隆 ■ 概述
该酶催化双链 DNA 或 RNA 上相邻的 5´-磷酸末端和 3´-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化 平齐末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交双链中的单链切刻。
只要在反应体系中补加 1 mM ATP，连接反应就可以在 NEB 提供的四种限制性内切酶缓冲液或在 T4 DNA 多聚核苷酸激酶反应缓冲液中进行。
参考文献 (1) Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982). In P.D. Boyer (Ed.), The Enzymes , Vol. 5, (p. 3). San Diego: Academic Press. (2) Remaut, E., Tsao, H. and Fiers, W., (1983) Gene , 22,103–113. (3) Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual , (2nd ed.), (pp.1.53–1.73). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
DpnI
识别位点
在不同反应缓冲液的活性 NEBuffer 1.1: 100% NEBuffer 2.1: 100% NEBuffer 3.1: 75% CutSmart Buffer: 100% 来源 重组 E. coli 菌株，包含有从 Diplococcus pneumoniae G41 (cks) 克隆的 DpnI 基因。 特性 CutSmart、重组酶、省时酶。 连接和再切 经过 DpnI 20 倍过量消化，大约 25% 的 DNA 片段能被连接，连接片段中 > 95% 能被再切。 反应条件 CutSmart 缓冲液，37℃。 热失活：80℃ 20 分钟。 浓度 20,000 units/ml。【通过 pBR322 DNA（dam 甲基化后）鉴定】。 甲基化敏感性 只有当识别位点被甲基化时，DpnI 才能切割。从 dam+ 菌株纯化而来的 DNA 才是 DpnI 切割的底 物。对哺乳动物基因组 DNA CpG 甲基化敏感。
单位定义（粘性末端活性单位） 1 单位指在 20 μl 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，16℃ 反应条件下，30 分钟能使 50% 的经 Hin dⅢ 消化的 λDNA 片段 [ 5´ 端浓度为 0.12 μM（300 μg/ml）] 连接所需的酶量。
浓度
400,000 units/ml 和 2,000,000 units/ml。
来源
纯化自 E. coli C600 pcl857 pPLc28 lig8。
反应条件
1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液 [50 mM Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃），10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP]。推荐 DNA 5´ 末端浓度为 0.1-1.0 μM，16℃ 温育。 热失活：65℃ 10 分钟。
注意事项
与 E. coli DNA 连接酶需要 NAD+ 作辅因子不同，T4 DNA 连接酶的辅因子是 ATP。
稀释后的 T4 DNA 连接酶应于 -20℃、50% 甘油贮存缓冲液（稀释缓冲液 A，NEB #B8001）中保 存。如稀释后马上使用，也可用 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液稀释。
NcoI
识别位点
在不同反应缓冲液的活性 NEBuffer 1NEBuffer 3.1: 100% CutSmart Buffer: 100%
特性 重组酶、省时酶。
反应条件 NEBuffer 3.1，37℃。 热失活：80℃ 20 分钟。
浓度 10,000 和 50,000 units/ml。
甲基化敏感性 对 dam、dcm 和哺乳动物 CpG 甲基化均不敏感。
NotI
识别位点
在不同反应缓冲液的活性 NEBuffer 1.1: <10% NEBuffer 2.1: 50% NEBuffer 3.1: 100% CutSmart Buffer: 25% 特性 重组酶、省时酶。 反应条件 NEBuffer 3.1，37℃。 热失活：65℃ 20 分钟。 浓度 10,000 和 50,000 units/ml。 甲基化敏感性 对哺乳动物基因组 DNA CpG 甲基化敏感。 注意事项 彻底消化超螺旋质粒需要的 NotI 酶量为消化线性 DNA 的 5 倍。
T4 DNA 连接酶
特性
■ 高效连接粘性末端和平末端 ■ T/A 克隆 ■ 概述
该酶催化双链 DNA 或 RNA 上相邻的 5´-磷酸末端和 3´-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化 平齐末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交双链中的单链切刻。
只要在反应体系中补加 1 mM ATP，连接反应就可以在 NEB 提供的四种限制性内切酶缓冲液或在 T4 DNA 多聚核苷酸激酶反应缓冲液中进行。
参考文献 (1) Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982). In P.D. Boyer (Ed.), The Enzymes , Vol. 5, (p. 3). San Diego: Academic Press. (2) Remaut, E., Tsao, H. and Fiers, W., (1983) Gene , 22,103–113. (3) Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual , (2nd ed.), (pp.1.53–1.73). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
DpnI
识别位点
在不同反应缓冲液的活性 NEBuffer 1.1: 100% NEBuffer 2.1: 100% NEBuffer 3.1: 75% CutSmart Buffer: 100% 来源 重组 E. coli 菌株，包含有从 Diplococcus pneumoniae G41 (cks) 克隆的 DpnI 基因。 特性 CutSmart、重组酶、省时酶。 连接和再切 经过 DpnI 20 倍过量消化，大约 25% 的 DNA 片段能被连接，连接片段中 > 95% 能被再切。 反应条件 CutSmart 缓冲液，37℃。 热失活：80℃ 20 分钟。 浓度 20,000 units/ml。【通过 pBR322 DNA（dam 甲基化后）鉴定】。 甲基化敏感性 只有当识别位点被甲基化时，DpnI 才能切割。从 dam+ 菌株纯化而来的 DNA 才是 DpnI 切割的底 物。对哺乳动物基因组 DNA CpG 甲基化敏感。
单位定义（粘性末端活性单位） 1 单位指在 20 μl 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，16℃ 反应条件下，30 分钟能使 50% 的经 Hin dⅢ 消化的 λDNA 片段 [ 5´ 端浓度为 0.12 μM（300 μg/ml）] 连接所需的酶量。
浓度
400,000 units/ml 和 2,000,000 units/ml。
来源
纯化自 E. coli C600 pcl857 pPLc28 lig8。
反应条件
1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液 [50 mM Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃），10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP]。推荐 DNA 5´ 末端浓度为 0.1-1.0 μM，16℃ 温育。 热失活：65℃ 10 分钟。