生物技术导论简答与名词解释

名词解释：

克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。

回文结构：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。

选择标记基因：简称选择基因，是指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具备的新的遗传特性，从而使得人们能够使用特定的选择培养基，将转化的新细胞从亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因．

基因探针：是一段与目的基因互补的核酸序列，可以是ＤＮＡ，也可以是ＲＮＡ，用它与待测样品ＤＮＡ或ＲＮＡ进行核酸分子杂交，可以判断两者的同源程度．

Dot印迹杂交：将待测ＤＮＡ或ＲＮＡ的细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上，不需要限制性酶进行酶切，既可与探针进行杂交反应．

cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。

基因组文库:把某种生物的基因组DNA 切成适当大小，分别与载体结合，导入宿主细胞，形成克隆。汇集这些克隆，应包含基因组中的各种DNA顺序，每种顺序至少有一份代表。这样的克隆片段的总汇，叫基因组文库。

固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶.

非水酶学：通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的，研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学.

交联型固定化酶：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。

发酵工程：采用现代工程技术手段, 利用微生物的某些特定功能, 为人类生产有用的产品的一种新技术。

蛋白质工程：就是以蛋白质的结构与功能为基础，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。

细胞工程：应用细胞生物学和分子生物学的理论、方法和技术，按人的设计，有计划地大规模培养组织或细胞以获得生物产品，或改变细胞的遗传物质以产生新的物种或品系。

细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程

愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。

贴壁细胞传代培养：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。

抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。

细胞拆合：是指以一定的实验技术从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器．

染色体转移：把同特定基因表达有关的染色体或染色体片段转入受体细胞，使该基因得以表达．

简答：

1.目的基因的提取方法有那些？具体说明其原理？

目的基因的提取方法

直接分离基因：鸟枪法

人工合成基因：反转录法、根据已知的氨基酸序列合成DNA

鸟枪法（散弹射击法）：

用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定的方法将目的基因的DNA 片段分离出来。

反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。

根据已知的氨基酸序列合成DNA法：

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。

2. 理想质粒载体的必备条件？

⑴具有较小的分子质量和较高的拷贝数。

⑵具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点。

⑶具有两种以上的选择标记基因。

⑷缺失mob基因。

⑸插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并自制和表达。

3.用基因工程的方法,使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白,想一想,应如何进行设计

1 首先,选择具有合适启动子的、多克隆位点有合适酶切位点的、具有选择性标记（如抗性标记）的大肠杆菌质粒载体；

2 测定鼠β-珠蛋白的基因序列，并依此设计带有质粒相应酶切位点的引物；提取鼠DNA,

以此为底物，PCR方法进行体外基因克隆,纯化待用。

3 制备大肠杆菌感受态细胞备用。

4 提取质粒DNA，纯化，待用。

5 将质粒和克隆所得基因用限制性内切酶切割，并用连接酶连接。

6 用连接液和感受态细胞混合，用连接质粒转化大肠杆菌。

7 在合适的抗性标记培养基上筛选转化细胞。

8 传代验证其稳定性后，鉴定为质粒重组阳性者，便可用于进行生产鼠的β-珠蛋白。

4.ＤＮＡ序列测定方法有哪些。自己给出一段目的基因，采用一种方法把它测定出来，步骤详细？

目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。

不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下：

1、制备待测DNA序列模板；

2、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（n=1）；

3、PAGE；

4、读序。

一、双脱氧末端终止法测序

㈠原理

双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP），可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP 形成3′,5′-磷酸二酯键。因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样，在4组独立的酶反应体系中，在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。双脱氧链终止法测序原理如图所示。

双脱氧链终止法测序原理

二、Maxam-Gilbert化学降解法测序

几乎在双脱氧法发展的同时，1977年Maxam-Gilbert等提出了化学降解法。自Maxam-Gilbert初次提出以来，其实验方案基本上没有变化。

㈠原理

化学降解法与包括合成反应的链终止法不同，需要对原DNA进行化学降解。其基本原理是，首先对待测DNA末端进行放射性标记，再通过5组（也可以是4组）相互独立的化学反应分别得到部分降解产物，其中每一组反应特异性地针对某一种或某一类碱基进行切割。因此，产生5 组（或4组）不同长度的放射性标记的DNA片段，每组中的每个片段都有放射性标记的共同起点，但长度取决于该组反应针对的碱基在原样品DNA分子上的位置。此后各组反应物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，通过放射自显影检测末端标记的分子，并直接读取待测DNA片段的核苷酸序列。测序原理如图所示。

