乳酸菌胞外多糖研究
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嗜酸乳杆菌、 唾液链球菌嗜热亚种、 乳酸乳球 菌乳脂亚种、 肠膜明串珠菌等。其中， 顾瑞霞 对唾液链球菌嗜热亚种， 进行了较为系统的
［,?， ,>］ 研究 。
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底物的影响
［,:］ 比较了蔗糖、 乳糖、 葡萄 A)*87B 等人 糖和果糖作为碳源对嗜热链球菌发酵生产
发现用乳糖作为碳原 -$. 合 成 量 的 影 响， 干 -$. 生成量最大。 C7D*’*( 等人研究发现， 酪乳杆菌 AA,, 生物合成 -$. 的最适碳源为 葡萄糖。顾瑞霞报道在 ECF 基本液体培养 基中， 添加葡萄糖和 G 或乳糖都有利于唾液链 球菌 嗜 热 亚 种 的 生 长 和 -$. 的 合 成。 H)DI ［,<］ 报道， 对嗜热链球菌 EJK% 其培 养 +7(774I 物中的氮源不仅影响 -$. 的合成量， 而且影 响所得产物的分子大小， 当细菌必需氮源的 浓度升高时， 所得 -$. 的分子量减小。 !@! 温度的影响
分泌 ’() *+, 是由乳酸菌发酵产生的， 在细胞外的， 常渗入到培养基中的糖类化合 物。根据其所在的位置， 可分为荚膜多糖和
［"$］ 粘液多糖 。乳酸菌胞外多糖的生物合成
胞外多糖 （ 234546789::;9<=>2， 细 菌 素、 ,01、
［?］ 等也具有重要的作用 。一些细胞组 *+,） 成成分， 特别是完整细胞壁肽聚糖则具有抗
食品与发酵工业
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乳酸菌胞外多糖的研究
李全阳 Biblioteka Baidu文水
（江南大学食品学院，无锡，!"#$%& ） 摘 要 ， 文中就其的生产菌的种类、 生物合成的 针对由乳酸菌合成的细胞外多糖 （’() *+,）
途径及其遗传调控、 影响合成的因素等进行了概述； 对 ’() *+, 的分离纯化、 结构鉴定、 生产 能力、 生理功能及其有关研究现状和开发前景进行了综述。 关键词 乳酸菌， 胞外多糖， 研究进展
［/<］ 。 -$. 的最适 QR 值为 5;< ! @ ’ 乳酸菌的品种
/
影响 -$. 合成的因素
从现有结果看， 已得到研究的可生物合
成 -$. 乳酸菌主要有： 德氏乳杆菌保加利亚 亚种、 瑞士乳杆菌、 米酒乳杆菌、 干酪乳杆菌、 万方数据
不同的乳酸菌种 -$. 的合成能力差别 >?
食品与发酵工业
第一作者： 博士研究生， 副教授。 收稿时间： !$$! - $. - !/
肿瘤作用
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万方数据 B&
第 /S 卷
第<期
李全阳等： 乳酸菌胞外多糖的研究
糖主要是糖基!二核苷酸， 所有含葡萄糖的多 聚物 （除糖源外） 均以 "#$! ! !葡萄糖为供体； 乙酸、 丙酮酸、 %!羟基丁酸等的活性形式是酰 基， 为胞外多糖的合成所必需； 异戊二稀脂中 间体整合多糖的重复单元， 在原核细胞多糖 的合成中起作用的是焦磷酸异戊二稀脂； 酶 系统包括己糖激酶、 糖基核苷酸转移酶、 糖基 核苷 酸 合 成 酶、 糖 基 转 移 酶、 聚 合 酶 等。 &’()*+’ 等 认为这些细菌合成 -$. 可能有 （,）加速扩散； （ /）活性传递； （ %） % 种方式： 基因转移。底物若进入细胞， 通常先磷酸化， 用于能量代谢或同化为细胞内多糖、 脂多糖、 细胞壁多糖和 -$.。肠膜明串珠菌在合成葡 聚糖过程中， 合成前体在葡聚糖酶的作用下， 将培养基中的蔗糖转移到前体物质的非还原 末端上合成。葡聚糖合成属于单链合成。其 他细菌异质 -$. 的生物合成， 是以细胞内的 低 聚 糖 苷 链 为 前 体 物， 在细胞膜上合成 的
