猪流行性腹泻病毒FJ-11A株的分离与ORF3基因序列分析

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猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及N基因序列分析

ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｉｔｗａｓａｉｍｅｄｔｏｄｉｇｏｕｔｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｉｓａｖａｒｉａｎｔｓｔｒａｉｎ，ｗｈｉｃｈｃａｕｓｅｄｔｈｅｓｗｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａ．［Ｍｅｔｈｏｄｓ］Ｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｓｆｒｏｍｄｅａｄｄｉａｒｒｈｅａｌｐｉｇｌｅｔｓｉｎｐｉｇ
病毒传代次数的增加，细胞病变逐渐稳定，进行ＲＴ — ＰＣＲ检测、间接免疫荧光检测以及动物回归实验，最终确
定分离株符合ＰＥＤＶ特征，并命名为ＢＪ２０１５，测定毒株的ＴＣＩＤ。为１Ｏ／ｏ．１ｍＩ。基因测序结果显示，Ｎ基因
ＬＩＵＸｉｈｏｎｇ，ＭＥＮＧＱｉｎｇｙｕ，Ⅵ ＮＧＪｉａｎｆａｎｇ，ＺＨＡＮＧＹｏｎｇｈｏｎｇ，ＣＵＩＤｅｆｅｎｇ，ＬＩＪｉａ，ＬＩＵＦｅｎｇｈｕａ

猪肠道病毒的分离鉴定及其全基因组序列测定与分析

猪肠道病毒的分离鉴定及其全基因组序列测定与分析猪肠道病毒的分离鉴定及其全基因组序列测定与分析导言：猪肠道病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus， PEDV）是一种能引起幼猪急性腹泻的病毒。

自20世纪80年代末爆发以来，PEDV已经成为全球养猪业的主要威胁之一。

为了更好地了解PEDV的分布、演变和传播机制，就需要对PEDV进行准确的分离鉴定，并获取其全基因组序列。

一、PEDV的分离鉴定1. 采集样品为了对PEDV进行分离鉴定，需要采集疑似感染PEDV的猪粪样品。

采集时应注意避免样品受到污染。

2. 细胞培养将采集到的猪粪样品置于适当的培养基中，在37℃的条件下培养细胞。

PEDV会感染并破坏肠道上皮细胞，因此可以通过细胞病变观察来初步判断是否存在PEDV。

3. PEDV的鉴定进行酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫荧光试验（IFA）来确定细胞中是否存在PEDV。

这些试验可以通过特定的抗体与PEDV间发生特异性反应来检测。

4. 病毒复制如果样品经鉴定确实存在PEDV，可以进行病毒复制以获取更多的病毒颗粒。

二、PEDV的全基因组序列测定为了进一步了解PEDV的遗传特征和演化历史，需要对PEDV进行全基因组序列测定。

1. 核苷酸提取通过核苷酸提取试剂盒对病毒颗粒中的RNA进行提取。

提取后的RNA可进一步用于测定PEDV的全基因组序列。

2. 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）用特异性引物进行逆转录聚合酶链式反应，合成PEDV的cDNA。

3. PCR扩增使用PEDV特异性引物对PEDV的全基因组进行扩增。

选择适当的引物片段长度和PCR条件，可确保PCR扩增的特异性和准确性。

4. 基因测序通过基因测序技术对PCR扩增产物进行测序，获取PEDV的全基因组序列。

三、PEDV全基因组序列的分析1. 序列比对将获取的PEDV全基因组序列与已知PEDV序列进行比对，通过相似性分析来判断其跟已知PEDV的关系。

猪流行性腹泻病毒S_N和ORF3基因的遗传变异分析

ＳａｎｄＯＲＦ３ｇｅｎｅｓｏｆｔＰｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｈｅ７ＰＥＤＶｓｔｒａｉｎｓｈａｄａｃｌｏｓｅｒｒｅｌａ－ｙｇｙ，ｅｎｅｈａｄａｃｔｉｏｎｓＮｇｈｉｗｉｔｈｔｈｅＴｈａｉｌａｎｄｓｔｒａｉｎａｎｄｌｏｓｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｗｉｔｈｔｈｅＣＶ７７７ｓｔｒａｉｎ．ｐｐ
１１２１１１，Ｌ，ＣｉｎＷＡＮＧＬｏｂａｉｓｈｅｎｌｉａｎｉｎＩＮＹｕＨＥＹｏｎＸｕｅＨＥＮＲｕｎ－－－－ｍ－ｊｇ，ｇ，Ｃｇ，ＷＵｇｇ２１ｉｎｉａｎＨＯＵＬｕＳＨＡＯＬｉａｎｎ－－ｐｇ，Ｚｊｇ＊ｇ，
１期１
王隆柏等：猪流行性腹泻病毒Ｓ、Ｎ和ＯＲＦ３基因的遗传变异分析
１８３１
，ＴｈｅｒｅｓＳａｎｄＯＲＦ３ｇｅｎｅｓｏｆｔｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｈｅ７ＰＥＤＶｓｔｒａｉｎｓｖａｒｉｅｄｒｅａｔｌａｎｄｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｇｙｍｉｈｔｏｒｉｉｎｆｒｏｍＴｈａｉｌａｎｄａｎｄＫｏｒｅａｓｔｒａｉｎｓ．ｇｇ；；；；：ｅｎｅｅｎｅＳｇＮｇＯＲＦ３ｇｅｎｅｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎａｎａｌｓｉｓｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓＫｅｗｏｒｄｓｇｙｐｐｙ，ｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｏｒｃｉｎ猪流行性腹泻（ｐｐ是由猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤ）ｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉｏｒｃｉｎ－ｐｐ，引起的接触性肠道传染病，各ａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓＰＥＤＶ），年龄段的猪群均能感染发病主要临床症状表现为腹泻、呕吐和脱水，其中对哺乳仔猪危害最为严重。ＰＥＤＶ属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属的成员，病毒核酸为正义单链Ｒ基因组全长约为２ＮＡ，８、主要结构蛋白为纤突糖蛋白（小膜蛋白ｋｂ，Ｓ蛋白）（、膜蛋白（和核衣壳蛋白（Ｅ蛋白）Ｍ蛋白）Ｎ蛋白）。自１９７８年英国首次报道该病后

猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析_王隆柏(1)

・简报・猪流行性腹泻病毒ORF3和M 基因的克隆与序列分析王隆柏，吴学敏，车勇良，陈如敬，魏宏，刘玉涛，庄向生，周伦江（福建省农业科学院畜牧兽医研究所　福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福州 350013）摘　要：为了解福建省猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV ）毒株ORF3和M 基因变异情况，本研究从4个不同规模猪场发生仔猪“顽固性腹泻”疾病的病料中扩增到4株PEDV 的ORF3和M 基因，并进行了序列分析。

结果表明：4株PEDV ORF3基因均含有675个碱基，编码224个氨基酸，与GenBank 中登录的代表性PEDV 核苷酸的同源性为89.7%~100.0%，氨基酸的同源性为94.7%~99.6%，其中FJPT 毒株核苷酸的同源性与CV777 truncated 毒株最低，仅为89.7%，FJNP 毒株核苷酸的同源性与中国北方流行的CH ZKFG 11毒株最高，达100.0%。

M 基因含有681个碱基，编码226个氨基酸，与GenBank 中登录的代表性PEDV 核苷酸的同源性为94.8%~100.0%，氨基酸的同源性为94.8%~99.6%，其中FJPT 毒株核苷酸的同源性与日本D89752毒株最低，仅为94.8%， FJNP 毒株核苷酸的同源性与韩国CPF193、泰国毒株最高，达100.0%。

4株PEDV 毒株均与国内外流行强毒株的亲缘关系较近，与attenuate DR13弱毒株的亲缘关系较远。

关键词：猪流行性腹泻病毒；ORF3基因；M 基因；序列分析中图分类号： S852.659.6:Q78 文献标志码：B 文章编号：1674-6422(2012)03-0067-06CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF ORF3 AND M GENE OFPORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUSWANG Long-bai, WU Xue-min, CHE Yong-liang, CHEN Ru-jing, WEI Hong, LIU Yu-tao,ZHUANG Xiang-sheng, ZHOU Lun-jiang(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agriculture Sciences, Fujian Animal Disease ControlTechnology Development Center, Fuzhou 350013, China)Abstract: The sequences of four Porcine epidemic diarrhea viruses (PEDVs) were ampli ﬁ ed from clinical samples on four pig farms with refractory diarrhea in Fujian. The ORF3 and M gene of these PEDVs were sequenced and compared with those deposited in GenBank. The ORF3 consisted of 675 nucleotides, encoding a 224-amino acid protein. These four PDEV strains shared 94.7%-99.6% amino acid identities with the PEDV strains in GenBank. The FJPT strain shared the lowest nucleotide homology at 89.7% with CV777 truncated strain while FJNP strain shared the highest nucleotide homology at 100.0% to CH ZKFG 11. The M gene consisted of 681 nucleotides, encoding a 226- amino acid protein. The M gene of these four PDEV strains had 94.8%-99.6% amino acid homology with the PEDV strains in GenBank. The FJPT strain shared the lowest nucleotide homology at 94.8% with D89752 strain while FJNP strain had the highest nucleotide homology at 100.0% with CPF193. Phylogenetic analysis indicated that the four PEDV strains were close to velogenic strain and distant with the attenuated DR13 strain.Key words: Porcine epidemic diarrhea virus; ORF3 gene; M gene; sequence analysis 收稿日期：2012-03-06基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（NYHYZX07-034）作者简介：王隆柏，男，硕士，助理研究员，主要从事动物病毒学与分子生物学研究通信作者：周伦江，E-mail：lunjiang@Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2012,20(3): 67-72・ 68 ・2012年5月中国动物传染病学报猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起猪的一种高度接触性的急性肠道传染病，常导致病猪水样腹泻、呕吐、脱水，消化道粘膜发炎、出血及糜烂[1, 2]。

猪流行性腹泻病毒的分离鉴定

ＰＥＤＶ
小白鼠（雌性，２０ｇ左右）ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｍ— ＭＬＶ反转录酶
ｄＮＴＰ
１０ＴａｑＢｕｆｆｅｒ６ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ
ＤＬ－２ＯＯＯＭａｒｋｅｒ
胰蛋白酶ＰＣＲ扩增仪（型号Ｄ一８２３５）凝胶成像系统（型号Ｐｒｏｘｉｍａ２７５０）电泳仪（型号ＪＹ６００Ｃ）
ＴａＫａＲａ￣司奥然科技有限公司北京君意东方电泳设备有限公司
收稿日期：２０１７ — ０９ — １５
作者简介：庞
宇（１９８６一），男，甘肃兰州人，主要从事预防兽医学研究。
２０１７年第４７卷・第１ｏ期
ＩｌＩｓｈ试ｌｕ验ａｎ研卿究Ｊｔ ■
ＲＴ — ＰＣＲ，小白鼠感受陛试验。病例均选自２０１５年６月至２０１６年６月期间，具体情况如表１所示。
表１试验细胞，培养基，病毒。仪器，试剂以及试验动物的情况
项目
Ｖｅｒｏ细胞
ＰＫ一１５细胞ＤＭＥＭ完全培养基优级胎牛血清猪圆环病毒（ＰＣＶ）
摘要：目的：讨论猪流行性腹泻病毒的分离鉴定。方法：选取大型猪场中疑似猪流行性腹泻病死的仔猪的肠道
内容物制成标本进行分离，ＲＮＡ提取，反转录，ＲＴ－ＰＣＲ，小白鼠感受性试验。结果：使用胰酶检测细胞的毒

