【CN109628367A】一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法【专利】
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( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910089489 .7
(22)申请日 2019 .01 .30
(71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号
(72)发明人 周景文 陈坚 刘立 曾伟主 堵国成
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211
2 .根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GDH含有SEQ ID NO .1所述的核苷酸序 列；所述GA-5-DH含有SEQ ID NO .2所述的核苷酸序列；所述XDH2含有SEQ ID NO .3所述的核 苷酸序列；所述ALDH含有SEQ ID NO .4所述的核苷酸序列；所述XDH含有SEQ ID NO .5所述的 核苷酸序列；所述sDH SLC含有SEQ ID NO .6所述的核苷酸序列；所述PTS含有SEQ ID NO .7 所述的核苷酸序列；所述PQQ-dependent DH3含有SEQ ID NO .8所述的核苷酸序列；所述 NADH-DH含有SEQ ID NO .9所述的核苷酸序列；所述NADH-dependent ADH含有SEQ ID NO .10 所述的核苷酸序列。
比野生菌提高了4 .47％，生产强度为14g/L·h，
相比于野生菌提高了14 .7％，果糖副产物含量仅 为5 .6g/L，和野生菌相比下降了45 .6％。
(10)申请公布号 CN 109628367 A (43)申请公布日 2019.04.16
权利要求书1页 说明书7页 序列表9页
CN 109628367 A
代理人 张勇
(51)Int .Cl . C12N 1/21(2006 .01) C12N 15/53(2006 .01) C12P 19/02(2006 .01) C12R 1/01(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和
生产强度的方法 ( 57 )摘要
本发明公开了一种提高氧化葡萄糖酸杆菌 山梨糖产量和生产强度的方法，属于发酵工程技 术领域。本发明通过敲除氧化葡萄糖酸杆菌中D山梨醇或L-山梨糖代谢副产物形成相关的基因 ， 降低其副产物的生成，提高了D-山梨醇转化为L山梨糖的效率，从而来提高L-山梨糖的产量和生 产强度。本发明构建的重组菌株G .oxydan-11，相 对于对照菌，L-山梨糖的转化率达到了96 .12％，
2
CN 109628367 A
说 明 书
1/7 页
一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法
技术领域 [0001] 本发明涉及一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法，属于发酵 工程技术领域。
背景技术 [0002] L-山梨糖(L-sorbose)是一种己酮糖，是生产维生素C直接前体2-酮基-L-古龙酸 (2-keto-L-gulonic acid，简称2-KLG)的一种重要原材料。工业生产山梨糖的方法主要是 利用氧化葡萄糖酸杆菌发酵D-山梨醇形成L-山梨糖。山梨糖进一步通过“微生物发酵法”或 者“莱氏法”形成维生素C的直接前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，简称2KLG) ，2-KLG在经内脂化和烯醇化后得到维生素C。因此，D-山梨醇到L-山梨糖的转化率决定 了工业生产维生素C的转化率。 [0003] 氧化葡萄糖酸杆菌是工业生产L-山梨糖的主要菌株，其细胞膜上的山梨醇脱氢酶 可以催化D-山梨醇形成L-山梨糖。除了山梨醇脱氢酶以外，氧化葡萄糖酸杆菌细胞膜上还 含有大量的其他脱氢酶，如葡萄糖脱氢酶等。其中有一部分脱氢酶有较广的底物谱，可以催 化D-山梨醇形成果糖等其他杂糖，影响D-山梨醇到L-山梨糖的转化率。通过基因工程手段 对氧化葡萄糖酸杆菌基因组进行改造 ，将氧化葡萄糖酸杆菌部分脱氢酶基因进行敲除 ，有 望解决在发酵过程中果糖等副产物积累的问题。 [0004] 目前，对于微生物发酵法生产L-山梨糖的研究主要集中在对于氧化葡萄糖酸杆菌 的发酵过程的优化和控制，而对于氧化葡萄糖酸杆菌的基因组的分子改造报道较少。虽然 简单的发酵优化在一定程度上可以减少副产物的产生，但是不能从根本上解决发酵过程中 副产物积累的问题。随着基因测序技术、代谢工程、合成生物学等方法技术的发展，从分子 水平对氧化葡萄糖酸杆菌基因组进行改造，有望从根本上解决传统菌株在发酵过程中的缺 陷。目前，通过代谢工程的方法来过表达山梨醇脱氢酶可以提高山梨糖的生产强度，缩短发 酵周期，但是仅仅过表达山梨醇脱氢酶并不能解决发酵过程中其他脱氢酶催化D-山梨醇形 成 副产物的问 题。鉴于此 ，我 们对氧化葡萄糖酸杆菌代谢途径中可能形成代谢副产物的 脱 氢酶基因进行敲除 ，有效的提高了D-山梨醇的转化率和生产强度。
