新课标人教版高中生物选修1生物技术实践知识点复习

高二下生物选修1生物技术实践复习知识点

1、 果酒和果醋的制作

发酵：利用微生物或其他生物的细胞在有氧或无氧条件下繁殖或积累其代谢产物的过程。 类型：（1）根据是否需要氧气分为：需氧发酵和厌氧发酵。

（2）根据产生的产物可分为：酒精发酵、乳酸发酵、醋酸发酵等

1．酵母菌的细胞呼吸

酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖：C 6H 12O 6+6H 2O +6O 2→6CO 2+12H 2O+能量

酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳：C 6H 12O 6→2C 2H 5OH+2CO 2+能量

2．酵母菌发酵的最佳环境:酵母菌在有氧和无氧的条件下都能生活

在有氧时，酵母菌大量繁殖，但是起不到发酵效果；

在无氧时，繁殖速度减慢，但是此时可以进行发酵。

在利用酵母菌发酵时最好是先通入足够的无菌空气在有氧环境下一段时间使其繁殖，再隔绝氧气进行发酵。20℃左右最适合酵母菌繁殖，酒精发酵的最佳温度是在18℃～25℃，pH 最好是弱酸性。

3．醋酸菌好氧性细菌，当缺少糖源时和有氧条件下，可将乙醇（酒精）氧化成醋酸。表达式为：C 2H 5OH+O 2→CH 3COOH+H 2O ；当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。醋酸菌生长的最佳温度

是在30℃～35℃

装置各部位的作用

充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。

排气口：排出酒精发酵时产生的CO 2。

出料口：是用来取样的。

与瓶身相连的长而弯曲的胶管：加水后防止空气中微生物的污染。

该装置的使用方法：使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气

泵，输入氧气，酵母菌有氧呼吸时，产生能量多，可大量繁殖；无

氧呼吸时，产生能量少，仅能满足自身代谢，基本不繁殖；所以利

用酵母菌进行工业生产时先进行通气再密封。

(1)两种对照方式都必须遵循单一变量原则。(2)前者是标准对照，后者是自身对照。 酶 酶 酶

对照组→2mL 白酒 实验组→2mL 发酵液 试管甲→2mL 发酵前液试管乙→2mL 发酵后液／L 的H 2SO 43滴→振荡混

3滴→观察

／L 的H 2SO 43滴→振荡混

3滴→观察

还可以设置一组空白对照（2ml蒸馏水）

几种常用发酵菌种的比较

果酒、果醋、腐乳、泡菜制作中所用菌种及控制条件的比较

深化拓展：

1、由于醋酸菌和乳酸菌属于原核生物，因此在利用这两类微生物时，其环境中一定不要

加入青霉素等抗生素。

2、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。

3、有氧发酵：醋酸发酵谷氨酸发酵||无氧发酵：酒精发酵乳酸发酵

4、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在发

酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色.

在缺氧呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。

5、控制发酵条件的作用①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是

短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为30～35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。③有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。

2、微生物的实验室培养

1、培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，

是进行微生物培养的物质基础。

2、培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。

在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作常用的凝固剂，但不止这一种凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。

液体培养基应用于工业或生活生产。

固体培养基应用于微生物的分离和鉴定。

半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。

3、按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。

合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。

天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。

4、按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。

选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。

鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。

5、培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子（部分微生物需要）等。

6、碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石

油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

7、氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白

质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。

8、培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆

菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件

9、无菌技术：获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：

①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？

答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。

10、消毒与灭菌的区别

消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子菌落.芽孢，一种休眠体；孢子，一种生殖细胞。）。

消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学

药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。

灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

灭菌方法选择：

①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。

④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。

制作牛肉膏蛋白胨固体培养基

（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（熔化之后灭菌之前往往需要调节PH）（2）倒平板操作的步骤：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。③用左手

的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基

（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。④等待平板冷却凝

固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。纯化大肠杆菌

（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

接种环第一次灼烧，杀死接种环上原有的微生物；每次划线前灼烧，杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使划线菌种来源于上次划线末端；划线结束灼烧，杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。灼烧后冷却避免接种环温度过高杀死菌种。

（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

（5）平板划线法操作步骤：

①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉

塞。③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。

⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的

接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。

（6）涂布平板操作的步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃

尽后，冷却8～10s。④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。培养基表面菌落颜色、形态、大小基本一致，符合目的菌特点，说明接种操作成功。