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测与ORF3基因分子流行病学调查

性为９５．９％～９９．９％，编码氨基酸同源性为９６．４％～１００％。与欧洲代表性强毒株ＣＶ７７７基因同源性为９６．３％～９７．０％，编码氨基酸同源性为９５．１％～９６．４％，与ｃｖ７７７弱毒疫苗株基因同源性为９６．８％～９７．６％，编码氨基酸同源性为９２．３％～９３．４％，并且无疫苗病毒株ＯＲＦ３基因的４９个碱基缺失。与韩国病毒株比较，其基因同源性
为９５．０％～９８．５％，编码氨基酸同源性为９５．５％～９９．６％。基因遗传进化树分析表明，国内外ＰＥＤＶ株可分为４
群。我国主要流行病毒株属于第１群，与韩国病毒株亲缘关系较近，而与我国疫苗病毒株存在较大差异。该研究表明，ＰＥＤＶ可能是目前我国仔猪腹泻的主要病原之一，我国ＰＥＤＶ流行病毒株存在明显基因变异。关键词：猪流行性腹泻病毒；ＲＴ．ＰＣＲ；ＯＲＦ３；流行病学
ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８－０５８９．２０１３．０７．１０
猪流性腹泻病毒ＲＴ — ＰＣＲ检测与ＯＲＦ３基因分子流行病学调查
董彦鹏，白娟，范宝超，李玉峰，姜平
ＤＯＮＧＹａｎ — ｐｅｎｇ，ＢＡＩＪｕａｎ，ＦＡＮＢａｏ — ｃｈａｏ，ＬＩＹｕ— ｆｅｎｇ，ＪＩＡＮＧＰｉｎｇ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，

猪流行性腹泻毒株S基因分离鉴定及序列分析

尹国友，王林嵩．猪流行性腹泻毒株Ｓ基因分离鉴定及序列分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１９，４７（１１）：７１－７４．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１９．１１．０１４猪流行性腹泻毒株Ｓ基因分离鉴定及序列分析尹国友１，２，王林嵩１（１．河南师范大学生命科学学院，河南新乡４５３００７；２．河南城建学院生命科学与工程学院，河南平顶山４６７０３６）摘要：根据ＮＣＢＩ上传的猪流行性腹泻病毒（ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ，ＰＥＤＶ）［ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＮ５４７２２８（ＣＨ／Ｓ）］，设计引物对阳性病料进行鉴定并回收，与ｐＭＤ１８－Ｔ构建重组载体并测序。

对猪流行性腹泻病毒的基因多样性及序列保守性进行分析，一是以经典毒株为主，包括ＣＶ７７７、ＫＰＥＤＶ－９和ＣＨ／Ｓ株等为代表的Ｇ１基因型，另一种是以近几年分离的毒株为主，包括ＨＢ３－ＣＨ２０１２、ＣＸＨＺ－ＣＨ２０１３、ＨＮＣＺ－ＣＨ２０１３等为代表的Ｇ２基因型。

基因同源性分析比较结果表明，这４株ＰＥＤＶ之间的序列同源性为９７．６％～１００．０％，与经典株ＣＶ７７７的同源性为９２．７％～９２８％。

同源分析显示，ＰＥＤＶ不同毒株间的基因同源性仍高度相似，但ＰＥＤＶ流行毒株已呈现进化分支的趋势。

关键词：猪流行性腹泻病毒；Ｓ基因；序列分析中图分类号：Ｓ８５８．２８５．３文献标志码：Ａ文章编号：１００２－１３０２（２０１９）１１－００７１－０３收稿日期：２０１８－０２－２４基金项目：河南省平顶山市科技攻关项目［编号：２０１７００７（７．５）］。

作者简介：尹国友（１９７６—），男，山东陵县人，博士研究生，讲师，研究方向为生物化学与分子生物学。

Ｅ－ｍａｉｌ：１２１８５０４２７＠ｑｑ．ｃｏｍ。

通信作者：王林嵩，教授，研究方向为生物化学与分子生物学。

Ｅ－ｍａｉｌ：０４１００８＠ｈｔｕ．ｃｎ。

猪流行性腹泻病毒（ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ，ＰＥＤＶ）引起的猪流行性腹泻病（ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａ，ＰＥＤ）是一种高死亡率的肠道传染病，会在猪群中引起各个年龄段猪暴发急性腹泻，多发于仔猪和胎猪，其临床症状主要以猪水样腹泻、呕吐和脱水为主。

猪流行性腹泻病毒FJ-11A株的分离与ORF3基因序列分析

ＹＡＮｓａ，ＨＯＬｎｊｎｈｎＺＵｕ－ａｇｉ（ｎｔｕｅｆＡｉｌＨｕｂｎｒｎｅｅｉａｙＭｅｉｎ／ｕｉｎｉａｓｓｓｏｔｌＴｃｎｌｇＩｓｔｔｏｎｍａｓａｄｙａｄＶｔｒｎｒｄｃｅＦｊａｍｌｅｅｎｒｅｈｏｏｙｉｉＡｎＤｉａＣｏＤｖｌｐｎｅｔｒｕｉｎａｅｆＡｇｉｕｔｒｌｃｅｃｓｕｈｕｕｉｎ３０１，ｈｎ）ｅｅｍｅｔｎｅ，Ｆｊａｄｍｙｏｒｃｌａｉｎｅ，Ｆｚｏ，Ｆｊａ５０３ＣｉａｏＣＡｃｕＳ
福建农业学报２（）９７５，ｏｒａｆＡｇｉｕｔｒｌｃｅｃｓｕｎＪｕｎｌｒｃｌａｉｅｉｏｕＳｎ
文章编号：１Ｏ — ０８（０１６４－０Ｏ８３４２１）０ —９７５
收后进行克隆测序。结果表明，所扩增的目的片段基因编码有完整的ＯＲ３开放阅读框，全长为６５ｂ，编码Ｆ７ｐ有２４个氨基酸。运用ＤＮＡｔｒ件，将获得的ＯＦ２Ｓａ软Ｒ３基因序列和ＧｅＢｎ中登录的猪流行性腹泻病毒株ＯＦｎａＲ３基因序列进行分析比较和遗传进化分析，猪流行性腹泻病毒福建株ＯＦ基因和韩国分离株ＣＦ０４和ＰＦ１Ｒ３Ｐ１７Ｆ５３该基因核苷酸同源性最高，均为９．％，与疫苗株Ｃ７９３Ｖ７７核苷酸同源性为９．。从遗传进化上看，我国７８

