单分子免疫检测
单分子免疫检测平台安全操作及保养规程
单分子免疫检测平台安全操作及保养规程前言单分子免疫检测平台是一种先进的生物学研究仪器，常用于蛋白质、核酸等生物分子的检测和研究。
在正式使用前，需要做好安全操作和保养管理，以确保仪器的正常工作和使用寿命。
本文将详细介绍单分子免疫检测平台的安全操作及保养规程。
1. 安全操作1.1 设备检查在使用前，需要检查设备是否完好，主要包括以下几个方面：•设备外观是否完好，有无破损；•设备电源和电源线路是否正常，接地是否良好；•设备液氮水平是否正常，低于警戒线需及时添加液氮；•设备控制系统和软件是否可以启动和使用，是否需要更新。
1.2 准备工作在使用前，需要做好以下准备工作：•根据使用手册和实验流程准备好样品和试剂；•将样品和试剂放置在规定的位置，以免混淆和污染；•将设备和使用区域消毒，并做好防护措施，如戴手套、口罩、护目镜等。
1.3 操作手册在使用过程中，需要严格按照操作手册进行，遵循以下几点：•先进行设备的初步预热，等待设备温度稳定；•操作仪器时，要轻拿轻放、操作缓慢，避免人为损坏设备；•在操作过程中，应注意观察和记录相关数据和现象；•实验结束后，需要及时清理和消毒使用区域和设备。
1.4 废物处理在实验过程中，会产生各类废弃物和化学品残渣，需要按照相关规定和标准进行处理，以避免对环境和人员产生危害。
具体处理流程可参考实验室管理制度和相关法规。
2. 保养规程2.1 清洁保养设备在长期使用后，会积累各类污垢和灰尘，严重影响设备的工作效率和寿命。
因此，需要定期对设备进行清洁和保养，具体流程如下：•拆下外壳和内部装置，清理和拆下电子器件；•用专用的清洗剂和器具进行清理，注意避免受潮和挤压；•清理后，将各个部件装好，并进行初步测试。
2.2 液氮添加单分子免疫检测平台常用液氮进行冷却和稳定温度，因此需要及时添加液氮，以确保设备的正常工作。
液氮添加流程如下：•在设备液氮指示灯报警时，先关闭设备和相关电源；•等待设备温度降至室温，打开液氮阀门；•缓慢添加液氮至液面接近警戒线，确保液氮不会喷溅到设备内部和周围环境；•添加完毕后，关闭液氮阀门，等待设备稳定后再重新启动。
单分子免疫检测
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------单分子免疫检测单分子免疫检测11/ 28IVD领域的7大技术创新√ 检测精准度√ 检测便利性√ 检测效率1、三代测序技术：纳米孔单分子测序：Pacific Biosciences和Oxford Nanopore2、单分子免疫检测：Quanterix的Simoa系统和Merck的SMC系统3、数字PCR：ABI（Applied Biosystems）和Bio-Rad4、流式液相芯片：透镜生命和旷博生物5、微流控技术：理邦血气、微点生物、天津微纳芯、博晖创新、博奥生物6、光激发光化学发光技术：科美诊断、爱兴生物7、质谱检测：迪安诊断、金域医学、安图生物2---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢年均仅有1-2个新的生物标志物进入临床应用现有技术的瓶颈极大限制了蛋白生物标志物的发展33/ 28检测水平达到pg/mL或fg/mL级别,甚至单分子?生物分析检测领域，最小极限尺寸-------单分子水平?见“微”知著突破极限 ?超高灵敏蛋白检测：助力揭示微妙生物学事件。
?检测对象：细胞因子等，因浓度极低，pg/mL或fg/mL级别。
4---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 区分健康，风险与疾病个体突破检测极限，不但能诊断疾病，还能预知风险。
单分子免疫检测 PPT
Simoa技术参数
反应体系：2.7 μm抗体包被磁珠+生物素化的检测抗体+链霉亲和素半乳糖甘酶
1个磁珠包被250000个捕获抗体，靶点分子极少的时候，1个磁珠仅补获1个蛋白分子
检测体系： 加入底物的磁珠转移到 Simoa 光盘上。 每个光盘有24个芯片（Array）， 每个芯片 有238000个直径为4.25 μm 的小孔，1个小孔仅能容纳一个磁珠 小孔体系仅有50 fL，在芯 片表面推一层油，一方面除去多余磁珠，另一方面将信号密 封在小孔中。 信号CCD 成像。
4、流式液相芯片：透镜生命和旷博生物
5、微流控技术：理邦血气、微点生物、天津微纳芯、博晖创新、博奥生物
6、光激发光化学发光技术：科美诊断、爱兴生物
7、质谱检测：迪安诊断、金域医学、安图生物
蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢 年均仅有1-2个新的生物标志物进入临床应用
现有技术的瓶颈极大限制了蛋白生物标志物的发展
SMC系统原理
SMC系统检测灵敏度
SMC系统检测灵敏度
单分子免疫检测技术发展瓶颈
（1）稳定性及效率 操作复杂，不稳定。 SiMoA检测时长1小时， SMC检测时长4小时。
（2）成本； 耗材昂贵。
（3）替代的必要性。 作为生物检测技术的极限尺子，单分子检测技术取代现有诊断技术成为市场的主流 是将来体外诊断市场发展的趋势。
2. Simoa可以通过加大稀释倍数，检测房水、玻璃体、眼泪等微量样品 中的炎症因子；
3. Simoa可以在单个细胞中定量蛋白，实现单个胚胎细胞培养上清中的 蛋白检测；
4. Simoa可以在外泌体等稀少样品类型中检测PD1、PD-L1等蛋白；