［B］ 胶凝及保湿 。 ［.］ ， 从 &$$ 株乳酸 "..% 年 C9A >2A )2=D 等 菌中分离到 %$ 株产胞外多糖的乳酸菌， 结果
乳酸菌是一类能利用可发酵性糖为原 料， 并能产生大量乳酸的细菌的通称。目前 在自然界发现的这种细菌在分类学上至少有
［"］ 。而在食品、 医药等领域应用较多 !% 个属 的乳酸菌主要有 / 个属， 分别为乳杆菌属、 链
［,5］ 对德氏乳杆菌保加利亚 L’227B 等人 亚种研究表明， 该菌合成 -$. 的最适发酵温
。
［,%］ 在研究乳酸链球菌的糖 0*) 1)234 等 酵解和 -$. 生物合成的关系时指出， 细菌细
胞的生长和 -$. 的合成具有竞争作用， 葡萄 糖!5!磷酸是决定选择糖酵解和 -$. 生物合 成 / 条途径的关键物质。 嗜温乳酸菌所产 -$. 的特性受大小不 一的各种质粒的调控， 在有些条件下， 如高 温、 频繁传代等作用， 会使其分泌 -$. 的特 性丧失。6748393 等人发现， 干酪乳杆菌干酪 亚种产 -$. 的特征是由一个 :;< =#) 的质粒 控制的， 同时他们也发现产 -$. 的德氏乳杆 菌保加利亚亚种不含质粒。还有人发现， 乳 酸乳球 菌 乳 脂 亚 种 =. 产 -$. 特 征 受 一 个 该质粒还具有抗噬菌 ,>;< =#) 的质粒控制， 体的能力。嗜热性乳酸菌通常不含质粒， 其 产 -$. 的性质也与质粒无关。
测定多糖的结构， 首先要测定单糖的组 成， 找出它的结构单位， 然后再了解这些结构 单位的排列顺序， 连接化学键的类型等。分 子量可用 0:R:’ （高效凝胶浸透层析法） 和 凝胶过滤层析法测定。单糖组成及摩尔比的 测定可用气相色谱或高效液相色谱法。甲基 化法、 过碘酸盐氧化法、 红外光谱及核磁共振 可用于多糖的结构分析。
度为 %>M ，该值比其最适生长温度 :K N :%M 略低， 这可能是在此温度下， 细菌生长速度较 慢， 细胞壁合成也较慢， 从而使较多的磷酸异 戊二烯用于 -$. 的合成， 并更有利于合成酶 的分泌。顾瑞霞等对唾液链球菌嗜热亚种研 究结果是 %<M 下， 当温度 -$. 的合成量最大， 高于 :?M 时， 该菌的 -$. 生物合成能力迅速 消失。但也有例外情况， 有人发现某些菌 （如 德氏乳杆菌保加利亚亚种 OCPH/??/） 在脱脂 乳及限制性培养基上， -$. 生物合成的最佳温 度高于其最适生长温度。 !#$ %& 值的影响 许多研究者指出， 在接近中性偏酸的 QR 条件下， 异 -$. 生物合成量较大。已经证实， 戊二烯酯的运载最适 QR 值在 5;< N ?;K 之 间。QR 值的降低会使多糖的合成因失去脂 中间体而受阻。唾液链球菌嗜热亚种合成
。乳酸菌胞外多糖 （ ’() *+,） 即 是这类细菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁 外的粘液或夹膜多糖。自 !$ 世纪 #$ 年代成 功开发出由肠明串珠菌发酵产生右旋糖酐 （>23@<9A） 以来， 新的微生物胞外多糖的研究 与开发在世界范围内已成为研究的热点。而 乳酸菌 *+, 因具有理论和实际应用价值已 ［/］ 经引起了许多学者的兴趣 。许多乳酸菌是 历史悠久的工业生产菌， 乳酸菌胞外多糖不 仅对乳制品的质构和风味具有重要影响， 而 且有可能成为食品级多糖的一个极好的来源 而广泛应用于各种食品的增稠、 稳定、 乳化、