微生物计数方法

1、显微镜直接计数法，利用计数板在显微镜下计数，但不能区分活菌与死菌。计数板上

有1mm2×0.1mm的计数室，每个计数室400个小格。

2、活菌计数法，在稀释度足够高的菌液中聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，形成

单个菌落，选择菌落数在30-300之间的平板计数。菌落数比活菌实际数低，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上只观察到一个菌落。统计结果用菌落数来表示。3、滤膜法，饮用水过滤后，滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，计数黑色大肠杆菌菌落。

菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

①临时保藏方法

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。

②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。

营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。

人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。

植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。

微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。

确定培养基制作是否合格的方法：将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生

长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

培养基的分类和应用

消毒与灭菌的区别

三种常用灭菌方法的比较

3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

①筛选菌株：利用选择培养基筛选菌株。

②测定微生物数量的常用方法：统计菌落数目和显微镜直接计数。

③土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布平板→微生物的培养与观察→挑选菌落

尿素：是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为

他们能合成脲酶.尿素最初是从人的尿液中发现的

尿素分解菌的分离：尿素分解菌能合成脲酶将尿素分解成氨。氨使培养基的PH升高。以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养尿素分解菌，指示剂变红色。

筛选菌株

（1）实验室中微生物的筛选应用的原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

（2）选择性培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

（3）配制选择培养基的依据：根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

设置对照：设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的

实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所

测试的条件引起相应的结果。

实验设计：实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。

（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106测定放线菌的数量，一般选用103 104 105 测定真菌的数量，一般选用102 103 104

（3）微生物的培养与观察

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30~37℃ 1~2天

放线菌25~28℃ 5~7天霉菌25~28℃ 3~4天

每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色

如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值

每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数

4、菊花的组织培养

一、植物组织培养的基本过程

1、原理：植物细胞全能性。细胞分化的实质：基因选择性表达的结果。

2、全能性表达的条件：离体状态和适宜环境条件（如营养物质、激素、温度等）

3、基本过程：离体的植物组织或细胞→愈伤组织→丛芽、生根（试管苗）→完整植株

4、愈伤组织：排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定型状态的薄壁细胞。

二、菊花的组织培养

1、材料选取：未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。

2、营养：MS培养基，一般添加植物激素(浓度、使用顺序、用量比例都会影响实验)。

3、过程：制备MS培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培

细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。

愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。

脱分化（去分化）：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。

再分化：愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程。

具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体的能力，即每个生物细胞都具有全能性。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下，通过基因的选择性表达，构成不同组织和器官。

植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；

培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。

细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？：使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。

比较根尖分生组织和愈伤组织的异同

材料：不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。

营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是MS 培养基，其中含有的大量元素是N 、P 、S 、K 、Ca 、Mg ，微量元素是Fe 、Mn 、B 、Zn 、Cu 、Mo 、I 、Co ，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。

激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度（根据生长素作用的两重性：低浓度促进生长，高浓度抑制生长，甚至杀死植物）、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。

+ 环境条件：PH 、温度、光等环境条件。 不同的植物对条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH 控制在5.8左右，温度控制在18~22℃，并且每日用日光灯照射12h.

1、菊花茎的组织培养与月季的花粉培养的比较

植物组织培养技术与微生物培养技术的比较

注：在这两种技术中均需要一定的营养物质，但营养物质的划分标准不同。

4、操作流程

配制MS固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液（培养基母液）。

·使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。

·配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容到1000毫升。

·在菊花组织培养中，可以不添加植物激素

原因是菊花茎段组织培养比较容易。·灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

·MS培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS培养基有哪些特点？大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。

微生物培养基以有机营养为主，MS培养基则需提供大量无机营养。

外植体的消毒外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70%的酒精中摇动2~3次，持续6~7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中1~2min。取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。

注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种7～8个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。

培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（18~22℃）和光照（12h）

移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。

栽培：外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。

5 果胶酶在果汁生产中的作用

（一）基础知识

1．植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分有纤维素和果胶。并且两者不溶于水，在果汁加工中，既影响出汁率，又使果汁浑浊。

2．果胶酶的作用是能够将果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，瓦解植物的细胞壁及胞间层，并且使果汁变得澄清。