福建省猪流行性腹泻病毒的ORF3基因序列分析

ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｎＯＲＦ３ＧｅｎｅｏｆＰｏｒｃｉｎｅＥｐｉｄｅｍｉｃＤｉａｒｒｈｅａＶｉｒｕｓｉｎＦｕｊｉａｎ
ＺＨＵＨａｉ — ｘｉａ，ＺＥＮＧＬｉａｎｇ－ｍｉｎｇ，ＣＨＥＮＬｅｉ，ＺＨＡＮＧＹｕａｎ－ｋｕｉ
ｄｏｉ：１０．１９３０３／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８ — ０３８４．２０１６．１０．００４
朱海侠，曾亮明，陈雷，等．福建省猪流行性腹泻病毒的ＯＲＦ３基因序列分析［Ｊ］．福建农业学报，２０１６，３１（１０）：ｌＯ２４ —１０２７．ＺＨＵＨ— Ｘ，ＺＥＮＧＬ — Ｍ，ＣＨＥＮＩ一，ｅｔａ１．ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｎＯＲＦ３ＧｅｎｅｏｆＰｏｒｃｉｎｅＥｐｉｄｅｍｉｃＤｉａｒｒｈｅａＶｉｒｕｓｉｎＦｕｊｉａｎ［Ｊ］．Ｆｕｊｉａｎ
ｆｏｕｎｄｄｏｍｅｓｔｉｃａｌｌｙａｎｄｉｎｔｈｅｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇｃｏｕｎｔｒｉｅｓｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓｗｉｔｈｕｐｔｏ１００ｈｏｍｏｌｏｇｙｏｎｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｂｕｔ，ｔｈｅｙｗｅｒｅｄｉｓｔａｎｔｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌｓｔｒａｉｎｏｆＣＶ７７７，ｗｉｔｈａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｈｏｍｏｌｏｇｙ

细胞适应性猪流行性腹泻病毒部分基因序列分析及其致病力研究

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#D! 病毒的纯化与传代将分离所得的亲本强毒株 UZ`G%*&**& 接种
"广东海大畜牧兽医研究院!广州 1%%)&&#
摘要对已经适应 _@M#细胞生长的猪流行性腹泻病毒 UZ`G%*&**&亲本代'第*(代'第.&代'第(&代和第%&& 代病毒的 -'3'5 基因分别进行测序及序列比对分析!结果显示 3 和 5 基因具有高度的保守性!多次传代后未发生氨基酸的改变(- 基因在第*(代时未发生任何突变!第%&&代时发生了%9个核苷酸的点突变!导致%1个氨基酸发生改变&动物试验显示!第.&代病毒仍能引起仔猪呕吐'腹泻等症状!而第%&&代的病毒毒力已经减弱&- 基因的突变是否与病毒的毒力减弱有关还需进一步试验验证& 关键词猪流行性腹泻病毒(突变(- 基因(毒力减弱中图分类号8(10'.1/'.文献标志码7 文章编号&*..!./.)"0&%1#&1!&9/0!&(

猪流行性腹泻病毒FJLY1703株ORF3基因遗传进化及序列分析

第42卷第6期唐山师范学院学报 2020年11月 Vol.42 No.6 Journal of Tangshan Normal University Nov. 2020──────────收稿日期：2020-04-18 修回日期：2020-09-01 作者简介：董波（1983-），男，天津市人，博士，讲师，研究方向为兽医学。

-59-猪流行性腹泻病毒FJLY1703株ORF3基因遗传进化及序列分析董波1,2，戴爱玲1,2，李晓华1,2，杨小燕1,2（1. 龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364012；2. 龙岩学院福建省家畜疫病防治与生物技术重点实验室，福建龙岩 364012）摘要：将PEDVFJLY1703株ORF3基因进行RT-PCR 扩增并进行遗传进化和序列分析，结果表明，FJLY1703株ORF3基因核苷酸序列与2010年以后中国变异株的一致性为97.8%~99.6%，与疫苗株CV777的同源性为95.6%。

FJLY1703株与疫苗株CV777亲缘性较远，并存在与疫苗株CV777不同的抗原表位。

重组分析表明FJLY1703株ORF3基因没有发生重组事件，且易出现变异。

关键词：猪流行性腹泻病毒；ORF3；进化特征中图分类号：S855.3文献标识码：A文章编号：1009-9115(2020)06-0059-04DOI ：10.3969/j.issn.1009-9115.2020.06.014Analysis of the Genetic Evolution and Sequence of the ORF3 Gene on theFJLY1703 Strain of Porcine Epidemic Diarrhea VirusDONG Bo 1,2, DAI Ai-ling 1,2, LI Xiao-hua 1,2, YANG Xiao-yan 1,2(1. College of Life Science, Longyan University, Longyan 364012, China; 2. Fujian Engineering Research Center for Swine DiseaseControl and Prevention, Longyan University, Longyan 364012, China)Abstract: The ORF3 gene of the PEDVFJLY1703 strain was amplified by RT-PCR, and genetic evolution and sequence analysis were performed. The results showed that the nucleotide sequence of the ORF3 gene of the FJLY1703 strain was 97.8% to 99.6% identical to the Chinese variant strain after 2010, which was comparable to the vaccine strain. The homology of CV777 is 95.6%. The FJLY1703 strain is far from the vaccine strain CV777 and has a different epitope from the vaccine strain CV777. Recombination analysis showed that the ORF3 gene of FJLY1703 strain did not undergo recombination events and was prone to mutation.Key Words: Porcine Epidemic Diarrhea Virus; ORF3; evolutionary characteristics猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV ）以哺育仔猪最为易感，死亡率达到80~100%[1,2]。