5. Simoa可以在阿尔兹海默症初期（提前16年），在接近正常人的患者 血清中检测到蛋白标志物NfL
生物制品检测技术的发展趋势如何
生物制品检测技术的发展趋势如何在当今的医学和生命科学领域，生物制品的重要性日益凸显。
从疫苗、血液制品到基因治疗药物，生物制品在预防、诊断和治疗各种疾病方面发挥着关键作用。
然而，要确保这些生物制品的安全性、有效性和质量，离不开先进、准确和可靠的检测技术。
随着科学技术的不断进步，生物制品检测技术也在不断发展和创新，呈现出一系列令人瞩目的趋势。
一、检测技术的灵敏度和特异性不断提高灵敏度和特异性是衡量检测技术性能的重要指标。
在生物制品检测中，对于微量的杂质、污染物或病原体的检测要求越来越高。
例如，在疫苗生产中，需要检测极低浓度的残留宿主细胞蛋白、DNA 等杂质，以避免可能引起的免疫反应。
新一代的检测技术，如基于单分子检测的方法、超高分辨率质谱技术等，能够实现对微量物质的精准检测，大大提高了检测的灵敏度。
同时，特异性的提高也是关键。
特异性不足可能导致假阳性或假阴性结果，从而影响对生物制品质量的判断。
通过优化抗体设计、采用基因测序等技术，可以更准确地识别目标物质，减少非特异性结合，提高检测的准确性和可靠性。
二、多技术联用成为主流单一的检测技术往往存在局限性，难以满足复杂生物制品检测的需求。
因此，多种检测技术的联用成为了发展的趋势。
例如，将高效液相色谱（HPLC）与质谱（MS）联用，可以同时实现对生物制品的分离和定性定量分析；将免疫分析技术与基因检测技术结合，可以更全面地评估生物制品的免疫原性和遗传稳定性。
多技术联用不仅可以发挥每种技术的优势，还能相互补充和验证，提高检测结果的准确性和可信度。
此外，通过整合不同检测平台的数据，还可以实现对生物制品的全面质量控制和风险评估。
三、自动化和智能化检测系统的发展随着生物制品生产规模的不断扩大，对检测效率和准确性的要求也越来越高。
自动化检测系统能够实现样品处理、检测操作和数据分析的全流程自动化，大大减少人为误差，提高检测效率。
例如，自动化的液体处理工作站可以精确地进行样品移液、稀释和加样等操作；自动化的酶联免疫吸附测定（ELISA）系统可以快速完成大量样品的检测。
数字酶联免疫方法学(单分子免疫)
数字酶联免疫方法学(单分子免疫)数字酶联免疫方法学，又称为单分子免疫技术，是一种应用于生物学研究和临床诊断的先进技术。
它可以帮助科研人员更加准确地检测和定量分析微量目标物质，如蛋白质、核酸等，从而推动科学研究和临床应用的进步。
数字酶联免疫方法学的核心是单分子免疫技术，它利用高灵敏度的酶联免疫检测方法，将目标物质与酶标记物结合，通过酶催化反应的产物生成的荧光或颜色信号来间接测定目标物质的含量。
与传统的酶联免疫方法不同的是，数字酶联免疫方法学能够在单个分子水平上进行检测和分析，具有更高的灵敏度和准确性。
数字酶联免疫方法学具有许多优势。
首先，它具有较低的检测限度，能够在低浓度的目标物质中进行可靠的检测。
其次，它可以检测多种不同的目标物质，如蛋白质、核酸等，具有广泛的应用价值。
此外，数字酶联免疫方法学还具有样本处理简便、操作灵活和结果可视化等优点。
在研究领域，数字酶联免疫方法学已经被广泛应用于蛋白质的表达和定量、蛋白质相互作用的研究、细胞信号通路的调控等方面。
它不仅可以提供准确的实验数据，还可以帮助科研人员加深对生命科学的理解。
在临床领域，数字酶联免疫方法学也有着巨大的潜力。
它可以用于早期癌症的诊断、药物治疗效果的监测、感染病原体的检测等。
由于数字酶联免疫方法学在样本处理和分析过程中减少了人为误差，因此可以提供更加准确和可靠的诊断结果，为临床医生的决策提供有力支持。
尽管数字酶联免疫方法学在科研和临床应用方面取得了重大进展，但仍面临着一些挑战。
例如，技术的复杂性和仪器设备的昂贵性限制了其在实际应用中的普及。
此外，对于一些复杂样品的处理方法和分析标准仍需要进一步研究和优化。
总之，数字酶联免疫方法学作为一种高灵敏度、高准确度的检测技术，为生物学研究和临床诊断带来了巨大的突破。
随着技术的不断发展和完善，相信数字酶联免疫方法学将会在科学研究和医学实践中发挥越来越重要的作用，为人们的健康福祉做出更大的贡献。
全自动单分子免疫分析仪
比较全自动单分子 免疫分析仪与传统 免疫分析技术的差 异
02
全自动单分子免疫分析仪结构
仪器外观
仪器采用流线型设计，外观简 洁
仪器尺寸为长43cm，宽20cm ，高19cm
前面板具有清晰的显示屏和功 能键，方便操作
内部结构
仪器内部由高性能的微处理器、存储器和输入输出接口等组成 采用高精度光学检测系统，确保检测结果的准确性
全自动单分子免疫分析仪采用 先进的检测技术，能够实现对 微量样本的高精度测量，提高
检测结果的可靠性。
自动化程度高
该仪器可以实现从样本加载到 检测结果输出的全自动化操作 ，大大降低了人工操作的误差
和成本。
快速高效
全自动单分子免疫分析仪采用 高效的样品处理和检测方法， 可以在短时间内处理大量的样 本，大大缩短了检测周期。
仪器内置真空系统，确保试剂的有效利用
部件功能
真空系统
抽取试剂和样本，确保检测流程的顺畅
微处理器
控制仪器的各个部件，确保检测流程的顺 利进行
存储器
存储检测数据和结果，方便随时查阅
高性能光学系统
对样本进行多角度、高精度的检测
输入输出接口
连接其他设备，实现数据的传输和共享
03
全自动单分子免疫分析仪工作原理
国产化进程
我国全自动单分子免疫分析仪的国产化进程正在加速，国内企业 逐渐实现技术突破和自主创新。