CN 109628367 A
权 利 要 求 书
1/1 页
1 .一种提高L-山梨糖产量和生产强度的方法，其特征在于，敲除L-山梨糖代谢副产物 形成相关的基因；所述代谢副产物形成相关的基因包括：GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH-DH、NADH-dependent ADH基因中的至少一种。
3 .根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法应用于氧化葡萄糖酸杆菌。 4 .根据权利要求3所述的方法 ，其特征在于 ，所述氧化葡萄糖酸杆菌包括G .oxydans CGMCC 1 .110。 5 .一种产L-山梨糖的基因工程菌，其特征在于，产L-山梨糖代谢途径中合成山梨糖的 主要代谢副产物形成相关的基因被敲除 ；所述主要代谢副产物包括但不限 于果糖 ；所述主 要代谢副产物形成相关的基因包括：GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQdependent DH3、NADH-DH、NADH-dependent ADH基因中的至少一种。 6 .根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以氧化葡萄糖酸杆菌为宿主。 7 .一种构建权利要求5或6所述基因工程菌的方法，其特征在于，分别扩增待敲除的目 的基因在基因组位置上、下游各800～1200bp的序列，并与抗性基因和负向筛选标记基因融 合，构建敲除框：左侧同源臂(HAL)-抗性基因-负向筛选标记基因-右侧同源臂(HAR) ；将敲 除 框连接到载体上 ，转化至宿主的感受态细胞中 ；在含抗性标记物的 培养基中进行首次筛 选，并在含有负向筛选标记物类似物的培养基再次筛选。 8 .根据权利要求7所述的方法，其特征在upp基因，所述负向筛选标记物类似物为5-氟尿嘧啶。 9 .一种生产L-山梨糖的方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的基因工程菌接种至 发酵培养基，在28～30℃，200～220rpm条件下进行发酵培养。 10 .权利要求1～4任一所述的方法或权利要求4～5任一所述的基因工程菌在制备含L山梨糖的产品方面的应用。
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910089489 .7
(22)申请日 2019 .01 .30
(71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号
(72)发明人 周景文 陈坚 刘立 曾伟主 堵国成
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211
2 .根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GDH含有SEQ ID NO .1所述的核苷酸序 列；所述GA-5-DH含有SEQ ID NO .2所述的核苷酸序列；所述XDH2含有SEQ ID NO .3所述的核 苷酸序列；所述ALDH含有SEQ ID NO .4所述的核苷酸序列；所述XDH含有SEQ ID NO .5所述的 核苷酸序列；所述sDH SLC含有SEQ ID NO .6所述的核苷酸序列；所述PTS含有SEQ ID NO .7 所述的核苷酸序列；所述PQQ-dependent DH3含有SEQ ID NO .8所述的核苷酸序列；所述 NADH-DH含有SEQ ID NO .9所述的核苷酸序列；所述NADH-dependent ADH含有SEQ ID NO .10 所述的核苷酸序列。
比野生菌提高了4 .47％，生产强度为14g/L·h，
相比于野生菌提高了14 .7％，果糖副产物含量仅 为5 .6g/L，和野生菌相比下降了45 .6％。
(10)申请公布号 CN 109628367 A (43)申请公布日 2019.04.16
权利要求书1页 说明书7页 序列表9页
CN 109628367 A
代理人 张勇
(51)Int .Cl . C12N 1/21(2006 .01) C12N 15/53(2006 .01) C12P 19/02(2006 .01) C12R 1/01(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和
生产强度的方法 ( 57 )摘要
本发明公开了一种提高氧化葡萄糖酸杆菌 山梨糖产量和生产强度的方法，属于发酵工程技 术领域。本发明通过敲除氧化葡萄糖酸杆菌中D山梨醇或L-山梨糖代谢副产物形成相关的基因 ， 降低其副产物的生成，提高了D-山梨醇转化为L山梨糖的效率，从而来提高L-山梨糖的产量和生 产强度。本发明构建的重组菌株G .oxydan-11，相 对于对照菌，L-山梨糖的转化率达到了96 .12％，