［4-］ 报道， 德氏乳杆菌保加利 9@>GST?UV 等 亚亚种胞外多糖的结构是：
+
乳酸菌 9:7 的分离纯化及结构鉴定
多糖的分离、 纯化可依多糖的性质和共
存的组成成分来决定。常先用离心法除去蛋 白质 和 菌 体， 然后用乙醇或丙酮分级沉淀
［4!］ 最近报道， 嗜热链球菌 9X4- 所产胞外多糖的结构为： WS@?K>? 等
因菌种的不同而发生在不同的条件下， 按合 成位点和合成模式不同， ’() *+, 的合成可 分为 ! 类， 即细胞壁外的同源多糖的合成与 细胞膜上的异源多糖的合成。前者如葡聚 糖、 果聚糖是在胞外合成的， 合成体系中包括 糖基供 体、 糖基受体和葡聚糖蔗糖酶 （ >23E 。葡 聚 糖 的 合 成 属 单 链 反 应 机 @<9A8F:<982） 制， 以蔗糖为唯一底物， 合成所需的能量来自 不需要脂载 蔗糖的水解而不是糖基E核苷酸， 体和独立的分支酶， 所合成的葡聚糖分子量 大。细菌异源多糖的合成则包括 ? 个因子： 糖基E核苷酸、 酰基供体、 脂中间体、 酶系统和 糖基受体。在细胞膜上合成多糖需要活性前 体以及各种高能态的单糖， 这些高能态的单
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发现常见的工业生产菌如： 德氏乳杆菌保加 利亚亚种、 瑞士乳杆菌、 干酪乳杆菌干酪亚 种、 马乳酒样乳杆菌、 嗜酸乳杆菌、 嗜热链球 菌、 乳酸乳球菌乳油亚种、 乳酸乳球菌、 肠膜 明串珠菌等均能产生胞外多糖。
球菌属、 肠球菌属、 乳球菌属、 片球菌属、 明串 珠菌属和双歧杆菌属 菌
［%］ ［!］
。
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很大 （见表 !） ， 而同一品种的不同品系也具 有相当大的差异。并且不同的学者报道的结 果也不相同。
表! 不同乳酸菌的生物合成量
合成量 ・ " #$ %&! +)) ,3+ 33 ,-- 5 +-!!+ 3-!!43 发酵条件 ,-. ，/0 12,). ，/0 324-. ， ,-. ，/012) ,-. ，/012!). ，/012) 4-. ，/0123 （6(7）
,
9:7 的生物合成量
国外已有许多研究者对不同乳 酸 菌 的
例如 %;< 9:7 的 生 物 合 成 量 进 行 了 探 索， ［!1］ 等 用响应面法优化了半限制培养 =>##?@ 基上德氏乳杆菌保加利亚亚种 (( 胞外多糖 产生的最适温度为 ,). ， 最适 /0 值为 32-， 氮 源的最适浓度为 ,- $ " %， 这时 9:7 的最大合成 量为 ,3+ #$ " % （见表 !） ， 国内顾瑞霞等也对多 种乳酸菌胞外多糖的生产能力进行了研究， 9:7 的合成量大约在 44 5 !44 #$ " % 之间。
许多 乳 酸 菌 是 人 体 肠 道 的 固 有 有 益 ，因此人类对其研究、 应用与开发做了 大量的工作， 同时也取得了大量的成果。目 前已知乳酸菌发挥主要生理功能特性的机 理， 除了定植、 主要代谢产物 （如乳酸等） 改善
［#］ 肠道内环境 外， 乳酸菌的次生代谢产物如
"
’() *+, 的生物合成及遗传调控
［!Q］ 的全部结构甚至立体构象 。
乳酸菌 干酪乳杆菌 ’(%)* 德氏乳杆菌保加利亚亚种 乳酸乳球菌乳脂亚种 %’,,开菲尔粒 嗜热链球菌 乳酸乳球菌乳脂亚种 酒清乳杆菌 - & !
