微生物基础：革兰阴性杆菌 倪语星

大肠埃希菌
形态特征
革兰阴性直短杆状， 多数有鞭毛，能运动， 某些菌株尤其是引起 肠外感染的菌株有荚 膜（微荚膜）和周身 菌毛。
大肠埃希菌革兰染色
培养特性
兼性厌氧，营养要求不 高，在普通营养琼脂上 生长良好，形成较大的 圆形、光滑、湿润、灰 白色的菌落，在血琼脂 上某些菌株可产生β-溶 血。
大肠埃希菌菌落特征（血平板）
非发酵菌的基本鉴定要求
• 1、缺少糖发酵的证据，通常是在KIA或TSI 培养基中无酸产生，斜面和底部均呈红色。
• 2、氧化酶阳性（不动杆菌、嗜麦芽窄食单 胞菌、唐菖蒲伯克菌、浅黄华丽单胞菌、 栖稻黄素单胞菌阴性）。 • 3、麦康凯上生长很差或不生长
重要的鉴定试验
• 1、葡萄糖利用（OF试验） OF培养基 • 2、动力 半固体培养基 更准确的方法是湿片法和鞭毛染色。 • 3、色素形成 非发酵菌可形成多种色素，有助于菌种的 鉴定。
• 肺炎克雷伯菌肺炎亚种还能引起各种肺外 感染，包括肠炎和脑膜炎（婴儿），泌尿 道感染（儿童和成人）及菌血症。 • 近年在一些亚洲地区（特别是台湾和韩国） 由肺炎克雷伯菌引起的肝脓肿等严重社区 获得性侵袭性感染有上升的趋势。
大肠埃希菌和克雷伯菌属 的主要耐药机制
• 产生超广谱β内酰胺酶（ESBL）。 • 一旦产生ESBL，即对所有的青霉素类、头 孢菌素类和氨曲南耐药， • 但对碳青霉稀类、β内酰胺/酶抑制剂复合类 抗菌药物和头霉烯类敏感。
铜绿假单胞菌
• 分布广泛，是非发酵菌中最具临床意义的细菌，也是 医院内感染最多见的细菌，主要引起条件感染。
• 感染多发生于烧伤、急性白血病、器官移植病人及静 脉药瘾者，感染多位于潮湿部位，如气管造口、留置 的导管、创面、外耳道、角膜和渗出性皮肤伤口处 • 囊性纤维化病人呼吸道分离的铜绿假单胞菌具有生物 膜（其产生的大量藻酸盐包围了菌体所致），导致本 病的治疗困难和高死亡率。 • 其淡蓝色脓性渗出物及闻到绿脓素的生姜样气味具有 特征性。
铜绿假单胞菌的耐药性
• 耐药机制
–外膜通透性降低 –产生灭活酶或钝化酶 –主动外排系统将抗菌药物泵出胞外
• 本菌对氨苄西林、安美汀、四环素、优力新、 一、二代头孢菌素、头霉素、大环内酯类、磺 胺等天然耐药 • 各种抗菌药物治疗铜绿假单胞菌所致感染过程 中都可能发生耐药。
1994-2005年 3764株铜绿假单胞菌敏感率
在MAC培养 基上发酵乳 糖产酸，形 成较大的粘 液型、红色 的菌落，红 色可扩散至 菌落周围的 培养基中。
肺炎克雷伯菌的菌落特征（MAC）
用接种针沾取时可挑出长丝状细丝
肺炎克雷伯菌粘丝试验
克雷伯菌属与其他条件致病菌鉴别
克雷伯菌属 生化反 应 肺炎克 雷伯菌 － － + － － － － + + + + + 产酸克 雷伯菌 + － + － － － － + + + + + 肠杆菌属 产气肠 杆菌 － + + － + － － + + + + + 阴沟肠 杆菌 － + － + + － － + + + （－） + 泛菌属 成团 泛菌 （－） （+） － － － － － d d d － + 哈夫尼菌 属 蜂房哈 夫尼菌 － （+） + － + － － － － － － + 粘质 沙雷菌 － + + － + + + － + + d － 沙雷菌属 液化 沙雷菌 － + + － + （+） + － + + － +
四、微生物学检验
• 标本采集 1．肠外标本
采自不同的感染部位如血液、体液、呼吸道、 伤口、尿液及其他各种标本。
2．肠道标本
宜在疾病的早期留取新鲜的粪便标本，挑取 其中的脓血和粘液部分进行粪便培养。
1. 科间鉴别
肠杆菌科细菌与其它革兰阴性杆菌的区别
试 验 葡萄糖 氧化酶 形态 鞭毛 肠杆菌 科 发酵 － 杆状 周鞭毛 或无 弧菌科 发酵 ＋ 弧状、杆 状 单鞭毛 非发酵菌 氧化或不分 解 ＋ 杆状 单、丛、周 鞭毛或无 巴斯德 菌科 发酵 ＋ 球杆状 无鞭毛
生物学特性
• 细长革兰阴性杆菌， 极单鞭毛，严格需氧，氧 化利用葡萄糖、 MAC生长 • 在普通琼脂平板上产生特征性的蓝绿色水溶性绿 脓素和黄绿色青脓素（荧光假单胞菌和恶臭假单 胞菌也可产生） • 血平板上形成大而扁平，湿润，边缘不齐，有金 属光泽，有生姜气味的灰绿色菌落，并形成透明 溶血环 • 最适生长温度35℃，4℃不生长，42℃可生长