技术趋势
01
灵敏度提升
通过改进仪器结构和检测技术，提高 全自动单分子免疫分析仪的灵敏度， 从而能够检测出更低浓度的生物分子 。
02
多指标并行分析
增加全自动单分子免疫分析仪的检测 指标，实现多种生物分子的并行检测 ，提高检测效率。
单分子免疫检测技术
单分子免疫检测技术摘要：单分子免疫检测技术是近年来免疫学研究的热点之一。
该技术采用单分子水平的检测技术，即通过检测单个免疫分子的信号，实现对生物分子的高灵敏度检测。
本文介绍了单分子免疫检测技术的原理、方法和应用，并探讨了该技术在生物医学研究中的前景。
关键词：单分子、免疫检测、高灵敏度、生物医学研究1. 简介单分子免疫检测技术作为当前生物医学研究的前沿技术，近年来备受关注。
该技术采用高灵敏度的免疫检测方法，能够在单分子水平对生物分子进行检测，有很大的潜力在生物医学领域得到广泛应用。
2. 原理在单分子免疫检测技术中，一般采用分子间距离的检测方法。
这种方法利用特定的荧光标记对目标物质进行标记，然后将标记后的物质压缩到纳米尺度的玻璃管中，实现单分子尺度的检测。
3. 方法（1）样品制备：将待测物质与免疫特异性分子结合，标记待测物质，制备标记物质浓度一定的样品。
（2）玻璃管制备：制备玻璃管并将标记过的待测物质注入玻璃管中，其中玻璃管的内径与样品分子尺寸相当，以便形成单分子水平的检测。
（3）荧光显微镜检测：利用荧光显微镜等高灵敏度的检测设备检测待测物质与特定分子识别物的相互作用，并将其转化成荧光信号。
4. 应用（1）疾病诊断：单分子免疫检测技术可以在高灵敏度下检测生物分子，例如病毒、癌症等生物标志物，有助于疾病的早期诊断。
（2）药物研发：单分子免疫检测技术可以在单分子水平对药物和生物分子之间的相互作用进行检测，有助于快速研发出更加高效的药物。
（3）生物学研究：单分子免疫检测技术在分子生物学、细胞生物学等领域中有着很广泛的应用，例如检测细胞内各种分子的运动、互作等。
5. 展望单分子免疫检测技术具有高灵敏度、高精度等显著优点，因此在生物医学研究中有着广泛的应用前景。
未来，该技术有望应用于更多领域，例如早期癌症筛查、药物研发等领域，同时还有望提高生物医学的研究水平和治疗效果。
随着近年来免疫学的不断发展，单分子免疫检测技术也得到了更多的研究和应用。
elisa包被原理
elisa包被原理ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常见的免疫检测方法，广泛用于疾病诊断、生物化学分析、药物筛选等领域。
该技术通过利用酶的高灵敏度和特异性，在试管中检测目标分子的存在，并通过比色或发光等方法来定量分析。
ELISA检测方法一般有直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等多种形式。
本文将着重介绍夹心ELISA的原理和实验步骤。
一、原理：夹心ELISA （Sandwich ELISA）是一种双抗夹心法，其基本原理是利用两种不同特异性的抗体对目标分子进行夹心检测，其中一种抗体固定在所选的检测板上，另一种抗体标记着特定的酶。
在检测过程中，目标分子会与板上的固定抗体结合，接着与标记抗体结合，并将其特定的酶活性带到检测体系中，最终通过加入底物来产生测定信号。
夹心ELISA的信号强度与检测物的浓度成正比，经过计算后可以获得目标分子的定量信息。
具体来说，夹心ELISA步骤包括以下几个方面：1. 准备试剂和试验板：- 准备特异性的固定抗体，并将其分别涂覆在微孔板表面；- 将剩余的微孔板孔涂覆阻断剂，以避免非特异性的蛋白质粘附在板表面。
2. 样品加入：- 加入待检测的样品或标准样品，并在适当条件下使其与固定抗体结合。
3. 标记抗体加入：- 加入与待检测物品特异性的标记抗体，其酶标记通常为马过氧化物酶（HRP）。
4. 洗涤：- 通过洗涤步骤去除未结合的物质和蛋白质等杂质，以保证检测结果准确可靠。
5. 底物反应：- 加入适当的底物和缓冲溶液，并使用酶标仪检测获得的信号强度。
6. 计算分析：- 根据已知样品的浓度建立标准曲线，并利用标准曲线获得待检测样品的浓度。
二、实验步骤：1. 准备试剂和微孔板：- 预热酶标板至室温，并在孔板中分别涂覆所选特异性抗体，处理空孔作为阴性对照；- 已经涂覆抗体的孔板需要在4℃下保存，以保持活性。
- 制备所需的缓冲溶液、洗涤缓冲液和底物溶液。
单分子免疫体外诊断关键技术
单分子免疫体外诊断关键技术简介单分子免疫体外诊断是一种基于单分子水平的体外诊断技术，通过检测和分析生物样品中的特定分子，如蛋白质、抗体等，来实现疾病的早期诊断和监测。
这项技术具有高灵敏度、高特异性和快速检测等优点，已经在临床医学、生物学研究和药物开发等领域得到广泛应用。
技术原理单分子免疫体外诊断技术主要基于以下原理：1.免疫反应：该技术利用生物样品中的抗原与特异性抗体之间的免疫反应进行检测。
当抗原与抗体结合时，可以产生特定的信号，如荧光信号、电化学信号等。
2.单分子检测：单分子检测是指在实验条件下只能检测到单个分子的技术。
通过使用高灵敏度的仪器设备和适当的探针标记，可以实现对单个抗原或抗体的检测。
3.信号放大：为了提高检测的灵敏度，单分子免疫体外诊断技术通常会采用信号放大的策略。
常用的信号放大方法包括荧光共振能量转移（FRET）、表面增强拉曼散射（SERS）等。
技术流程单分子免疫体外诊断技术的一般流程如下：1.样品处理：首先需要对生物样品进行预处理，如离心、稀释等，以获得适合检测的样品。