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其他影响因素
糖和盐的种类和含量对 9:7 的合成都 有影响， 不同的乳酸菌对其要求不一。适当 控制培养基的含氮量有利于 9:7 的生成。
［!)］ 再用透析法去除共沉淀的无机盐 ， 9:7， 采用硫酸A苯胺法测定含量， 用葡萄糖作为标
准。平均分子量很高的 9:7，可以通过填充 低孔 性 凝 胶 的 层 析 柱 进 行 脱 盐。有 时 9:7 结合部分蛋白质， 可用胃蛋白酶或胰蛋白酶 消化去除。用凝胶色谱进行粗多糖分级纯 化。多糖的纯度鉴定， 可用葡萄糖凝胶电泳、 高压电泳法、 超速离心法等加以鉴别。 糖链的结构远比肽链复杂。肽链的合成 有模板， 可以通过 BCD; 的测序来推测肽链 的氨基酸顺序， 但糖链的合成没有模板， 无法 利用 “模板” 类的东西来推测糖基顺序。因 此， 糖链的一级结构分析一直比较落后。近 年来糖链结构测定技术突飞猛进， 高分辨率 核磁共振， 试剂 （以外切糖苷酶为主） 阵列分 析法， 还有测定糖结构的糖顺序仪 （ $@EBFG?A HI?JB?K）以 及 快 速 原 子 轰 击 电 离 质 谱 （L;6<7） 和基质辅助的激光解吸电离飞行时 间质谱 （6;%CMNOL67） 等， 再配合高分辨率 P 射线衍射， 可在不到一周的时间内测出糖链
嗜酸乳杆菌、 唾液链球菌嗜热亚种、 乳酸乳球 菌乳脂亚种、 肠膜明串珠菌等。其中， 顾瑞霞 对唾液链球菌嗜热亚种， 进行了较为系统的
［,?， ,>］ 研究 。
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［,:］ 比较了蔗糖、 乳糖、 葡萄 A)*87B 等人 糖和果糖作为碳源对嗜热链球菌发酵生产
发现用乳糖作为碳原 -$. 合 成 量 的 影 响， 干 -$. 生成量最大。 C7D*’*( 等人研究发现， 酪乳杆菌 AA,, 生物合成 -$. 的最适碳源为 葡萄糖。顾瑞霞报道在 ECF 基本液体培养 基中， 添加葡萄糖和 G 或乳糖都有利于唾液链 球菌 嗜 热 亚 种 的 生 长 和 -$. 的 合 成。 H)DI ［,<］ 报道， 对嗜热链球菌 EJK% 其培 养 +7(774I 物中的氮源不仅影响 -$. 的合成量， 而且影 响所得产物的分子大小， 当细菌必需氮源的 浓度升高时， 所得 -$. 的分子量减小。 !@! 温度的影响
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胞外多糖 （ 234546789::;9<=>2， 细 菌 素、 ,01、
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食品与发酵工业
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乳酸菌胞外多糖的研究
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（江南大学食品学院，无锡，!"#$%& ） 摘 要 ， 文中就其的生产菌的种类、 生物合成的 针对由乳酸菌合成的细胞外多糖 （’() *+,）
途径及其遗传调控、 影响合成的因素等进行了概述； 对 ’() *+, 的分离纯化、 结构鉴定、 生产 能力、 生理功能及其有关研究现状和开发前景进行了综述。 关键词 乳酸菌， 胞外多糖， 研究进展
［/<］ 。 -$. 的最适 QR 值为 5;< ! @ ’ 乳酸菌的品种
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影响 -$. 合成的因素