3．果胶酶是一类酶总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶酯酶等。

4．果胶酶的来源：植物、霉菌、酵母菌和细菌。

5．影响酶活性的因素包括：温度、PH、和酶的抑制剂等。

6．酶的活性是指酶催化一定化学反应的能力。其高低用一定条件下酶所催化的某一化学反应的速度来表示。

7．酶的反应速度是指单位时间内，单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。

8．果胶酶的用量：生产果汁时，为了使果胶酶得到充分的利用，需要控制好酶的用量，用量的多少常要通过实验设计来探究。

（二）．实验设计

〔设计一〕探究温度对酶活性的影响

1．进行实验前要解决的几个问题：

①此实验的自变量是温度；根据单一变量原则，你应确保各实验组相同的变量有PH、底物浓度、底物量、实验器材、酶的用量等等。

②你准备如何测定果胶酶的活性，即你要观测的因变量是出汁量和果汁的澄清度。

③如何控制实验要求的温度梯度？各个烧杯内加入不同温度的水

2．设计实验

（1）实验原理：在一恒定PH下，通过改变温度来确定最适宜的温度

（2）实验步骤：①搅拌器搅拌制苹果泥。②将分别装有苹果泥和果胶酶的试管在恒温水浴中保温。

③加入果胶酶反应一段时间。④过滤果汁。并记录实验结果。⑤改变不同的温度后重复上面的实验。

（3）实验结果、结论：

〔设计二〕探究PH对酶活性的影响

1．进行实验前要解决的几个问题：①你准备如何设置pH梯度，又将如何控制实验要求的pH？5 6 7 8 9 选取不同的试管，调至所需PH

②此实验应选一个适宜的温度进行水浴加热，并且要控制好其他的因素。

2．设计实验

可参考温度对酶活性的影响实验，作相应的变动。

〔设计三〕探究果胶酶的用量

1．进行实验前要解决的几个问题：

①此探究实验是建立在温度和PH对果胶酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是酶的用量，其他因素保持不变。

②实验时可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配制相同浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可，但必需保证反应液的用量必须相同，否则影响实验结果的准确性。

2．设计实验

可参考前两个探究实验，作相应的变动。

6 血红蛋白的提取和分离

一、实验原理

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

（4）作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。

2．缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

3．凝胶电泳法：

（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

二、实验步骤

1．样品处理

①红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

②血红蛋白的释放

在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。

2．粗分离

①分离血红蛋白溶液

将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

②透析

取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。

3．纯化

调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝↓胶面平齐，关闭出口。

加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，∣打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，

↓关闭出口。

调节缓冲液面：加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度

↓

洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。

↓

收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。

4.纯度鉴定------SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）

三、注意事项

1.电泳技术

电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

2. 红细胞的洗涤

如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

3．如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。

此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

4．为什么凝胶的装填要紧密、均匀？

如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的

不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。

6．G-75

“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。

7．装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密

8．加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

9．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

10．如何检测血红蛋白的分离是否成功

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

7胡萝卜素的提取

水蒸气蒸馏法：

原理：水蒸汽可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。

方法：水中蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏。

水上蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏。

水汽蒸馏：利用外来高温水蒸气加热蒸馏。

不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分容易水解。通常用压榨法（通过机械压缩力将液相物从液固两相混合物中分离出来的一种简单操作）萃取法：

原理：芳香油易溶于有机溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。

方法：原料浸泡在溶剂中→得到浸泡液→有机溶剂挥发→芳香油。

不足：有机溶剂中的杂质影响芳香油的品质

胡萝卜素性质：橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。

依据碳碳双键的数目划分为α、β、γ三类。

其中最主要的组成成分为β-胡萝卜素。

作用：①治疗夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；②常用于食品色素；③使癌变细胞恢复成正常细胞。

提取β－胡萝卜素的方法主要有三种：①从植物中提取②从大面积养殖的岩藻中获得③利用微生物的发酵生产

实验步骤①粉碎：使原料与有机溶剂充分接触，增大溶解度。②干燥：脱水温度太高，干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。③萃取

Ⅰ、萃取剂的选择水溶性的：乙醇、丙酮

水不溶性的：石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、四氯化碳等

选择：具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。

Ⅱ、影响萃取的因素

主要因素：萃取剂的性质和使用量

次要因素：原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等

一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。萃取前，要将胡萝卜进行粉碎和干燥

Ⅲ、胡萝卜素提取

装置的设计：萃取过程应该避免明火加热，采用水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧爆炸。为了防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。萃取液的浓缩可直接使用蒸馏装置。在浓缩之前，还要进行过

滤，除去萃取液中的不溶物。

④过滤：除去萃取液中的不溶物

⑤浓缩：蒸发出有机溶剂

鉴定：纸层析法

滤纸：18㎝×30㎝

基线：滤纸下端距底边2㎝处做一基线，在基线上取

A、B、C、D四点。

点样：用最细的注射器针头（毛细吸管）吸取样品进

行点样。点样应该快速细致，在基线上形成直径２ｍ

ｍ左右的圆点，每次点样后，可用吹风机将溶剂吹干，

注意保持滤纸干燥。等滤纸上的点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，至于装有１ｃｍ深的石油醚的密封玻璃瓶中。等各种色素完全分开后，观察标准样品中位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带。