华南地区猪流行性腹泻病毒的分子流行病学调查与分析

华南地区猪流行性腹泻病毒的分子流行病学调查与分析王栓群;孙瑞芹;刘燕玲;夏平安;宋长绪【摘要】为了解华南地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行、变异及进化情况,从该地区的不同猪场采集2 159份样品,利用RT-PCR方法检测PEDV,扩增了部分PEDV阳性样品中的S、M和ORF3基因并测序,利用生物信息学软件进行序列分析.结果显示,PEDV在猪场中的检出率为100％,在所有样品中的平均检出率为53.0％,在哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和母猪样品中,PEDV平均阳性率分别为67.6％、42.8％、12.8％和47.2％.根据S、ORF3和M基因建立的进化树,PEDV 可分为2个基因群,其中当前样品株为一群,韩国、美国和中国的参考毒株为一群.结果表明,PEDV在华南地区猪场普遍存在,其基因也在不断发生变化.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2015(042)006【总页数】8页(P97-104)【关键词】猪流行性腹泻病毒;分子流行病学;基因进化分析【作者】王栓群;孙瑞芹;刘燕玲;夏平安;宋长绪【作者单位】河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450000;广东省农科院动物卫生研究所,广东广州510640;广东省农科院动物卫生研究所,广东广州510640;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450000;广东省农科院动物卫生研究所,广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】S851.31+3;S852.65+1猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的以腹泻、呕吐和食欲下降为主要特征的传染性疾病，临床上与典型的急性猪传染性胃肠炎（porcineTransmissibleGastroenteritis，TGE）极为相似，给养猪业造成严重的经济损失。

PED多发于冬季和初春等寒冷季节，可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率越高。

五株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及序列分析

五株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及序列分析王贵华;于萍萍;满坤;吴珊珊;刘明明;孟萌;赵亚荣【摘要】为研究猪流行性腹泻病毒的流行情况并分析该病毒的培养特性，对甘肃、北京、河北、山西、浙江五个猪场送检的疑似猪流行性腹泻病猪小肠内容物，用RT －PCR 方法进行检测，证明为猪流行性腹泻病毒核酸阳性。

然后将阳性病料进行传代培养、病毒含量测定以及特异性检验，证明获得五株猪流行性腹泻病毒，分别命名为 Ningxia9、Beijing5、Gaocheng8、Shanxi1、Zhejiang08。

对分离的毒株进行 S 基因全长测序及氨基酸序列分析。

结果表明：五株分离毒株在盲传19代开始出现明显的细胞病变，盲传到24代，出现稳定的细胞病变且五株分离毒株的24代病毒含量在104．5～5．0 TCID50／mL 之间；用 S 蛋白进行进化树分析表明，五株分离毒株与近年来国内流行毒株亲缘关系很近，在同一个进化分支上；分离的五株野毒株之间的氨基酸同源性高达99．2％～99．9％，而这五株野毒与GenBank 上提交的2011年、2012年分离的野毒株的之间的氨基酸同源性为98．4％～99．9％；实验室分离毒株及国内近年流行毒株均与国内外经典毒株存在一定的共性，即特定位置氨基酸的插入、缺失或置换。

【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2016(050)007【总页数】7页(P13-19)【关键词】猪流行性腹泻病毒;分离鉴定;序列分析【作者】王贵华;于萍萍;满坤;吴珊珊;刘明明;孟萌;赵亚荣【作者单位】北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心，北京100195; 北京市畜禽生物制品工程技术研究中心，北京 100195;北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心，北京 100195; 北京市畜禽生物制品工程技术研究中心，北京 100195;北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心，北京100195; 北京市畜禽生物制品工程技术研究中心，北京 100195;北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心，北京 100195; 北京市畜禽生物制品工程技术研究中心，北京100195;北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心，北京 100195; 北京市畜禽生物制品工程技术研究中心，北京 100195;北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心，北京 100195; 北京市畜禽生物制品工程技术研究中心，北京 100195;北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心，北京 100195; 北京市畜禽生物制品工程技术研究中心，北京 100195【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪流行性腹泻病毒( porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 为猪的一种冠状病毒，可引起猪的急性、高度接触性肠道传染病猪流行性腹泻( porcine epidemic diarrhea, PED)。

一株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定和遗传进化分析

一株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定和遗传进化分析孙丰廷;史红丽;高小聪;杜恩岐【摘要】从陕西地区26个疑似猪流行性腹泻病毒感染的猪场,采集发病仔猪的肛门拭子、粪便以及死亡仔猪的小肠,将其接种于Vero细胞,在添加胰酶的情况下,连续传代培养并观察,直至细胞出现典型的合胞体病变,经RT-PCR检测、测序、基因比对分析与动物回归实验,最终确定分离到一株PEDV病毒强毒株.经过测定毒株的S基因序列,进行序列比对分析和遗传进化分析,发现本次分离到的毒株与疫苗株CV777同源性较低,进化分支位于目前流行的PEDV G2a亚群.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2016(050)010【总页数】5页(P10-14)【关键词】猪流行性腹泻病毒;分离鉴定;S基因【作者】孙丰廷;史红丽;高小聪;杜恩岐【作者单位】陕西诺威利华生物科技有限公司,陕西杨凌712100;北京康宝利华生物科技有限公司,北京100176;南通市动物疫病预防控制中心,江苏南通226000;西北农林科技大学,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S852.651973年猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)在中国上海首次发生，直到1984年才明确其病原体为猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic DiarrheaVirus, PEDV)[1]。

2010年末开始我国东南沿海地区暴发PED并扩散至全国各地，主要以高发病率和高死亡率为特征 [2-4] 。

近年来由PEDV引起的猪流行性腹泻(PED)对养猪产业造成了巨大损失，饲养管理不当非常容易导致PEDV的暴发，由于其临床症状与猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis of Swine，TGE)等肠道疾病类似，临床诊断比较困难。