化学裂解法测序原理

5.原生质体融合的优点有哪些？

a.大大提高细胞间基因重组的频率：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，遗传物质传递更为完整。

b.打破了微生物的种、属、科的界限，甚至可以实现更远缘微生物间的基因重组

c.存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。

6.植物细胞培养的基本步骤是什么？

1）外植体灭菌消毒。（根尖、茎、芽、嫩叶、种子、花粉等）

2）用消毒过的器械将外植体置于培养皿上。

3）切取所需的外植体。

4）将外植体接种于培养容器的培养基上，

整个试验在超净工作台上进行，保持无菌！

外植体经过一段时间在培养基上生长后，会形成愈伤组织。

7.为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？

生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯—番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。

8.动物难以克隆的根本原因？

在动物的个体发育过程中，分化的结果使得细胞在形态和功能上高度特化，基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。特化细胞的细胞核中物种基因组完整，具有全能性，但是基因组中的基因并不同时进行活动，一类基因是维持生存的；另一类基因随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。动物的体细胞的基因组中基因的活动并不完全，不能像受精卵那样发挥细胞的全能性。

9.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？

在体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展，实际上“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为他是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着，在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性。

10.生物导弹具体制备过程，以及怎么使用的？

用癌细胞作为抗原，免疫小鼠，制备抗癌细胞单克隆抗体。制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。

单克隆抗体的制备步骤：

1、抗原制备；

2、免疫动物；

3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

4、细胞融合；

5、杂交瘤细胞的选择培养；

6、杂交瘤细胞的筛选；

7、杂交瘤细胞的克隆化；

8、单克隆抗体的检定；

9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；

10、单克隆抗体的大量制备。

单克隆抗体并与抗癌药物连接，便制成了生物导弹，注入患者体内，借助单克隆抗体的导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞。这样既不损伤正常细胞，又减少了药剂的用量。

11.诊断肿瘤在身体中的位置的具体过程？

甲胎蛋白是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为抗原免疫小鼠，制备抗甲胎蛋白单克隆抗体。制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。

单克隆抗体的制备步骤：

1、抗原制备；

2、免疫动物；

3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

4、细胞融合；

5、杂交瘤细胞的选择培养；

6、杂交瘤细胞的筛选；

7、杂交瘤细胞的克隆化；

8、单克隆抗体的检定；

9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；

10、单克隆抗体的大量制备。

单克隆抗体并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过全身血液渗透到所有组织。由于肿瘤细胞表面的甲胎蛋白会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在肿瘤上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在，以及位置。

12.为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？

1.微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样

2.微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶

3.来源广泛，价格便宜

4.微生物易得，生长周期短

5.可以利用微电脑技术控制酶的发酵生产，可进行连续化，自动化，经济效益高

6.可以利用以基因工程为主的分子生物学技术，选育和改造菌种，增加产酶率和开发新酶种

13.有机相酶反应具备哪些条件？

1.保证必需水含量。

2.选择合适的酶及酶形式。

3.选择合适的溶剂及反应体系。

4.选择最佳pH值。

14.发酵生产泡沫产生的原因和泡沫的危害有哪些？消泡措施有哪些？

A.产生泡沫的原因：

通气和机械搅拌；

培养基中某些发泡物质(如蛋白胨、玉米浆、酵母粉等)产生。

糖类物质本身起泡能力差，但较高浓度的糖增加了培养基的黏度，有利于泡沫的稳定。

微生物的代谢活动所产生的气体；

B.泡沫的危害：

影响微生物对氧的吸收；

妨碍二氧化碳的排除；

降低了发酵罐的装料系数，影响设备的利用率。

有可能引起跑料，增加染菌机会。

C.消泡措施：

物理消泡法：靠机械的运动或压力的变化使泡沫破碎，最简单的是在发酵罐的搅拌轴上部安装消泡桨，当消泡桨随搅拌轴转动时将泡沫打碎。

化学消泡法：各种天然的动植物油及来自石油化工生产的矿物油、表面活性剂等。如泡敌（聚醚类）

15.对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？

应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：

（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。

（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。

16.能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的细菌中，让细菌生产人类所需要的蛋白质食品呢？

理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是自然界已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来而自然不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结构和在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出一个崭新而又具有生命功能作用的蛋白质，而且一个崭新的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的。

17.典型的发酵生产过程包括哪些？

菌种的选育

确定菌种繁殖和发酵生产所用的培养基；

对培养基、发酵罐及其附属设备进行灭菌；

菌种经逐级扩大培养后，作为生产种子接种于发酵罐中

控制发酵罐中微生物的生长条件，最大程度地获得人们渴望的代谢产物

产物分离提纯

发酵过程中废弃物的处理与回收

18.某多肽链的一段氨基酸序列是：…—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸—苯丙氨酸—…怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？

首先应该根据三联密码子推出mRNA序列，每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出16种。