感染性克隆的发展及应用

发展中的细菌人工染色体
BAC载体的基本结构
parA 、parB和parC,分裂必需的3个基因 oriS决定DNA的单向复制 repE编码复制所必需的蛋白质E. Cmr (氯霉素抗性基因),选择性标志基因 lacZ元件,通过α互补的原理区分重组子 cosN和loxP，分别来源于λ和P1噬菌体。其中
E.coli致育因子(fertility,F)
• F因子是一个约100kb的质粒,编码60多种参 与复制、分配和接合过程的蛋白质
• F+性状作为染色体的标记,可以高效地转移 给受体细胞(F-),提示接合转移需要一个可 传递的致育因子,该因子被命名为F.
• F因子可以整合到宿主染色体中,并且以超 常的高频率转移遗传标记.
病毒感染性克隆发展及应用技术支撑
重组DNA技术 RT-PCR技术 体外转录技术 人工诱变技术
病毒RNA的提取技术
异硫氰酸胍分离技术已逐渐被商品化的 RNA分离试剂盒所替代 试剂盒可以得到高纯度和高浓度的RNA 可以减少环境污染导致的RNA降解
RT-PCR技术
两步法 一步法 超长RT-PCR
PrV感染性克隆的构建流程
病毒基因组 DNA BAC
PK-15
PK-15
重组病毒基因组 DNA
BAC
提取基因组 重组病毒基因组DNA BAC
PK-15
病毒粒子
含有PRV基因 组全长克隆的
BAC质粒
BAC
细胞病变
BAC
转染真核细胞
BAC
含有PRV基 因组全长克 隆的BAC质
粒
DH10B
PrV感染性克隆的构建流程图
体外、体内转录技术
体外转录技术是利用RNA聚合酶将基因组 cDNA拷贝转录成RNA
体内转录是将cDNA返回到RNA的过程转移到 细胞内完成
人工引入转录终止。又称为流产转录 （runoff transcription),是人为在基因组 全长cDNA克隆3’端终止RNA聚合酶的合成作用
定点诱变技术
lanes 4、5 and 6. TK-/gG-/lacZ+ 、 TK-/gG-/BAC and pTKgGBAC digested with PstI.
提取的PrV Ea TK-/gG-/BAC+细 菌质粒转染IBRS-2细胞
BAC骨架质 粒转染细胞
细胞 病变
TK-/gG-/BAC+ 质粒转染细胞
反向遗传学(Reverse Genetics)是相对于经典遗传 学而言的。
经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研 究生命的发生与发展规律的，反向遗传学则是直接 从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质 现象，与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作 技术(Reverse Genetic Manipulaton)。
PrV感染性克隆Southern杂交分析
BamHI酶切提取的 TK-/gG-/BAC+质粒 1:Genomic DNA from infected cells 2:genomic DNA from bacteria
lanes 1、2 and 3. TK-/gG-/lacZ+ 、 TK-/gG-/BAC and pTKgGBAC digested with NotI ;
该病毒约5kb的双链DNA基因组通过限制性 酶切被连接到pBR322质粒中.
当被克隆的病毒基因组DNA从E.coli载体中 释放再接种小鼠或体外转染鼠细胞后均能 产生病毒感染.
“感染性克隆”由此产生.
已构建感染性克隆的DNA病毒
• 人腺病毒(HADV) , (1986) • 杆状病毒 • 鼠巨细胞病毒(MCMV), (1997) • 单疱疹病毒-1(HSV-1), (1998) • 猪伪狂犬病毒(PRV), (1999) • 人巨细胞病毒(HCMV), (1999) • 马立克氏病毒-1(MDV-1), (2000) • 几内亚猪巨细胞病毒(GPCMV), (2000) • 鼠γ 疱疹病毒-68(MGHV-68), (2001) • 牛疱疹病毒-1(BHV-1), (2001) • 猕猴巨细胞病毒(RCMV), (2002) • 牛痘病毒(VAC), (2002)
BAC
1989年， O’Conner首次用“染色体建造”的方法， 利用F因子构建载体pMBO131来克隆大片段DNA.
1992年, Shizuya等以pMBO131为基础,将T7、SP6 启动子序列，含cosN和loxP位点的λ和P1噬菌体片 段分别插入pMBO131中，构建了可以容纳300kb以上 的载体pBAC108L，从而建立了细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome,BAC) 。
感染性克隆与反向遗传操作
概述
感染性克隆
病毒的感染性克隆是一种对于真核细胞具有感染性 的病毒基因组全长克隆的质粒形式
将病毒基因组的全长DNA或cDNA克隆整合到载体中
能在E.coli中稳定存在和复制
通过体外转录成RNA或直接转染后,具有感染真核细 胞的能力
因此，它既能在原核细胞中存在也能在真核细胞中 增殖传代.
亲本株PrV TK-/gG-/lacZ+与含BAC骨 架穿梭质粒同源重组
PrV TK-/gG-/lacZ+
UL
IR
US TR
Us region
PstI BamHI
lacZ IR PK
gG
PstI
gG gD gI
gE
28K TR 11K
pSB301
cat
repE
SphI NotI SphI oriS PstI
3周后检测 中和抗体
PRV Ea株攻毒 (1×105PFU)(100ul/只)
1周后检测 中和抗体 及保护率
1周后检测 中和抗体 及保护率
Mean Neutralization Antibody Titers (log10)
PrV中和抗体检测
2.5
1 dose
2 doses
2.25
7d p.i.
14d p.i.