2.抗原-抗体反应：将样品与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
可以通过直接结合或间接结合等方式实现。
3.信号检测：利用高灵敏度的仪器设备对抗原-抗体复合物进行检测。
常用的检测方法包括荧光检测、电化学检测、质谱分析等。
4.数据分析：对得到的信号数据进行处理和分析，以确定样品中目标分子的存在与否，并计算其浓度。
5.结果解读：根据数据分析的结果，判断样品中目标分子是否超过了临床阈值，从而给出相应的诊断结果。
应用领域单分子免疫体外诊断技术在医学、生物学和药物开发等领域具有广泛的应用前景，包括但不限于以下几个方面：1.疾病诊断：单分子免疫体外诊断技术可以用于早期癌症的诊断和监测、感染性疾病的检测、遗传性疾病的筛查等。
2.药物开发：该技术可以用于检测药物在体内的代谢过程、评估药物的效果和副作用，为药物开发提供重要的参考数据。
单分子免疫阵列技术
单分子免疫阵列技术单分子免疫阵列技术（Single Molecule Immunoassay, SMIA）是一种高灵敏度的免疫分析技术，可用于检测和定量分析微量生物标志物。
相较于传统的免疫检测方法，单分子免疫阵列技术具有更高的灵敏度、更低的检测限和更广泛的应用范围。
在传统的免疫检测中，通常采用酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）等方法，但存在着检测灵敏度低、检测限高、特异性差等问题。
而单分子免疫阵列技术通过在底物表面固定单个抗体，实现了单分子级别的检测，从而克服了传统方法的局限性。
单分子免疫阵列技术的核心是利用荧光标记的抗体与待测物相互作用，通过观察和记录荧光信号的变化来实现检测。
首先，将待测物样品加到含有单个抗体的基质上，待抗体与待测物结合后，荧光标记的抗体被加入，形成荧光信号。
然后，通过高分辨率显微镜对荧光信号进行观察和记录，进一步分析荧光信号的变化，实现对待测物的定量分析。
相较于传统方法，单分子免疫阵列技术具有以下优势：1. 高灵敏度：单分子级别的检测能力使得该技术对微量生物标志物的检测具有很高的灵敏度，能够准确地检测到低浓度的待测物。
2. 低检测限：由于采用了单分子级别的检测，单分子免疫阵列技术能够实现更低的检测限，可以检测到更微小的样品中的生物标志物。
3. 高特异性：单分子免疫阵列技术通过荧光标记的抗体与待测物结合，具有很高的特异性，能够准确地区分不同的生物标志物。
4. 广泛的应用范围：单分子免疫阵列技术可以应用于多种生物样品的检测，包括血液、尿液、细胞等。
同时，该技术还可以用于疾病的早期诊断、药物筛选、分子生物学研究等领域。
除了以上优势，单分子免疫阵列技术还存在一些挑战和改进空间。
首先，该技术在实际应用中需要使用昂贵的设备和试剂，成本较高。
其次，单分子免疫阵列技术在复杂样品中的检测效果有待提高，因为复杂样品中的干扰物可能会影响荧光信号的检测和分析。
SERS简介
四、拉曼光谱实验
• 拉曼光谱是使用激光 共振拉曼分析系统获 得。实验使用的激发 光波长为632.8nm，采 用相关软件处理拉曼 光谱即可。
PVP
• 是一种非离子型高分 子化合物，是N-乙烯 基酰胺类聚合物中最 具特色，且被研究得 最深、广泛的精细化 学品品种。具有亲水 性易流动白色或近乎 白色的粉末，有微臭。 • 用作气相色谱固定液
实验部分
一、试剂与仪器 碱性磷酸酶、磷酸、硝酸银、氯 化钾、柠檬酸钠、拉曼光谱仪等
碱性磷酸酶（ALP）
2、化学增强机理（CM）
为了解释电磁场增强机理无法解释的现象，研究者 们提出化学增强模型来弥补电磁场增强模型的不足。 目标分子与金属表面之间相互作用形成化学键，是 一种短程作用 作用：化学增强模型主要考察目标分子与SERS之间的 相互作用
电磁场增强对SERS的贡 献最大
四、SERS在生物分析中的应用
3、SERS在DNA检测中的应用
吸附基底DNA 检测（早期）
非标记型 DNA检测 标记型 碱基特征光谱 检测（现代） SERS分子修饰 DNA检测
4、SERS在细胞和细菌检测中的应用
（1）SERS可用于生物体内复杂体系的研究 （2）借助灵敏度和选择性高的SERS标记物研 究细胞 （3）以银或金纳米颗粒作为SERS活性基底， 直接将其涂层到细菌的细胞壁上或吸附到 细胞壁上。
拉曼散射
小结
• 目前，SERS活性基底的制备，是SERS 研究领域的热点，高活性的SERS的发 展不仅可以拓宽SERS的应用范围，还 可以作为SERS理论模型不断推动SERS 技术的发展，我们尝试构建灵敏度高、 重现性好、制作简单的SERS基底，用 于化学和生物分子的分析检测。
免疫学检测技术
第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用
ELISA 基本原理
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并 保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗 体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性， 又保留酶的活性。
免疫球蛋白的功能
抗体（Antibody) 的产生与功能
抗体产生的主要过程
抗体
抗体的制备
注射
抗原（如类毒素）
抗体？ 抗原？
血清
