四逆汤对肾性高血压大鼠主要靶器官AngⅡ和CGRP表达的影响

四逆汤对肾性高血压大鼠主要靶器官AngⅡ
和CGRP表达的影响
【摘要】目的探讨四逆汤对肾性高血压大鼠主要靶器官血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和降钙素基因相关肽（CGRP）表达的影响。

方法选择健康雌性Wistar大鼠24只，随机分为正常对照组、肾性高血压组和四逆汤治疗组，每组8只。

双肾动脉夹闭法建立肾性高血压动物模型，免疫组化法测定心、脑、肾组织中AngⅡ和CGRP的表达。

结果肾性高血压组大鼠各器官CGRP和AngⅡ表达水平较正常对照组均显著升高。

四逆汤治疗组大鼠各器官CGRP表达水平较肾性高血压组均明显降低；四逆汤治疗组大鼠AngⅡ在肾脏和心脏的表达水平较肾性高血压组均明显降低，但在脑组织中的表达差异无显著性。

结论四逆汤可能通过调节肾性高血压大鼠肾、心、脑组织中血管活性物质AngⅡ和CGRP的表达水平，发挥其血压调节作用。

【关键词】四逆汤高血压肾性心脏肾脑血管紧张素降钙素基因相关肽大鼠
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of Sinitang on the expressions of angiotensinⅡ(AngⅡ) and calcium gene related peptide (CGRP) in the main target organs of renal hypertension rats.MethodsTwenty four healthy female Wistar rats were evenly divided into normal control (NC) group, renal hypertension (RH) group and Sinitang treatment (ST) group. The renal hypertension models were established by clipping both renal arteries. The expressions of AngⅡand CGRP in tissues of heart,
brain and kidney were determined immunohistochemically.ResultsThe expressions of CGRP and AngⅡin tissues of kidney, heart and brain in RH group were higher than those of NC group. The expressions of CGRP in kidney, heart and brain and those AngⅡin kidney and heart in ST group were lower than those of RH group, no significant difference was found in the expression of AngⅡin brain tissue compared between RH and ST groups.ConclusionThe blood pressure regulating action of Sinitang is probably through adjusting the expression levels of CGRP and AngⅡin renal, heart and brain tissues of the experimental rats.
［KEY WORDS］Sinitang; hypertension, renal; heart; kidney; brain; angiotensin Ⅱ; calcitonin gene related peptide; rats
高血压按病因可分为自发性高血压和继发性高血压，其中自发性高血压最多见，占高血压病人的95%以上，少数病人继发于肾脏疾病、嗜铬细胞瘤等。

但无论何种病因，高血压发生发展的病理生理过程是相似的，都是由缩血管活性物质和舒血管活性物质分泌失衡引起阻力血管的收缩、痉挛直至发生血管结构的改变。

全身血管结构和功能的改变导致机体重要器官心、脑、肾的损害，如心肌缺血或心脏衰竭、脑梗死或出血、肾衰竭。

高血压目前是全球高发病，我国人群患病率高达11.26%[1]，然而目前对于高血压仍缺乏行之有效的预防和治疗手段。

本实验在成功制作双肾双夹型肾性高血压大鼠模型的基础上，应用中药方剂四逆汤治疗，测定参与高血压发生发展的血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和降钙素基因相关肽（CGRP）等活性物质在局部组织的
表达水平，以探讨四逆汤对高血压的治疗作用和机制。

1 材料和方法
1.1 实验动物分组
成年健康雌性Wistar大鼠24只，3月龄，体质量180～200 g，SPF 级，由青岛市药物检验所实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK （鲁）20030010，22 ℃室温下常规喂养。

随机分为正常对照组、肾性高血压组和四逆汤治疗组，每组8只。

1.2 动物模型制备
根据双肾动脉夹闭法建立肾动脉狭窄性高血压动物模型[2]，应用RBF2型大鼠尾动脉血压计（北京中日友好医院临床医学研究所）反复测量3次，取均值，以血压大于17.29 kPa为造模成功的标志，不成功的动物及术中出血过多、手术操作时间超过30 min、术后2 h仍不苏醒以及状态不好的动物，予以剔除，另选动物补齐。

正常对照组不做任何处理。

1.3 治疗方案
四逆汤提取物由北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室提供，实验动物全方给药（附子5 g，干姜4.5 g，甘草6.0 g，合计15.5 g），每千克体质量0.04副，合提取物155 mg/kg。

用蒸馏水将提取物配制成20 g/L水溶液。

动物造模成功后，四逆汤治疗组动物按7.75 mL/kg灌胃，每日1次，连续应用14 d，肾性高血压组动物同步给予等量的生理盐水，正常对照组不做处理。

1.4 标本采集和处理
治疗结束后，麻醉动物，仰卧固定，打开腹腔，依次经腹主动脉灌注生理盐水200 mL和40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L PBS 300 mL固定，迅速取心、肾、脑、动脉，置于40 g/L多聚甲醛0.1 mol/L PBS 300 mL中后固定2 h，蒸馏水浸泡4 h，置体积分数0.70乙醇中保存备用。

