分子生物学的研究方法
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²P1、P4为基因 两端的引物;
²P2、P3 为基因 中间的两个互补 引物，这两个互 补引物中引入有 突变位点。
AD RNA polymerse Promoter
A
B C
² 已被作为一种简便和有效的工具广泛用于基因功能 的研究。
定点诱变时必须先了解两个信息
1. 要改变的基因编码区精确的核苷酸序列 2. 要引入的氨基酸的变化
M13+strand
5’P
Oligonucleotide
ATTCGG
G AAGCC
Mismatched nucleotide
3’OH
Klenow fragment, dNTPs
2. 之后将“中靶”的胚胎干细胞移植回小鼠囊胚(受精卵 分裂至8个细胞左右即为囊胚, 此时受精卵只分裂不分 化)，移植进去的中靶胚胎干细胞钻入囊胚胚层, 与囊 胚一起分化发育成相应的组织和器官；
3. 最后诞生出具有基因功能缺陷的“嵌合鼠”。由于中靶 的胚胎干细胞保持分化的全能性, 因此它可以发育成为 嵌合鼠的生殖细胞, 使得经过定向改造的遗传信息可以 代代相传。
² 也可以通过转基因的方法，在动物体内实现特异、 稳定、长期地抑制靶基因的表达，从而在整体水平 上研究基因的功能。
² 若将RNAi技术与Cre/loxP重组系统以及基因表达调 控系统相结合，建立转基因动物模型，则不仅具有 稳定、可遗传、可诱导等特点，而且无需使用胚胎 干细胞技术和基因打靶技术，与基因敲除相比具有 简单、易操作、周期短等优势。
² 前3种方法是在体外制备然后导入到细胞中；后两种则 是基于具有合适启动子的载体或转录元件，在哺乳动物 或细胞中转录生成。
² 目前多采用RNA聚合酶Ⅲ启动子构建siRNA的表达载体 或表达框架，常用的RNA聚合酶Ⅲ的启动子有人、鼠U6 启动子、人H1启动子。
² 研究者既可以将siRNA导入特定细胞，在细胞水平 上研究基因的功能；
² siRNA识别mRNA链上的同源区域之后，结合一个核酶 复合物形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induce silencing complex，RISC）；
² RISC定位到靶mRNA转录本上，并在距离siRNA 3’端 12个碱基的位置切割mRNA。
RNAi
的 作 用 机 制 示 意 图
ATTCGG
AAGCC
G
T4 DNA ligase
Transformation E.coli
Produce M13 plaques
ATTCGG M13+strand
CTTCGG
重叠延伸诱变 (Overap-extention PCR based site directed mutation)
²P1、P2 、P3、 P4 四个引物;
基 因 打 靶 的 原 理 示 意 图
Cre/loxP系统作用原理示意图
2、基因沉默可以使基因的功能部分缺失
RNAi的作用机制：
² 外源dsRNA可直接被导入细胞，或者通过转基因、病毒 感染等方式进入细胞，并整合到基因组中获得表达；
² 各种来源的dsRNA被核酸酶RNaseⅢ家族中，特异识别 dsRNA的Dicer酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割成 长约21~23nt的双链小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)；
转基因动物模型仍存在一些亟待解决的问题：
1.外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插 入突变，破坏宿主基因组功能；
2.外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等； 3.整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状
的不稳定遗传等。
2. 转基因技术在不断完善
基因打靶的原理和基本步骤
1. 首先, 从小鼠囊胚分离出未分化的胚胎干细胞, 然后利 用细胞内的染色体DNA可以与导入细胞的外源DNA，在相 同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有正-负筛 选标记的打靶载体，对胚胎干细胞中的特定基因实施 “打靶”；
抗生物素包埋的微磁珠
转基因动物制作原理示意图
优点：
1.利用转基因动物模型研究外源基因，能 够接近真实地再现基因表达所导致的结 果，及其在整体水平的调控规律，把复 杂的系统简单化，具有系统性和独立性， 是目前层次最高的实验体系。