全国基层医疗机构抗 菌药物合理利用培训
微生物基础：革兰阴性杆菌
倪语星
上海交通大学医学院附属瑞金医院
• 临床常见的革兰阴性杆菌主要分为两大群 • 肠杆菌科 • 非发酵菌群
肠杆菌科（Enterobactericaeae）
一、概述
• 包括致病性较强、能引起人类传染病的菌属-鼠疫耶尔森菌、伤寒沙门菌 • 能引起人类腹泻和肠道感染的菌属 • 埃希菌属 • 志贺菌属 • 沙门菌属 • 耶尔森菌属
• 约有40种以上肠杆菌科的菌种可以在临床标本中 出现。
二、临床意义
• 可致化脓性疾病、肺炎、脑膜炎、菌血症以 及伤口、泌尿道和肠道的感染。其中有些细 菌是引起医院感染的重要病原。 • 本科细菌占临床分离菌总数的50％和临床分 离的革兰阴性杆菌总数的80％， • 将近50％的菌血症、70％以上的泌尿道感染 和大量的肠道感染由肠杆菌科细菌引起。
Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing－CLSI
ESBL菌株的治疗原则
1、当怀疑产ESBL时，不管体外敏感与 否，应避免使用头孢菌素。 2、第四代头孢菌素仍未能解决ESBL的 问题，原则上，用它们治疗产ESBL 菌株是不安全的。 3、可以用头霉菌素、碳青霉烯类、-内 酰胺酶抑制剂复方制剂。
吲哚 动力 赖氨酸 精氨酸 鸟氨酸 Dnase （25℃） 明胶酶 （22℃） 乳糖 蔗糖 山梨醇 侧金盏 花醇 阿拉伯糖
临床意义
克雷伯菌属的细菌多感染免疫力低 下的人群，是医院感染中最重要的条件 致病菌。 所致疾病：肺炎、脑膜炎、腹膜炎、 泌尿系统感染、败血症
• 肺炎克雷伯菌是临床标本中常见的细菌， 可引起典型的原发性肺炎。该菌在正常人 口咽部的带菌率为1%～6%，在住院病人中 可高达20%，是酒精中毒者、糖尿病和慢 性阻塞性肺部疾病患者并发肺部感染的潜 在的危险因素。
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 94 95 96 98 99 0 1 2 3 4 5
IPM FEP CAZ CSL TZP
NPRS data
针对铜绿假单胞菌严重感染
为什么联合应用抗生素？
扩大抗菌谱？ 限制耐药产生?
1、联合用药 方案
如何联合(革兰阴性菌)?
b-lactam ＋ Amikacin 或 Ciprofloxacin
（一）人类肠道外感染
• 除志贺菌外，许多肠杆菌科细菌均可引起 肠外感染，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、 产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌、产气肠杆 菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌等均可引起 泌尿道、呼吸道、伤口和中枢神经系统的 感染，且往往为医院感染。 • 鼠疫耶尔森菌能引起甲类传染病：鼠疫。
（二）人类肠道感染
肠杆菌属细菌常产生AmpC酶，尤以 阴沟肠杆菌最为突出。是导致革兰阴性菌 对1～3代头孢菌素、单环β-内酰胺类、头 霉素类及含酶抑制剂的复合制剂耐药的重 要原因。 产AmpC酶细菌的治疗，首选4代头孢 （头孢吡肟）和碳青霉烯类抗菌药物。 近年发现已有质粒介导的AmpC酶出 现，主要影响大肠和肺炎克雷伯菌。
在肠道选择培养 基上可发酵乳糖， 形成有色菌落。
大肠埃希菌菌落特征（MAC）
临床意义
• 肠道外感染：泌尿道感染（最常见）
胆道感染、腹膜炎、肺炎 菌血症、新生儿脑膜炎 • 肠道感染： ETEC、EPEC、EIEC、 EHEC
肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）
又可分为3个亚种： 肺炎亚种（subsp. pneumoniae） 臭鼻亚种（subsp. ozaenae） 鼻硬结亚种（subsp. rhinoscleromatis）
– – – – 发酵葡萄糖（产酸或产酸产气）、 触酶阳性、 氧化酶阴性、 可将硝酸盐还原至亚硝酸盐。
肠杆菌科的共同特性