PEDV可感染各种年龄段的猪，以呕吐、腹泻及脱水为主要临床特征，该病主要发生于冬季，夏秋季节也可发生，造成养猪业严重经济损失[5-6]。

猪流行性腹泻病毒变异株GDqy2017的分离及S和ORF3基因序列分析

猪流行性腹泻病毒变异株GDqy2017的分离及S和ORF3基因序列分析楚品品;蒋智勇;林德锐;徐志宏;李艳;勾红潮;卞志标;李春玲;蔡汝健【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2018(039)009【摘要】2017年广东某猪场送检腹泻死亡仔猪小肠样本,经实验室检测、细胞分离及RT-PCR鉴定,确定分离到1株猪流行性腹泻病毒,命名为GDqy2017,克隆并测定其S基因与ORF3基因序列,并对序列进行分析.结果显示,该分离株对Vero细胞高度适应,第1代即出现细胞病变(CPE),第4代起1 d内即出现CPE,且CPE时间和形态稳定.其S基因长4158 nt,与经典毒株CV777、中国疫苗株CV777及韩国疫苗株attenuated DR13核苷酸同源性为94.2％、94.1％、94.2％,氨基酸同源性为93.4％、92.7％、93.0％,存在2处插入、2处缺失及98处突变(与经典毒株CV777相比),属于不同进化群,与国内2010年后参考株(除CH-XBC-01-2015、CH/GDQY/2011)在同一进化群,S蛋白的主要抗原表位存在突变,其中有1处新突变出现(640位F→S),其ORF3全长675 nt,不存在疫苗株中的大片段缺失及表达截短现像,但存在突变,进化树分析显示与经典毒株CV777、疫苗株属于不同进化群,亲缘关系较远.研究结果为后续PEDV分子生物学分析、流行病学调查及研制更为有效的疫苗提供基础数据.【总页数】8页(P10-17)【作者】楚品品;蒋智勇;林德锐;徐志宏;李艳;勾红潮;卞志标;李春玲;蔡汝健【作者单位】广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东广州,510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东广州,510640;广东永顺生物制药股份有限公司,广东广州 511356;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东广州,510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东广州,510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东广州,510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东广州,510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东广州,510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广东广州,510640【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6;Q786【相关文献】1.猪流行性腹泻病毒FJ-11A株的分离与ORF3基因序列分析 [J], 陈如敬;吴学敏;车勇良;王隆柏;魏宏;庄向生;严山;周伦江2.猪流行性腹泻病毒山西分离株ORF3基因序列分析 [J], 刘文俊;李红丽;赵岳;王娟萍;姚敬明;吴忻;孟帆;韩一超;樊振华;薛翼鹏;米瑞娟3.一株猪流行性腹泻病毒的分离培养及其ORF3、sM和N基因的序列分析 [J], 陈果亮;阳坤;唐青海;滕威;张可;杨海;王芳宇4.一株新分离的猪流行性腹泻病毒变异株的评估 [J], 方超;张智明;李建华;何世民5.猪流行性腹泻病毒湖南分离株ORF3基因克隆与遗传进化分析 [J], 廖帆;杨雅娣;谭磊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪流行性腹泻病毒S、N和ORF3基因的遗传变异分析

猪流行性腹泻病毒S、N和ORF3基因的遗传变异分析王隆柏;林裕胜;车勇良;吴学敏;陈如敬;邵良平;周伦江【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2014(045)011【摘要】为探明2012-2013年在福建省流行猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白的遗传变异情况,对7株PEDV流行毒株的S、N及ORF3基因进行克隆、测序及分析.结果表明:7株PEDV S基因之间的核苷酸相似性为98.6％～99.4％,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株的相似性分别为93.7％～94.1％和93.8％～94.1％;同CV777标准株比较,存在64个氨基酸突变,其中有3个氨基酸较以往国内外流行毒株的变异不一样,为新变异氨基酸,氨基酸的插入和缺失与2008年泰国NPPED2008_2株相似;7株PEDV毒株的N基因和ORF3基因之间核苷酸的相似性分别为96.5％～99.7％和99.7％～100％,与CV777标准株的相似性分别为96.6％～98.0％和96.6％～96.9％.遗传进化树表明:7株PEDV毒株的S基因和ORF3基因与泰国流行毒株的亲缘关系较近,N基因与CV777标准株亲缘关系较近.7株PEDV毒株的S基因和ORF3基因变异程度较大,可能源于泰国及韩国的变异株.【总页数】7页(P1830-1836)【作者】王隆柏;林裕胜;车勇良;吴学敏;陈如敬;邵良平;周伦江【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建农林大学动物科学院,福州350002;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建农林大学动物科学院,福州350002;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6【相关文献】1.2011-2016年浙江省猪流行性腹泻病毒S基因与ORF3基因遗传进化分析 [J], 吴旺霞;王一成;吴润;袁秀芳;徐丽华;李军星;苏菲2.河北省猪腹泻相关病毒的检测及猪流行性腹泻病毒S基因遗传变异分析 [J], 张若曦;韩庆安;张志;顾文源;刘天驹;李翀;王建昌;李彬;袁万哲;王玉清3.河南地区猪流行性腹泻病毒S基因和ORF3基因分子特征和遗传进化分析 [J], 赵丽;李存法;韩昊莹;张鸿鑫;卢婷婷;陈红英;雷连成4.猪流行性腹泻病毒湖南分离株ORF3基因克隆与遗传进化分析 [J], 廖帆;杨雅娣;谭磊5.猪流行性腹泻病毒基因ORF3编码离子通道蛋白并可调控病毒产量 [J], 阮进学因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪流行性腹泻病毒基因ORF3编码离子通道蛋白并可调控病毒产量

猪流行性腹泻病毒基因ORF3编码离子通道蛋白并可调控病
毒产量
阮进学
【期刊名称】《农业生物技术学报》
【年(卷),期】2012(20)8
【摘要】猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是一个折叠单链RNA病毒，属于冠状病毒家族，可以导致各个年龄段猪腹泻，给养猪业带来巨大损失。