抗体的制备 • 抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含
特异性抗体的血清。 • 多克隆抗体 (PAb)： 多个抗原决定簇免疫机体
所产生的多种抗体的混合物。 • 单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb） ： 只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。
第十四章 免疫学检测技术
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
• 抗原或抗体检测原理： 借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的
各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定 性或定量的检测。
Equivalence – Lattice formation
第一节 免疫学检测技术原理
可作为抗原进行检查的物质：
微生物及其大分子产物 人和动物细胞 人和动物体内的各种大分子 各种半抗原
抗原或抗体检测原理
较早的抗原抗体反应检测方法
1、凝集反应 （Agglutination) 2、沉淀反应 (Precipitation) 3、补体结合试验 (Complement fixation test ) 4、中和试验 (Neutralization test)
2022单分子免疫检测技术助力AD早诊早筛(全文)
2022单分子免疫检测技术助力AD早诊早筛（全文）随着全球老龄化日益严重，痴呆症已成为一项全球性问题。
全球约有5000万痴呆症患者，至2050年该数量预计将超过1.5亿人。
痴呆症严重影响到老年人的认知能力与生活自理能力，给家庭和社会带来了沉重的负担。
在所有痴呆症中，阿尔茨海默病（AD,Alzheimer z sDisease建最为常见的一种类型约占所有痴呆症患者的60%-80%oAD血液检测的需求与痛点AD诊断由于病理机制复杂，影响因素众多，临床精准诊断难度大。
同时由于目前AD尚无特效药，因此临床医生对患者的诊断通常较为慎重。
目前AD诊断主要通过几种不同方法进行辅助诊断,主要包括：神经心理学评估、脑脊液检测，CT/MRI常规影像学检查以及以Aβ和tau-PET为主的靶向分子影像学诊断方法。
然而,由于评估量表存在主观判断问题，受到评估者临床经验与判断能力的较大影响；脑脊液采集难度，采集过程的有创损害，以及国内临床资源的限制，脑脊液难以大规模普及。
基于脑脊液的检测和诊断目前主要集中在需要入院治疗的重度痴呆群体中，难以在门诊有效应用；CT/MRI等常规影像学检查仅能反映大脑的结构变化,对AD的精准诊断存在困难。
PET设备成本昂贵、设备运行效率较低，同时受到Aβ和P-tau示踪剂的应用限制，因此该方法在AD诊断中难以广泛普及。
图1AD诊断方法与上述三种诊断方法相比，血液样本稳定性较好，易于采集，血液中生物标志物浓度较为均一稳定，是一种理想的检测样本。
AD血液生物标志物，尤其是ATN框架相关的Aβ.P-tau以及神经损伤相关生物标志物，在过去几年的研究中，血液标志物作为临床辅助AD诊断手段的证据质量显著上升。
血液中的AD生物标志物由于主要来自脑脊液，这些生物标志物在穿过血脑屏障进入血液后，通常浓度大幅度下降，显著增加检测难度，需要超过传统免疫检测技术灵敏度的新型检测平台支持，才真正有可能在临床领域有效应用。
单分子免疫检测技术研究进展
中国生物工程杂志China Biotechnology,2021，41 (4) :47-54D0I：10. 13523/j.cb.2101006单分子免疫检测技术研究进展+张雪洁汤家宝李廷栋#葛胜祥(厦门大学公共卫生学院分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心医用生物制品省部共建协同创新中心厦门361102)摘要早诊断、早发现、早治疗是提升肿瘤患者生存率的主要手段。
临床常用的免疫学检测方法如酶联免疫吸附法、化学发光法等，其检测灵敏度多限制在丨〇_14 ~ HT12mol/L,无法满足早期诊断的需求。
单分子免疫检测法，可将待检测分子限制在极小空间范围内（n L以下），对检测信号进行绝对计数，从而实现痕量（可达10_18mol/L)标志物的检测。
这一超高灵敏度技术实现的关键在于将检测范围限制在极小体积内。
经过数十年发展，不论是物理隔离还是利用纳米孔，抑或通过改进显微镜性能，均可在极小体积内（HT21L)对信号进行检测。
目前基于微阵列的Sim oA检测系统已成为单分子免疫检测的金标准，Quanterix公司基于此开发的HD-1分析仪已进入市场应用。
基于微液滴的单分子免疫检测技术主要限于实验室，但具有床旁检测的优势。
重点介绍了基于物理隔离形式如微阵列和微液滴的单分子免疫检测进展，为进一步开发超高灵敏度检测方法并促进未来临床应用提供理论基础。
关键词单分子免疫检测微阵列微液滴中图分类号Q8191单分子免疫检测技术简介肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一，早诊 早治是提高肿瘤患者生存率的主要手段。
但是，由于 缺少有效的早期诊断方法，我国80%病人发现病情时 已处于中晚期[1],错过了最佳治疗时间。