1. 形态染色相似：革兰阴性杆菌
2. 培养特性相同：普通培养基上生长良好 3. 生化反应活泼：发酵葡萄糖，氧化酶阴性，触 酶阳性，还原硝酸盐为亚硝酸盐，O/F试验为 发酵型。 4. 抗原构造复杂 5. 抵抗力弱 6. 易变异
非发酵革兰阴性杆菌
概述
• 非发酵菌是一群需氧、无芽胞、氧化分解 利用糖类或是不利用糖做为能量来源的革 兰阴性杆菌。
分类、命名
主要的菌属： 假单胞菌属（Pseudomonas) 产碱杆菌属（Alcaligenes) 无色杆菌属（Achromobacter) 不动杆菌属（Acinetobacter) 莫拉菌属（Moraxella) 金氏杆菌属（Kingella) 黄杆菌属（Flavobacterium） 窄食单胞菌属（Xanthomonas) 丛毛单胞菌属（Comamonas)
（一）形态结 构革兰阴性杆 菌，无鞭毛， 无芽胞
肺炎克雷伯菌革兰染色
病人标本直 接涂片或在 营养丰富培 养基上的培 养物可见菌 体外有明显 的荚膜。
肺炎克雷伯菌荚膜染色
（二）培养特性 兼性厌氧，营养 要求不高，在初 次分离培养基可 形成较大、凸起 灰白色粘液型的 菌落。菌落大而 厚实、光亮，相 邻菌落容易发生 融合 肺炎克雷伯菌的菌落特征 （血琼脂平板）
菌株的治疗原则
针对ESBL特性和耐药特点，推荐使用 （1）碳青霉烯类抗菌药物，如亚胺培南/西司他丁 （2）氨基糖甙类抗菌药物，如阿米卡星 （3）头霉烯类抗菌药物，如头孢西丁、头孢美唑 （4）-内酰胺酶/酶抑制剂，如头孢哌酮/舒巴坦
肠杆菌属
是肠杆菌科中最常见的环境菌群， 医院感染的重要病原菌。在临床微生物 室检出率最高的是阴沟肠杆菌和产气肠 杆菌，可引起泌尿道感染、呼吸道感染、 伤口感染以及败血症。
2. 肠杆菌科分组
• 首先根据苯丙氨酸脱氨酶和VP试验，将肠杆菌科 14个菌属分为三个组： 1）苯丙氨酸脱氨酶阴性和VP试验阴性：埃希菌属、 志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸菌属和爱德华菌属。 2）苯丙氨酸脱氨酶阴性和VP试验阳性：克雷伯菌 属、肠杆菌属、哈夫尼亚菌属、泛菌属、沙雷菌 属、耶尔森菌属。 3）苯丙氨酸脱氨酶阳性和VP试验阴性：变形杆菌 属、摩根菌属、普罗威登斯菌属。
ESBL的耐药特点
• 水解青霉素，一代、二代和三代头孢菌及单酰胺 类（氨曲南）药物，产生ESBL的细菌对上述抗菌 药物耐药。 • 对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类等多种抗菌药 物往往也同时具有耐药性 • 四代头孢 ?
以下情况提示产ESBLs菌感染
肠杆菌科细菌，尤其大肠、克雷伯菌
对一个或多个三代头孢敏感性下降
• 肠杆菌科细菌也是人和动物肠道感染的重 要病原。 • 虽然本科中许多细菌均与腹泻有关，但比 较明确的肠道病原菌是肠杆菌科中的埃希 菌属、志贺菌属、沙门菌属和耶尔森菌属。 • 主要引起各种急、慢性肠道Байду номын сангаас染、食物中 毒、旅行者腹泻及肠热症等。
三、生物学特性
肠杆菌科细菌具有以下共同的生物学特性： 1、形态特征：革兰阴性杆状或球杆状、无芽胞、多 数有鞭毛，能运动，有致病性的菌株多数有菌毛； 2、培养特性：需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在 普通培养基和麦康凯培养基上生长良好； 3、生化特性：
与医院感染有关的条件致病菌
• • • • 枸橼酸杆菌属 克雷伯菌属 肠杆菌属 泛菌属 • • • • 沙雷菌属 变形杆菌属 普罗威登菌属 摩根菌属
• 有许多细菌既是肠道的正常菌群，也是条件致病 菌。
• 在一定的条件下，能引起机会感染或二重感染。
– 1）机体抵抗力下降 – 2）寄居部位的改变
– 3）肠道菌群失调
常伴有氨基糖苷、喹诺酮多重耐药 三代头孢用药史 对头孢呋新耐药 对碳青霉烯敏感
头霉素、部分酶抑制剂有效
三、四代头孢临床治疗效果不好
ESBL敏感报告
临床分离到大肠埃希菌或克雷伯菌属细菌，均应检测是否产ESBL， 如确认为产ESBL菌株，不管体外药敏试验的结果如何，对所有头孢菌 素和氨曲南均应报告耐药。对头霉素和碳青霉烯类按实际报告。