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CN 109628367 A
说 明 书
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一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法
技术领域 [0001] 本发明涉及一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法，属于发酵 工程技术领域。
背景技术 [0002] L-山梨糖(L-sorbose)是一种己酮糖，是生产维生素C直接前体2-酮基-L-古龙酸 (2-keto-L-gulonic acid，简称2-KLG)的一种重要原材料。工业生产山梨糖的方法主要是 利用氧化葡萄糖酸杆菌发酵D-山梨醇形成L-山梨糖。山梨糖进一步通过“微生物发酵法”或 者“莱氏法”形成维生素C的直接前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，简称2KLG) ，2-KLG在经内脂化和烯醇化后得到维生素C。因此，D-山梨醇到L-山梨糖的转化率决定 了工业生产维生素C的转化率。 [0003] 氧化葡萄糖酸杆菌是工业生产L-山梨糖的主要菌株，其细胞膜上的山梨醇脱氢酶 可以催化D-山梨醇形成L-山梨糖。除了山梨醇脱氢酶以外，氧化葡萄糖酸杆菌细胞膜上还 含有大量的其他脱氢酶，如葡萄糖脱氢酶等。其中有一部分脱氢酶有较广的底物谱，可以催 化D-山梨醇形成果糖等其他杂糖，影响D-山梨醇到L-山梨糖的转化率。通过基因工程手段 对氧化葡萄糖酸杆菌基因组进行改造 ，将氧化葡萄糖酸杆菌部分脱氢酶基因进行敲除 ，有 望解决在发酵过程中果糖等副产物积累的问题。 [0004] 目前，对于微生物发酵法生产L-山梨糖的研究主要集中在对于氧化葡萄糖酸杆菌 的发酵过程的优化和控制，而对于氧化葡萄糖酸杆菌的基因组的分子改造报道较少。虽然 简单的发酵优化在一定程度上可以减少副产物的产生，但是不能从根本上解决发酵过程中 副产物积累的问题。随着基因测序技术、代谢工程、合成生物学等方法技术的发展，从分子 水平对氧化葡萄糖酸杆菌基因组进行改造，有望从根本上解决传统菌株在发酵过程中的缺 陷。目前，通过代谢工程的方法来过表达山梨醇脱氢酶可以提高山梨糖的生产强度，缩短发 酵周期，但是仅仅过表达山梨醇脱氢酶并不能解决发酵过程中其他脱氢酶催化D-山梨醇形 成 副产物的问 题。鉴于此 ，我 们对氧化葡萄糖酸杆菌代谢途径中可能形成代谢副产物的 脱 氢酶基因进行敲除 ，有效的提高了D-山梨醇的转化率和生产强度。
CN 109628367 A
权 利 要 求 书
1/1 页
1 .一种提高L-山梨糖产量和生产强度的方法，其特征在于，敲除L-山梨糖代谢副产物 形成相关的基因；所述代谢副产物形成相关的基因包括：GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH-DH、NADH-dependent ADH基因中的至少一种。
3 .根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法应用于氧化葡萄糖酸杆菌。 4 .根据权利要求3所述的方法 ，其特征在于 ，所述氧化葡萄糖酸杆菌包括G .oxydans CGMCC 1 .110。 5 .一种产L-山梨糖的基因工程菌，其特征在于，产L-山梨糖代谢途径中合成山梨糖的 主要代谢副产物形成相关的基因被敲除 ；所述主要代谢副产物包括但不限 于果糖 ；所述主 要代谢副产物形成相关的基因包括：GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQdependent DH3、NADH-DH、NADH-dependent ADH基因中的至少一种。 6 .根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以氧化葡萄糖酸杆菌为宿主。 7 .一种构建权利要求5或6所述基因工程菌的方法，其特征在于，分别扩增待敲除的目 的基因在基因组位置上、下游各800～1200bp的序列，并与抗性基因和负向筛选标记基因融 合，构建敲除框：左侧同源臂(HAL)-抗性基因-负向筛选标记基因-右侧同源臂(HAR) ；将敲 除 框连接到载体上 ，转化至宿主的感受态细胞中 ；在含抗性标记物的 培养基中进行首次筛 选，并在含有负向筛选标记物类似物的培养基再次筛选。 8 .根据权利要求7所述的方法，其特征在upp基因，所述负向筛选标记物类似物为5-氟尿嘧啶。 9 .一种生产L-山梨糖的方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的基因工程菌接种至 发酵培养基，在28～30℃，200～220rpm条件下进行发酵培养。 10 .权利要求1～4任一所述的方法或权利要求4～5任一所述的基因工程菌在制备含L山梨糖的产品方面的应用。