在癌症发生 早期，血液中的标志物浓度在1〇〜~1〇_12mol/L[2]，而 目前临床常用免疫检测方式的灵敏度多在mol/L[3],远不能满足检测需求。
因此，研究人员采用 了多种方式来提高免疫检测灵敏度，包括新型标记物 质[4],酶催化的信号放大[5]及单分子免疫检测。
单分子计数免疫分析
单分子计数免疫分析单分子计数免疫分析（Single-molecule counting immunoassay, SIMOA）是一种新型的生物分析技术，可以在单个分子水平上对生物分子进行检测。
该技术综合了单分子检测技术和传统免疫分析技术的优势，可以实现高灵敏、高特异以及高通量的检测。
下文将从原理、应用以及前景等方面进行探讨。
一、技术原理SIMOA技术主要基于荧光信号检测原理，即利用荧光标记的抗体识别目标生物分子，荧光信号可以定量反映检测样品中的生物分子含量。
而在SIMOA技术中，荧光信号的来源是由荧光颗粒激发导致的荧光发射信号，这种荧光颗粒通常为带有多个荧光分子的量子点。
荧光颗粒被覆盖一层检测抗体，能够和目标生物分子特异性结合，在荧光显微镜下检测荧光颗粒数量，从而实现对单个分子进行检测和计数。
二、技术应用1.临床诊断：SIMOA技术可以实现对低含量的生物分子进行检测，如肿瘤标记物、激素、蛋白等，对早期肿瘤诊断、疾病预后评估等方面有很大的应用前景。
同时，SIMOA技术具有快速、灵敏、特异等特点，可以取代传统的ELISA技术，提高临床检测的准确性和效率。
2. 细胞生物学研究：SIMOA技术可以实现对细胞表面分子的检测，如细胞受体、蛋白质配体，从而研究细胞信号转导的分子机制和网络。
同时，基于微小通道等新型的芯片结构，可以实现单细胞级别的检测，为单细胞研究提供新的工具。
3. 研发新药物：SIMOA技术可以用于药物试验中对新药物的毒性和效果进行评估，从而提高药物的研发效率和准确性。
同时，基于微流控芯片的SIMOA技术还可以实现对多种药物的快速筛选，加快新药的研发速度。
三、技术前景当前，SIMOA技术还面临着许多挑战，如抗体的特异性、荧光信号的稳定性和检测成本等问题。
但是，随着生物技术和芯片技术的快速发展，这些问题逐渐得到解决。
相信随着技术的不断完善和发展，SIMOA 技术将能够被广泛应用于临床诊断、生物研究、新药研发等领域，为生物医学领域带来更多的新突破。
单分子免疫阵列技术在传染病诊断中的应用
孙淑芳。E-mail ：sunshufang@
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2021 年第 38 卷第 7 期
专论综述
A. 捕获抗体 ；B. 磁珠沉积 ；C. 油珠封闭 ；D. 荧光成像 ； E. Simoa 圆盘 ；F. 传统 ELISA 与 Simoa 对比。 图 1 Simoa 工作示意图 [3]
Simoa技 术 的 关 键 在 于 磁 珠 和 超 微 量 反 应 体 系。在磁珠方面，磁珠与蛋白分子的比例大约为 10:1的条件下，含有标记免疫复合物磁珠遵循泊松 分布，即蛋白质在相对低浓度情况下，每个磁珠将 捕获单一的免疫复合物或未发生捕获。例如，如果 在0.1 mL（6万个分子）样本中捕获了1 fmol蛋白 质并在50万个磁珠上标记，那么12%的磁珠将携带 1个蛋白质分子，88%的磁珠不携带任何蛋白质分 子。由于溶液中磁珠量大，磁珠间距很小，因此每 个分子不到1 min可遇到1个磁珠，理论上所有分子 都应该与多个珠子发生相遇。这样显著提高了与固 定捕获表面的结合效率。之后清洗磁珠，去除非特 异性结合蛋白，与生物素标记的检测抗体和β-半 乳糖苷酶标记的链霉亲和素一起孵育。每一个捕捉 到单个蛋白质分子的磁珠都被一种酶标记，而不捕 获分子的磁珠保持无标记状态。
2021 年第 38 卷第 7 期
专论综述
单分子免疫阵列技术在传染病诊断中的应用
樊晓旭 1，张皓博 1，刘蒙达 1，迟庆安 1，2，亓 菲 1，3，刘婷婷 1，孙淑芳 1，范伟兴 1
（1. 中国动物卫生与流行病学中心，国家动物结核病参考实验室，山东青岛 266032 ； 2. 海南省动物疫病预防控制中心，海南海口 571100 ； 3. 青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109）
10种常用细胞因子检测方法盘点
10种常用细胞因子检测方法盘点研究细胞因子为临床上疾病的预防、诊断、机理研究以及治疗等奠定了良好的基础，应用前景非常广泛。
目前检测细胞因子的方法有很多，根据检测原理和手段的不同，检测技术大致可分为四类：免疫学方法、生物学方法、分子生物学方法及质谱法。
细胞因子是由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。
细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。
这些细胞因子的种类很多，包括肿瘤坏死因子—α(TNF-α)、白介素—1β(IL-1β)、白介素—6(IL-6)、转化生长因子—β(TGF-β)等。
细胞因子(cytokine，CK)是主要由机体中固有免疫细胞和适应性免疫细胞合成、分泌的一类具有多种活性功能的小分子多肽或糖蛋白。
细胞因子能介导细胞间的相互作用，具有多种生物学功能，如调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等。
研究细胞因子为临床上疾病的预防、诊断、机理研究以及治疗等奠定了良好的基础，应用前景非常广泛。