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糖主要是糖基!二核苷酸， 所有含葡萄糖的多 聚物 （除糖源外） 均以 "#$! ! !葡萄糖为供体； 乙酸、 丙酮酸、 %!羟基丁酸等的活性形式是酰 基， 为胞外多糖的合成所必需； 异戊二稀脂中 间体整合多糖的重复单元， 在原核细胞多糖 的合成中起作用的是焦磷酸异戊二稀脂； 酶 系统包括己糖激酶、 糖基核苷酸转移酶、 糖基 核苷 酸 合 成 酶、 糖 基 转 移 酶、 聚 合 酶 等。 &’()*+’ 等 认为这些细菌合成 -$. 可能有 （,）加速扩散； （ /）活性传递； （ %） % 种方式： 基因转移。底物若进入细胞， 通常先磷酸化， 用于能量代谢或同化为细胞内多糖、 脂多糖、 细胞壁多糖和 -$.。肠膜明串珠菌在合成葡 聚糖过程中， 合成前体在葡聚糖酶的作用下， 将培养基中的蔗糖转移到前体物质的非还原 末端上合成。葡聚糖合成属于单链合成。其 他细菌异质 -$. 的生物合成， 是以细胞内的 低 聚 糖 苷 链 为 前 体 物， 在细胞膜上合成 的
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［"］ 。而在食品、 医药等领域应用较多 !% 个属 的乳酸菌主要有 / 个属， 分别为乳杆菌属、 链
［,5］ 对德氏乳杆菌保加利亚 L’227B 等人 亚种研究表明， 该菌合成 -$. 的最适发酵温
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［,%］ 在研究乳酸链球菌的糖 0*) 1)234 等 酵解和 -$. 生物合成的关系时指出， 细菌细
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测定多糖的结构， 首先要测定单糖的组 成， 找出它的结构单位， 然后再了解这些结构 单位的排列顺序， 连接化学键的类型等。分 子量可用 0:R:’ （高效凝胶浸透层析法） 和 凝胶过滤层析法测定。单糖组成及摩尔比的 测定可用气相色谱或高效液相色谱法。甲基 化法、 过碘酸盐氧化法、 红外光谱及核磁共振 可用于多糖的结构分析。
度为 %>M ，该值比其最适生长温度 :K N :%M 略低， 这可能是在此温度下， 细菌生长速度较 慢， 细胞壁合成也较慢， 从而使较多的磷酸异 戊二烯用于 -$. 的合成， 并更有利于合成酶 的分泌。顾瑞霞等对唾液链球菌嗜热亚种研 究结果是 %<M 下， 当温度 -$. 的合成量最大， 高于 :?M 时， 该菌的 -$. 生物合成能力迅速 消失。但也有例外情况， 有人发现某些菌 （如 德氏乳杆菌保加利亚亚种 OCPH/??/） 在脱脂 乳及限制性培养基上， -$. 生物合成的最佳温 度高于其最适生长温度。 !#$ %& 值的影响 许多研究者指出， 在接近中性偏酸的 QR 条件下， 异 -$. 生物合成量较大。已经证实， 戊二烯酯的运载最适 QR 值在 5;< N ?;K 之 间。QR 值的降低会使多糖的合成因失去脂 中间体而受阻。唾液链球菌嗜热亚种合成
。乳酸菌胞外多糖 （ ’() *+,） 即 是这类细菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁 外的粘液或夹膜多糖。自 !$ 世纪 #$ 年代成 功开发出由肠明串珠菌发酵产生右旋糖酐 （>23@<9A） 以来， 新的微生物胞外多糖的研究 与开发在世界范围内已成为研究的热点。而 乳酸菌 *+, 因具有理论和实际应用价值已 ［/］ 经引起了许多学者的兴趣 。许多乳酸菌是 历史悠久的工业生产菌， 乳酸菌胞外多糖不 仅对乳制品的质构和风味具有重要影响， 而 且有可能成为食品级多糖的一个极好的来源 而广泛应用于各种食品的增稠、 稳定、 乳化、
［4-］ 报道， 德氏乳杆菌保加利 9@>GST?UV 等 亚亚种胞外多糖的结构是：
+
乳酸菌 9:7 的分离纯化及结构鉴定
多糖的分离、 纯化可依多糖的性质和共
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［4!］ 最近报道， 嗜热链球菌 9X4- 所产胞外多糖的结构为： WS@?K>? 等