2.利用转基因技术建立的疾病动物模型具 有遗传背景清楚、遗传物质改变简单、 更自然更接近疾病的真实症状等优点。
²P2、P3 为基因 中间的两个互补 引物，这两个互 补引物中引入有 突变位点。
AD RNA polymerse Promoter
A
B C
² 已被作为一种简便和有效的工具广泛用于基因功能 的研究。
定点诱变时必须先了解两个信息
1. 要改变的基因编码区精确的核苷酸序列 2. 要引入的氨基酸的变化
M13+strand
5’P
Oligonucleotide
ATTCGG
G AAGCC
Mismatched nucleotide
3’OH
Klenow fragment, dNTPs
2. 之后将“中靶”的胚胎干细胞移植回小鼠囊胚(受精卵 分裂至8个细胞左右即为囊胚, 此时受精卵只分裂不分 化)，移植进去的中靶胚胎干细胞钻入囊胚胚层, 与囊 胚一起分化发育成相应的组织和器官；
3. 最后诞生出具有基因功能缺陷的“嵌合鼠”。由于中靶 的胚胎干细胞保持分化的全能性, 因此它可以发育成为 嵌合鼠的生殖细胞, 使得经过定向改造的遗传信息可以 代代相传。
² 也可以通过转基因的方法，在动物体内实现特异、 稳定、长期地抑制靶基因的表达，从而在整体水平 上研究基因的功能。
² 若将RNAi技术与Cre/loxP重组系统以及基因表达调 控系统相结合，建立转基因动物模型，则不仅具有 稳定、可遗传、可诱导等特点，而且无需使用胚胎 干细胞技术和基因打靶技术，与基因敲除相比具有 简单、易操作、周期短等优势。
² 前3种方法是在体外制备然后导入到细胞中；后两种则 是基于具有合适启动子的载体或转录元件，在哺乳动物 或细胞中转录生成。
² 目前多采用RNA聚合酶Ⅲ启动子构建siRNA的表达载体 或表达框架，常用的RNA聚合酶Ⅲ的启动子有人、鼠U6 启动子、人H1启动子。
² 研究者既可以将siRNA导入特定细胞，在细胞水平 上研究基因的功能；
² siRNA识别mRNA链上的同源区域之后，结合一个核酶 复合物形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induce silencing complex，RISC）；
² RISC定位到靶mRNA转录本上，并在距离siRNA 3’端 12个碱基的位置切割mRNA。
RNAi
的 作 用 机 制 示 意 图
ATTCGG
AAGCC
G
T4 DNA ligase
Transformation E.coli
Produce M13 plaques
ATTCGG M13+strand
CTTCGG
重叠延伸诱变 (Overap-extention PCR based site directed mutation)
²P1、P2 、P3、 P4 四个引物;
基 因 打 靶 的 原 理 示 意 图
Cre/loxP系统作用原理示意图
2、基因沉默可以使基因的功能部分缺失
RNAi的作用机制：
² 外源dsRNA可直接被导入细胞，或者通过转基因、病毒 感染等方式进入细胞，并整合到基因组中获得表达；
² 各种来源的dsRNA被核酸酶RNaseⅢ家族中，特异识别 dsRNA的Dicer酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割成 长约21~23nt的双链小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)；
转基因动物模型仍存在一些亟待解决的问题：
1.外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插 入突变，破坏宿主基因组功能；
2.外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等； 3.整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状
的不稳定遗传等。
2. 转基因技术在不断完善
基因打靶的原理和基本步骤
1. 首先, 从小鼠囊胚分离出未分化的胚胎干细胞, 然后利 用细胞内的染色体DNA可以与导入细胞的外源DNA，在相 同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有正-负筛 选标记的打靶载体，对胚胎干细胞中的特定基因实施 “打靶”；
抗生物素包埋的微磁珠
转基因动物制作原理示意图
优点：
1.利用转基因动物模型研究外源基因，能 够接近真实地再现基因表达所导致的结 果，及其在整体水平的调控规律，把复 杂的系统简单化，具有系统性和独立性， 是目前层次最高的实验体系。
2.利用转基因技术建立的疾病动物模型具 有遗传背景清楚、遗传物质改变简单、 更自然更接近疾病的真实症状等优点。