高效液相色谱方法的验证

方法验证的内容
• 准确度 • 精密度 • 专属性 • 检测限 • 定量限 • 线性和范围 • 耐用性
准确度
定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。
1. 主成分含量测定
原料药：对照品或方法比对
制剂、中药：标准加样回收 2. 杂质定量
杂质对照品 方法比对 杂质与主成分的相对含量
S h =
P
N hbaselinenoise
测定：将一对照品储备溶液，逐步稀释，分别进样分析，计算相应 色谱峰高hp和平均基线噪音（h baseline noise）之比。通常报告进样质量 或进样体积（需与样品制备方法相关）。
线性和范围
线性ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ在设计范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关 系的程度。
专属性
定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。
1. 鉴别反应
2. 含量测定
杂质测定 限量检查
测定： 空白制剂，模拟复方
加速破坏试样测试
DAD峰纯度检查
检测限和定量限
检测限（LOD）：供试品中被测物能被检测出的最低量。 通常采用信噪比3:1或2:1
定量限（LOQ）: 供试品中被测物能被定量测定的最低量。 通常采用信噪比10:1
分析方法研究和验证中使用的标准物质
• 对照品（一级标准） • 工作标准（二级标准） • 非法定对照品
杂质分析
新原料药和新制剂中的杂质研究 国家有关新药申报要求 ICH文本：Q3A, Q3B
仪器要求：
1. 检测灵敏度：波长，灯 能量，流通池，进样量 等其它色谱条件
2. 数据处理：积分参数
• 采用对照品，或相对保留时间定位 • 采用DAD或MWD确定UV光谱或不同波长的检测情况 • 测定对主成分的相对响应因子（0.9~1.1）
测定：加样回收（n≥9）
回收率 % = C − A ×100% B
A: 试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%）
B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%）
C: 试验测定值
精密度
定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得 结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差
1. 重复性（n≥9） 2. 中间精密度 3. 重复性
测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制 备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。
同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进 样精密度，不能作为方法精密度。
高效液相色谱方法的验证
• 方法验证的目的 • 方法验证的内容 • 方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的
目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。
方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案， 有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用 试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测 项目会有不同的验证要求。
范围：在能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限 浓度或量的区间。
测定： 至少5个浓度（n≥5） ，每个浓度进样3次，以3次进样的平均 峰面积对样品浓度进行线性回归。
耐用性
定义：在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。
测定： 供试品溶液的稳定性（溶剂，温度，时间等） 进样量 流动相组成比例，pH 不同牌号的同类型色谱柱，柱温，流速 检测波长（最大吸收波长位移范围，及吸收强度的变化等）