因菌种的不同而发生在不同的条件下， 按合 成位点和合成模式不同， ’() *+, 的合成可 分为 ! 类， 即细胞壁外的同源多糖的合成与 细胞膜上的异源多糖的合成。前者如葡聚 糖、 果聚糖是在胞外合成的， 合成体系中包括 糖基供 体、 糖基受体和葡聚糖蔗糖酶 （ >23E 。葡 聚 糖 的 合 成 属 单 链 反 应 机 @<9A8F:<982） 制， 以蔗糖为唯一底物， 合成所需的能量来自 不需要脂载 蔗糖的水解而不是糖基E核苷酸， 体和独立的分支酶， 所合成的葡聚糖分子量 大。细菌异源多糖的合成则包括 ? 个因子： 糖基E核苷酸、 酰基供体、 脂中间体、 酶系统和 糖基受体。在细胞膜上合成多糖需要活性前 体以及各种高能态的单糖， 这些高能态的单
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发现常见的工业生产菌如： 德氏乳杆菌保加 利亚亚种、 瑞士乳杆菌、 干酪乳杆菌干酪亚 种、 马乳酒样乳杆菌、 嗜酸乳杆菌、 嗜热链球 菌、 乳酸乳球菌乳油亚种、 乳酸乳球菌、 肠膜 明串珠菌等均能产生胞外多糖。
球菌属、 肠球菌属、 乳球菌属、 片球菌属、 明串 珠菌属和双歧杆菌属 菌
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表! 不同乳酸菌的生物合成量
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9:7 的生物合成量
国外已有许多研究者对不同乳 酸 菌 的
例如 %;< 9:7 的 生 物 合 成 量 进 行 了 探 索， ［!1］ 等 用响应面法优化了半限制培养 =>##?@ 基上德氏乳杆菌保加利亚亚种 (( 胞外多糖 产生的最适温度为 ,). ， 最适 /0 值为 32-， 氮 源的最适浓度为 ,- $ " %， 这时 9:7 的最大合成 量为 ,3+ #$ " % （见表 !） ， 国内顾瑞霞等也对多 种乳酸菌胞外多糖的生产能力进行了研究， 9:7 的合成量大约在 44 5 !44 #$ " % 之间。
许多 乳 酸 菌 是 人 体 肠 道 的 固 有 有 益 ，因此人类对其研究、 应用与开发做了 大量的工作， 同时也取得了大量的成果。目 前已知乳酸菌发挥主要生理功能特性的机 理， 除了定植、 主要代谢产物 （如乳酸等） 改善
［#］ 肠道内环境 外， 乳酸菌的次生代谢产物如
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［!Q］ 的全部结构甚至立体构象 。
乳酸菌 干酪乳杆菌 ’(%)* 德氏乳杆菌保加利亚亚种 乳酸乳球菌乳脂亚种 %’,,开菲尔粒 嗜热链球菌 乳酸乳球菌乳脂亚种 酒清乳杆菌 - & !
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其他影响因素
糖和盐的种类和含量对 9:7 的合成都 有影响， 不同的乳酸菌对其要求不一。适当 控制培养基的含氮量有利于 9:7 的生成。
［!)］ 再用透析法去除共沉淀的无机盐 ， 9:7， 采用硫酸A苯胺法测定含量， 用葡萄糖作为标
准。平均分子量很高的 9:7，可以通过填充 低孔 性 凝 胶 的 层 析 柱 进 行 脱 盐。有 时 9:7 结合部分蛋白质， 可用胃蛋白酶或胰蛋白酶 消化去除。用凝胶色谱进行粗多糖分级纯 化。多糖的纯度鉴定， 可用葡萄糖凝胶电泳、 高压电泳法、 超速离心法等加以鉴别。 糖链的结构远比肽链复杂。肽链的合成 有模板， 可以通过 BCD; 的测序来推测肽链 的氨基酸顺序， 但糖链的合成没有模板， 无法 利用 “模板” 类的东西来推测糖基顺序。因 此， 糖链的一级结构分析一直比较落后。近 年来糖链结构测定技术突飞猛进， 高分辨率 核磁共振， 试剂 （以外切糖苷酶为主） 阵列分 析法， 还有测定糖结构的糖顺序仪 （ $@EBFG?A HI?JB?K）以 及 快 速 原 子 轰 击 电 离 质 谱 （L;6<7） 和基质辅助的激光解吸电离飞行时 间质谱 （6;%CMNOL67） 等， 再配合高分辨率 P 射线衍射， 可在不到一周的时间内测出糖链