目前检测细胞因子的方法有很多，根据检测原理和手段的不同，检测技术大致可分为四类：免疫学方法、生物学方法、分子生物学方法及质谱法。
本篇我们就和大家一起来汇总一下10种方法的技术原理及方法特点：1、7种基于免疫学的常用的细胞因子检测方法Western Blot法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、酶联免疫斑点技术（ELISpot）、超敏电化学发光技术（MSD）、Luminex液相芯片检测技、Olink技术、Simoa技术（Simoa）7种常用的细胞因子检测方法差异对比2、2种基于生物学的检测方法反转录·聚合酶链反应（RT-PCR）Cytometric Bead Array（CBA）系统3、质谱法4、12项细胞因子检测的临床意义一、基于免疫学的检测方法炎症因子作为一种蛋白质抗原，可以特异性与其单克隆抗体结合，利用抗原抗体反应检测细胞因子，近年来发展比较快，其方法包括Western Blot法、酶联免疫吸附测定法、酶联免疫斑点技术、超敏电化学发光技术、Luminex液相芯片检测技术、Olink技术、Simoa技术。
全自动单分子免疫分析仪
工作原理
通过将单分子免疫分析技术应用于全自动分析系统，对样本中的目标分子进行高 灵敏度检测和分析。
在系统中，样本经过免疫反应后，产生的光信号通过光电倍增管转换为电信号， 再经过计算机处理和分析，最终得到目标分子的定量结果。
技术特点
高灵敏度
快速高效
全自动单分子免疫分析仪能够检测到低至单 个分子的水平，极大地提高了检测的灵敏度 和准确性。
高灵敏度
全自动单分子免疫分析仪具有极高的灵敏度，可以检测 出低浓度的抗原-抗体复合物，为早期诊断提供了可能。
应用广泛性
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临床诊断
全自动单分子免疫分析仪在临床诊断中具有广 泛的应用价值，可用于感染性疾病、自身免疫 性疾病、肿瘤等疾病的检测。
生物研究
全自动单分子免疫分析仪也可用于生物研究领 域，如对生物分子相互作用、细胞信号转导等 的研究。
全自动分析系统可以同时处理多个样本，缩 短了分析时间，提高了工作效率。
自动化
广泛适用性
从样本处理到数据分析，全自动单分子免疫 分析仪都能够实现全自动化操作，减少了人 为误差和操作时间。
全自动单分子免疫分析仪适用于多种临床诊 断和科学研究领域，如肿瘤标志物检测、激 素水平检测、传染病检测等。
03
应用领域
实验结果
数据准确性
全自动单分子免疫分析仪具有极高的数据准确性，能够避免人为操作误差， 提高了实验结果的可靠性。
数据重复性
由于仪器自动化程度高，可以保证实验结果的重复性，为后续的数据分析提 供了有全自动单分子免疫分析仪可以自动完成数据的收集和分析， 通过专业的软件对数据进行处理，能够快速得到准确的实验 结果。
。
临床医学领域
疾病诊断
全自动单分子免疫分析仪可以 用于检测人体血清、组织等样 本中的蛋白质、核酸等分子， 为临床医学领域的疾病诊断提
simoa标准曲线
simoa标准曲线
Simoa标准曲线是用来进行单分子免疫检测时建立的曲线，它通过微阵列芯片上的微孔以及与之配对的免疫复合物进行定量检测。
在Simoa技术中，每个微孔中的反应体系非常小，只有约50飞升，比传统ELISA小20亿倍。
即使只有一个分子，也可以产生足够的荧光信号被CCD摄像头捕获。
在建立Simoa标准曲线时，首先需要在检测样本中加入不同浓度的标准品，然后按照预设的反应条件进行反应。
在反应结束后，通过荧光显微镜对微孔中的荧光信号进行计数，并根据泊松分布理论计算阳性荧光小孔对应的蛋白浓度值。
在标准曲线上，横坐标是抗原浓度，纵坐标是阳性荧光小孔的比例或荧光强度。
通过标准曲线，可以定量地确定样本中蛋白质的浓度。
需要注意的是，在建立标准曲线时，需要使用高质量的抗体和抗原，并且严格控制反应条件和时间等因素，以确保检测结果的准确性和可靠性。
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3. Simoa可以在单个细胞中定量蛋白，实现单个胚胎细胞培养上清中的 蛋白检测；
4. Simoa可以在外泌体等稀少样品类型中检测PD1、PD-L1等蛋白；
5. Simoa可以在阿尔兹海默症初期（提前16年），在接近正常人的患者 血清中检测到蛋白标志物NfL
50 fL 的反应体系比ELISA 100 μL 的体系小了20亿倍。灵敏度提高1000倍。 已开发120多个相关试剂盒，同时 Simoa 是开放平台。 兼具蛋白检测与核酸分子检测的通用技术平台。
Simoa检测内容
1. Simoa可以在血清/血浆中检测NfL、Tau、pTau、Aβ40、Aβ42等超低 丰度神经因子；
美国Quanterix公司的创始人是David Walt，大学化 学系的教授，美国国家科学院和工程院的双料院士 ，基因测序龙头企业Illumina公司的创始人之一。 2007年，David Walt在美国创立Quanterix Corporation，首次推出SiMoA技术。 2013年推出科研系列产品——基于SiMoA技术的检 测设备。 2015年推出第二代基于SiMoA技术的检测设备。
Illumina是由David Walt博士、CW 集团的Larry Bock 、兽医学博士John Stuelpnagel、 Anthony Czarnik博 士及Mark Chee博士于1998年4月共同组建。