感染性克隆与反向遗传操作的发展开创了病毒研究 的新时代
感染性克隆与反向遗传操作为研究病毒生命 行为、致病机制以及病毒与宿主细胞间的相互 作用提供了技术平台
借助基因组感染性克隆来研究病毒，不再是 脱离病毒整体孤立地研究单个基因、单个蛋白， 而可以从整个基因组水平来研究错综复杂、相 互关联的基因组合蛋白组
F1代
BAC-CAT PCR检测
免疫动物技术路线
PK-15细胞 PRV亲本株TK-/gG-/lacZ+
(5×104PFU）
PRV重组株TK-/gG-/BAC (5×104PFU）
转移质粒pSB301 （50ug)
PRV的全长BAC DNA （50ug)
3周后检测 (8只/组)(肌肉注射) 中和抗体 (8只/组)(肌肉注射)
DNA病毒的感染性克隆
基因组<50kbDNA病毒的感染性克隆 基因组>50kbDNA病毒的感染性克隆
RNA病毒的感染性克隆
正链RNA病毒的感染性克隆 负链RNA病毒的感染性克隆
分节段与不分节段负链RNA病毒的 感染性克隆
DNA病毒感染性克隆发展及应用
DNA病毒感染性克隆的产生
在1979年,Israel等在E.coli中克隆了一种 小的哺乳动物病毒(polyomavirus)的全长 基因组.
TK-/gG-/LacZ+
UL
PK gG
LacZ
IR Us
TR
gG
gD
TK-/gG-/BAC+
homology cat
BAC骨架
oriF repE parA
homology parB
UL
IR
Us
TR
BAC
提取环状基因 组DNA
转化DH10B
UL
IR
TR
BAC
提取BAC质粒 DNA
转染IBRS-2细胞
4.0
3.0
2.0
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1.0 0.0
pEaBlue PRV-BAC
0
12
24
36
48
60
72
Time After Infection (Hours)
Single-step growth curves of the parent virus PRV TK-/gG-/lacZ+ and the recombinant virus PRV TK-/gG-/BAC Virus was harvested from cells at 2、6、12、24、48 and 72h
cosN可被λ噬菌体的末端酶切割，loxP可由P1噬 菌体的Cre蛋白识别和切割
BAC载体骨架图谱
其它人工染色体
PAC：来源于P1的人工染色体 (容量<300kb） HAC：哺乳动物人工染色体(容量<300kb）
BAC的优点
尽管BAC的容量最大仅为350kb,但可稳 定遗传,无缺失、重组和嵌合现象。 转化效率高（10*8-10*9转化子/μg DNA）。 基因组DNA容易分离和制备。
重组病毒TK-/gG-/BAC+的 鉴定
M123 1 2 3
重组病毒TK-/gG-/BAC+的 PCR 鉴定
重组病毒TK-/gG-/BAC+的 Southern 杂交鉴定
PrV TK-/gG-/BAC在组织细胞中 的生物学特性
Mean Virus Titer (log10)
8.0
7.0
6.0
5.0
F因子的特性使其作为基因组DNA 的高容量载体具有独特的魅力.
人工染色体(artificial chromosome) 的发展为DNA病毒感染性克隆与反向遗 传操作的建立奠定了技术基础.
YAC
1987年,克隆容量可达几百甚至上 千kb的 酵母人工染色体(Yeast artificial chromosome,YAC)问世,使通过同源重组的 方法在酵母中对基因组大片段的操作成为 可能。但是,YAC内部存在嵌合及重组
F因子的生物学特性
低拷贝数(1-2个分子/细胞)，低拷贝数加 上细胞的隔绝环境,限制了细胞内质粒分子 间的重组
能容纳非常大。自然发生的F因子能携带 1/4的E.coli染色体而不显张力或不稳定。
易于操作。由于F因子呈闭环结构,所以可 以用一些常规的原核基因操作技术将它直 接从E.coli中分离出来。
单点诱变 多点诱变
体外、体内转录技术
体外转录技术是利用RNA聚合酶将基因组 cDNA拷贝转录成RNA
体内转录是将cDNA返回到RNA的过程转移到 细胞内完成
人工引入转录终止。又称为流产转录 （runoff transcription),是人为在基因组 全长cDNA克隆3’端终止RNA聚合酶的合成作用
parA
parB
NotI KpnI
重组病毒PrV TK-/gG-/BAC筛选
Identification of PCR of cat gene of the recombinant virus PrV TK-/gG- containing E.coli F-plasmid sequences. M.DL-2000 marker; Lane 1. pSB301; Lane 2.PK-15 cell control; Lane3-24. viruses isolated from plaque purified.
postinfection and titers were determined by plaque assay in PK-15 cells.
闭合环状的TK-/gG-/BAC基因组转化 E.coli DH10B筛选
Identification of PCR of cat gene of pTKgGBAC M. DL-2000 marker; Lane 1. pSB301; Lane 2. PRV TK-/gG-/lacZ+; Lane 3-14. DNA isolated from 12 bacterial clones.
感染性克隆的构建方法
(以伪狂犬病毒PrV为例)
• 重组质粒的构建. • 重组质粒与病毒基因组的同源重组. • 重组病毒的分离、纯化. • 将含有伪狂犬病毒(PRV)基因组全长克隆的
BAC载体转化E.coli重组缺陷型菌株DH10B. • 含有PRV基因组全长克隆的BAC质粒转染真
核细胞PK-15. • 病变细胞中病毒的收获及鉴定.
2
1.75
1.5
1.25
1
PRV-EaBlue virus PRV-BAC virus
PRV-BAC DNA
As PrV-specific neutralizing antibodies were undetectable after immunization two times in uninfected cells-immunized and transfer plasmid-immunized mice, the titers of neutralizing antibodies of these two groups of mice were not indicated.