常规脱水、透明、浸蜡、包埋。

肾脏沿长轴纵向切片，心脏垂直于长轴沿横切面切片，脑自视交叉后方连续冠状切片，厚度7 μm，每隔10张抽取一张，贴于经多聚赖氨酸处理的切片上，室温保存备用。

1.5 免疫组化检测
兔抗大鼠AngⅡ和CGRP单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连接法（SP）免疫组化试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。

切片常规脱蜡、水化，按试剂盒提供的实验步骤进行操作，DAB显色，光镜下观察，胞浆出现棕色颗粒为阳性着色。

部分切片不加一抗，以0.1 mol/L PBS代替，不出现阳性着色。

高倍镜下（100倍）随机各取4个视野计数阳性细胞（心脏取心肌细胞的横截面），以±s表示。

2 结果
2.1 AngⅡ表达
心脏内AngⅡ阳性表达见于心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞；脑内阳性细胞见于皮质、脑室脉络膜内皮细胞；肾脏内Ang Ⅱ阳性表达见于肾小球血管内皮、血管内皮细胞管腔侧，少量分布于近曲小管上皮细胞。

肾性高血压组心、肾AngⅡ表达水平均显著高于正常对照组，
四逆汤治疗组心、肾AngⅡ表达水平均显著低于肾性高血压组（F=14.56～17.28，q=4.12～6.07，P<0.01）。

3组脑内AngⅡ表达水平比较差异无显著性。

见表1。

表1 各组靶器官AngⅡ表达水平的比较
2.2 CGRP表达
在心肌细胞横切面上，CGRP阳性颗粒主要位于心肌细胞膜周边，呈现为细密的颗粒；在心肌细胞纵切面上，CGRP阳性颗粒呈线形与心肌纤维走行一致。

脑内CGRP阳性细胞分布于皮质、海马神经细胞。

肾脏CGRP阳性颗粒，主要分布于肾小管上皮细胞表面和血管平滑肌细胞。

肾性高血压组大鼠各器官CGRP表达水平较正常对照组均显著升高（F=4.12～7.33,q=3.41～5.74，P<0.05)；四逆汤治疗组大鼠各器官CGRP表达水平较肾性高血压组均明显降低（q=4.36～6.87，P<0.01）。

见表2。

表2 各组靶器官CGRP水平的比较
3 讨论
AngⅡ是肾素血管紧张素醛固酮（RAS）系统中发挥主要功能的活性物质。

RAS系统既是循环内分泌系统，也是全身分布的局部内分泌系统[3]。

肾性高血压模型大鼠肾动脉血流减少，肾脏致密斑释放肾素增加，将血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ，后者在血管紧张素转换酶（ACE）的作用下转变成AngⅡ，从而激活循环中的RAS 系统[4]。

AngⅡ不仅通过促进肾上腺皮质球状带分泌醛固酮增加，造成体内水钠潴留，而且是强有力的血管收缩剂，能够使全身阻力血管收缩。

持续高水平的AngⅡ导致全身小动脉的持续痉挛，痉挛引起
的血管组织缺血进一步造成内皮功能的损伤，导致内皮分泌的血管收缩因子和血管舒张因子分泌失衡。

同时，AngⅡ还能够诱导血管平滑肌细胞和心肌细胞的增生[5]。

有研究指出，参与血管平滑肌细胞和心肌细胞增殖的主要是局部的RAS系统[6]，牵拉可以促进心肌细胞AngⅡ的自分泌增加，高血压心肌肥厚程度与心肌内AngⅡ水平呈显著正相关。

另外，肾脏局部的AngⅡ通过调节肾血流量和肾小球滤过率，以及通过促进肾小管对钠离子的重吸收等作用促进高血压的发生发展[7]。

CGRP是由分布于全身血管组织的感觉神经释放的血管活性神经肽，是体内最强的舒血管物质[8]。

在正常生理状态下，内皮素（ET）和CGRP的相对平衡维持着血管壁的张力，CGRP持续分泌维持血管的稳定舒张，除此之外，肾脏内的CGRP还具有直接的利钠利尿的作用[9]，根据本实验中CGRP在肾脏的分布显示，CGRP的这种效应可能是通过直接作用于肾小管，调节其功能状态实现的。

研究表明，Ang Ⅱ能够抑制CGRP的释放，ET、低氧则可促进CGRP的释放，肾性高血压大鼠CGRP水平升高，推测其为代偿性升高，CGRP能够抑制血管平滑肌细胞的增殖，并抑制醛固酮的分泌[10]，对抗AngⅡ和ET的效应。

本研究显示，肾性高血压组大鼠各器官CGRP和心、肾Ang
Ⅱ表达水平较正常对照组均显著升高，说明高血压动物CGRP和Ang Ⅱ合成增多；四逆汤治疗组大鼠各器官CGRP表达水平较肾性高血压组均明显降低。

总体分析，四逆汤可能通过调节高血压大鼠体内舒
缩血管活性物质的平衡，从而抑制高血压的发生和发展，而且其降压作用可能主要是从心血管系统和靶器官两方面实现的。

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