SiMoA系统原理
微孔（3μm左右）
SiMoA系统原理
蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢
星童医疗的Pylon 3D循环增强荧光免疫技术接近单分子检测水平
星童医疗 •单人份试剂, 操作方便 •20分钟内报告结果 •高敏，达到pg/ml水平 •微量全血模式解决儿科化验困扰 •样本类型包括全血、血浆、血清
2017年6月，国际检验协会IFCC的心脏标志物 工作组发布了最新的高敏肌钙蛋白“琅琊榜” 。八强：罗氏、雅培、西门子、梅里埃、三菱 、OCD、Singulex、星童。
研发药物的代谢动力学和药物效应动力学分析
治疗性抗体与抗凝全血孵育后细胞因子释放检 测
监测及预防肿瘤免疫治疗并发症：细胞因子释放综合征
单抗治疗前后细胞因子水平: 100% 可被检测 TNF-α：0.1 pg/mL ，IL-2：0.2 pg/mL
数字PCR对单分子免疫的启示
商品化单分子免疫测的技术平台 Quanterix公司的SiMoA系统和Merck的SMC系统
血清心肌肌钙蛋白cTnI本底高，未来风险也较高
血液中的cTnl都可被精确检测，并且99%个 体的表达水平都在10.19pg/mL以下，大多 数个体的实测值在1-2pg/mL之 间。
cTnI 大多数个体的实测值在1-2pg/mL之间
助力单抗药物研发
Pfizer辉瑞哮喘候选药物IMA638和IMA026 哮喘诱发因 素IL-13的动态监测
• 在高敏肌钙蛋白-T领域中，星童的总检出率达到95%，完胜罗氏。
循环增强荧光免疫技术原理—信号放大
检测水平达到pg/mL或fg/mL级别,甚至单分子
➢生物分析检测领域，最小极 限尺寸-------单分子水平
➢见“微”知著突破极限 ➢超高灵敏蛋白检测：助力揭
示微妙生物学事件。 ➢检测对象：细胞因子等，因
浓度极低，pg/mL或fg/mL级 别。
区分健康，风险与疾病个体
突破检测极限，不但能诊断疾病，还能预知风险。
4、流式液相芯片：透镜生命和旷博生物
5、微流控技术：理邦血气、微点生物、天津微纳芯、博晖创新、博奥生物
6、光激发光化学发光技术：科美诊断、爱兴生物
7、质谱检测：迪安诊断、金域医学、安图生物
蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢 年均仅有1-2个新的生物标志物进入临床应用
现有技术的瓶颈极大限制了蛋白生物标志物的发展
SMC系统原理
SMC系统检测灵敏度
SMC系统检测灵敏度
单分子免疫检测技术发展瓶颈
（1）稳定性及效率 操作复杂，不稳定。 SiMoA检测时长1小时， SMC检测时长4小时。
（2）成本； 耗材昂贵。
（3）替代的必要性。 作为生物检测技术的极限尺子，单分子检测技术取代现有诊断技术成为市场的主流 是将来体外诊断市场发展的趋势。
IVD领域的7大技术创新
√ 检测精准度 √ 检测便利性 √ 检测效率
1、三代测序技术：纳米孔单分子测序 ：Pacific Biosciences和 Oxford Nanopore
2、单分子免疫检测：Quanterix的Simoa系统和Merck的SMC系统
3、数字PCR：ABI（Applied Biosystems）和Bio-Rad
国内单台设备售价超过20万美元，96人份的试剂盒市场售价均超过2000美元， 研发用试剂盒更是高达6000美元（30test）。
截至目前为止，该设备国内销量已超过6台。
Merck SMCxPRO™单分子免疫检测仪
“艾里斑” 逐个扫描荧光标记的检测抗体
单分子免疫检测仪
蛋白质定量检测进入----飞克级时代!
Simoa检测内容
Simoa检测内容
Simoa实测灵敏度范围
SiMoA系统的投融资
2016年乐普（北京）医疗器械股份有限公司第一期1100万美元的募资将全 额投给Quanterix公司，参与其D轮投资，以增资方式获得5.35%股权。
2017年12月Quanterix在美国纳斯达克上市，目前全球已有200+装机用户。 2018年1月，杭州纽蓝科技有限公司成为美国quanterix公司中国区总代理
星童医疗特色产品---高敏肌钙蛋白正常值：0-40pg/mL
• 在肌钙蛋白评分标准中，要达到“高敏”的要求非常苛刻，它至少需要满 足两个条件：1.正常人群中检出率达到50%以上；2.第99百分位值处 CV≤10%
• 在高敏肌钙蛋白-I领域中，星童的总检出率高达91%，结果毫不逊色于当今世 界所有诸强；
Simoa技术参数
反应体系：2.7 μm抗体包被磁珠+生物素化的检测抗体+链霉亲和素半乳糖甘酶
1个磁珠包被250000个捕获抗体，靶点分子极少的时候，1个磁珠仅补获1个蛋白分子
检测体系： 加入底物的磁珠转移到 Simoa 光盘上。 每个光盘有24个芯片（Array）， 每个芯片 有238000个直径为4.25 μm 的小孔，1个小孔仅能容纳一个磁珠 小孔体系仅有50 fL，在芯 片表面推一层油，一方面除去多余磁珠，另一方面将信号密 封在小孔中。 信号CCD 成像。
单分子免疫检测SMC系统
SMC（SingleMolecule Counting）系统最早由Singulex公司开发。Erenna系统 是SMC第一代单分子检测设备。通过流式分子扫描检测的方法，实现分子计数 功能。 2015年由Merck Life Technology收购其使用权。
2018年，Merck公司推出第二代单分子免疫检测设备SMCxPRO。