之前的研究表明，PEDV的ORF3（open reading frame3）基因与病毒的感染力和病原性相关，但是其具体功能未知。

近日，我国中国科学院、中国农业科学院、台湾阳明大学等单位合作揭示了ORF3基因的结构与功能。

【总页数】1页(P866-866)
【关键词】猪流行性腹泻病毒;病毒基因;通道蛋白;中国农业科学院;产量;调控;离子;编码
【作者】阮进学
【作者单位】中国农业科学院畜牧兽医研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
【相关文献】
1.ORF3蛋白促进猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上的增殖 [J], 胡晓霞;于瑞嵩;司伏生;陈冰清;董世娟;宋增福;李震
2.猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白40-91aa是其细胞质定位的关键结构域 [J], 陈冰清;沈媚;司伏生;董世娟;于瑞嵩;谢春芳;李震
3.猪流行性腹泻病毒ORF3编码离子通道蛋白和调节病毒的产生 [J], Wang K;刘丹
4.猪源戊型肝炎病毒基因IV型ORF3编码蛋白的表达及鉴定 [J], 屈勇刚;贾鹏;金宁一;陆民;孙中锋;朱光泽;于芳;刘玉生;夏志平
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山东省2012年～2016年猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及对其ORF3基因分析

山东省2012年～2016年猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及对其ORF3基因分析张月;田夫林;李玉杰;马慧玲;王贵升;蔺晓月;孙圣福;孔祥华;王苗利;陈静【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2018(40)5【摘要】为了解山东省猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行情况,本研究采用RT-PCR的方法对2012年1月～2016年12月山东省13个地市采集的258份疑似PEDV 感染样品进行检测,并设计引物扩增PEDV ORF3基因片段,通过生物信息学软件对26个具有代表性的完整的PEDV ORF3基因序列进行遗传进化分析.结果显示PEDV平均每年检出率达72.1％,表明PEDV是当前山东地区仔猪腹泻的主要致病病原.遗传进化分析显示,26株PEDV ORF3基因序列属于G2基因型,与其它参考PEDV病毒株同源性较高(93.8％～100％),相对保守.其中3株PEDV流行株位于2a亚型中,这在华北地区属首次报道.PEDV 2a亚型基因序列具有特异位点突变,可作为鉴别2a亚型与其它亚型的分子标记.本研究揭示了山东省PEDV流行株ORF3基因的主要基因型,为该省PEDV的防控提供依据.%To investigate the epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection,a total of 258 porcine intestinal and fecal samples with typical symptoms of PEDV infection were collected and detected by RT-PCR in Shandong province from January,2012 to December,2016,and the ORF3 genes of the 26 PEDV positive samples from 13 areas were sequenced and analyzed.Results showed that the average positive rate of PEDV was 72.1％ of the 5 years,which indicated that PEDV was the major pathogen for the pigletdiarrhea.By phylogenetic analysis of the ORF3 genes,the 26 PEDV were clustered in G2 and revealed high levels of sequence homology with other reference sequences (93.8％-100％).In addition,three of the PEDV were classed into the 2a subgenotype which was first identified in North China.Evidently,there were several mutations in the PEDV ORF3 that could be used for discrimination between 2a and other genotype.This study investigated the molecular diversity of the virus and provided a basis for the prevention and control of PEDV.【总页数】4页(P447-450)【作者】张月;田夫林;李玉杰;马慧玲;王贵升;蔺晓月;孙圣福;孔祥华;王苗利;陈静【作者单位】山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.猪流行性腹泻病毒黑龙江分离株ORF3基因的克隆、表达及分子进化分析 [J], 邹德华;郑亮;程丽鑫;李兴志;张雅婷;徐嘉欣;武雪宁;张华;曹宏伟2.2011-2016年浙江省猪流行性腹泻病毒S基因与ORF3基因遗传进化分析 [J], 吴旺霞;王一成;吴润;袁秀芳;徐丽华;李军星;苏菲3.河南地区猪流行性腹泻病毒S基因和ORF3基因分子特征和遗传进化分析 [J], 赵丽;李存法;韩昊莹;张鸿鑫;卢婷婷;陈红英;雷连成4.猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测与ORF3基因分子流行病学调查 [J], 董彦鹏;白娟;范宝超;李玉峰;姜平5.2017-2018年山东省猪流行性腹泻病毒ORF3基因型分析 [J], 卢亚平;马慧玲;张栋;陈静;李云岗;张月因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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Ｍｅｄｉｃｉｎｅ／Ｆｕｊｉａｎ
ＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅｓＣｏｎｔｒｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３５００１３，Ｃｈｉｎａ）
ａｓｅｖｅｒｅ
ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒ，ＦｕｊｉａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉｉａｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｒｃｉｎｅ
１．６
ｒ・ｍｉｎ叫离心１０
ｒａｉｎ，无菌条件下吸取上清液，冻存备用。
ＰＥＤＶ
ＯＲＦ３生物信息学分析
将测回的序列经ＤＮＡＳｔａｒ软件拼接后向ＧｅｎＢａｎｋ提交，所获得的ＧｅｎＢａｎｋ登录号为：１４８０５７４，将本试验株（ＦＪ一１１Ａ）和我国北方ＰＥＤＶ分离株（ＣＨ／ＪＬ／０９和ＣＨ／ＨＩＪＭ／０７）、韩国株（ＣＰＦｌ０７４、ＰＦＦ５１３、ＤＲｌ３及其弱毒株
通讯作者：周伦江（１９７３一），男，博士，副研究员，研究方向：动物病毒分子生物学（Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｕｎｊｉａｎｇ＠１６３．ｔｏｍ）基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（ＮＹＨＹＺＸ０７—０３４）；福建省财政专项——福建省农业科学院科技创新团队建设项目
（ＳＴＩＦ—Ｙ０２）
万方数据
９４８
福建农业学报１．３病毒的分离
ＧｒｅｅｎＭｉｘ
５０肛Ｌ、上下游引物（２０ｐｍ０１）各２肛Ｌ、ｃＤＮＡ模板２ｔＬＬ，补充灭菌去离子水至终体积１００“Ｉ。。反
１材料与方法
１．１病料收集与处理采集自福建某猪场２周龄内仔猪表现呕吐、腹泻和脱水严重的仔猪粪便、十二指肠、空肠和肠系膜淋巴结，置于乳钵剪碎后研磨，加入双抗（１００ＩＵ・ｍＬ＿１）的ｐＨ值７．２ＰＢＳ制成１：５的组织匀浆，反复冻融４次，８１．２试剂ＤＭＥＭ、胰酶（１：２５０）、胎牛血清和ＴｒｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＡＭＶ、ＨＰＲＩ、ｄＮＴＰｓ、Ｔ载体琼脂糖凝胶回收小量试剂盒和质粒小量抽提试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，
Ｐｒｏｖｉｎｃｅａｎｄ
ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＯＲＦ３Ｇｅｎｅ
ＣＨＥＮＲｕ－ｊｉｎｇ，ＷＵＸｕｅ－ｍｉｎ，ＣＨＥＹＨｏｎｇ，ＺＨＵＡＮＧＸｉａｎｇ－ｓｈｅｎｇ，
ＹＡＮｓｈａｎ，ＺＨＯＵＬｕｎ－ｊｉａｎｇ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ
ＰＥＤ）是由猪流行性腹泻病毒（ｐｏｒｃｉｎｅ
ｖｉｒｕｓ，ＰＥＤＶ）引起的以腹泻、呕吐和脱
水为典型特征的急性高度接触性肠道传染病［１］。该病多发生在冬春交替寒冷时节，以哺乳仔猪发病和死亡最为严重。该病最早在１９７１年由Ｐｅｎｓａｅｒｔ
ｖｉｒｕｓ，ＴＧＥＶ）、轮状
２．２
ＤＲｌ３株缺失５１个核苷酸，ＣＶ７７７株
缺失４９个核忭酸（表１）。
ＰＥＤＶ目的片段的ＲＴ－ＰＣＲ鉴定用所设计的特异性引物进行ＲＴ・ＰＣＲ扩增，
结果显示扩增片段大小约７００ｂｐ（图１）。２．３（）ＲＦ３全基因序列分析本试验株（ＦＪ—ｌｌＡ）株的ＯＲＦ３基因有完整的开放阅读框．由６７５个核苷酸组成，所获得的序列向ＧｅｎＢａｎｋ提交获得的登录号为ＪＮ６７６１４５，编码有２２４个氪基酸．（Ｇ＋ｃ）含量为３８．０７％，蛋白分子量为２５．２７ｋＤ。与韩国分离株（ＣＰＦ１０７４、ＰＦＦ５１３）核苷酸同源性最高．为９９．３％；与疫苗株（ＣＶ７７７）核苷酸同源性为９７．８％；与
ｂｐ。ＧＴＣＴＡＣＧＴＧＣＡＧ
上游引物：５７－ＡＡＧ
ＴＧＡＴＧＴ一３’；
下游引物：５，＿ＴＡＣ
ＡＴＴＣＡＣＴ一３７。
１．５
ＴＡＧＡＣＣ
ＡＴＴＡＴＣ
ＰＥＤＶ
泻病毒，并通过分子生物学方法进行了鉴定和对ＯＲＦ３基因进行了分析。将福建源ＰＥＤＶ（ＦＪ－１１Ａ株）的ＯＲＦ３基因与我国北方分离株（ＣＨ／ＪＬ／０９和ＣＨ／ＨＬＪＭｌ０７）［１０３、ＰＥＤＶ韩国株（ＣＰＦｌ０７４、ＰＦＦ５１３、ＤＲｌ３及其弱毒株ａｔｔｅｎｕａｔｅｄＤＲｌ３）［９１和ＰＥＤＶ弱毒疫苗参考株（ＣＶ７７７）［１１］进行遗传进化分析，以期为初步探讨ＯＲＦ３编码蛋白的结构和功能提供参考。
Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ；ＯＲＦ３ｇｅｎｅ；Ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ
猪流行性腹泻（ｐｏｒｃｉｎｅ
ｄｉａｒｒｈｅａ
ｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａ，ｅｐｉｄｅｍｉｃ
等［２１首次报道于英国，我国于１９７６年［３１有ＰＥＤ感染的报道，自２０世纪８０年代后期在我国呈现大面积流行，多见于和猪传染性胃肠炎病毒（ｐｏｒｃｉｎｅ
ＯＲＦ３基因的扩增
ｔＬＬ
取４００“Ｌ病毒液，加入６００
ＴｒｉｚｏｌＲＮＡ
提取液，提取病毒ＲＮＡ。用所设计的引物中的下游引物为反转录引物，按照反转录酶使用说明书进行反转录合成ｃＤＮＡ，一７０℃保存备用。用所设计的特异性引物进行ＰＣＲ扩增，扩增体系为１００ＦＬ，其中２×ＧｏＴａｑＭａｓｔｅｒ
将处于对数生长期的Ｖｅｒｏ细胞弃去培养液，处理好的病料上清加入到Ｖｅｒｏ细胞中，并添加胰酶至终浓度为６
ｔＬｇ・ｍＬ叫［１２＿１３。，３７℃孵育２ｈ
后，加入终浓度为６Ｆｇ・ｍＬ叫胰酶的维持液，３７℃连续观察８４ｈ，连续传代５次，同时设不加病料上清的终浓度为６”ｇ・ｍＬ－１胰酶的维持液Ｖｅｒｏ细胞为对照。观察到有细胞病变（ＣｙｔｏｐａｔｈｉｃＥｆｆｅｃｔ，ＣＰＥ）时收获病毒液，并进行连续多次传代至细胞病变稳定。１．４引物的设计参照ＧｅｎｅＢａｎｋ中登录的ＰＥＤＶ毒株的ＯＲＦ３基因序列，利用ＯＬｉｇｏ７．０设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，扩增的目的片段大小约为７００
叭９
２结果与分析
２．１病毒的分离与传代
（（：ｖ７７７）的ＯＲＦ３全基ｃＩ寸序列血川ＤＮＡＳｔａｒ
ＭｅｇＡｌｉｇｎＢｙＣｌｕｓｔａｌＷＭｅｔｈｏｄ，可见２株弱毒株
均有缺失．相对于ＦＪ—ｌｌＡ株ＯＲＦ３基因．
ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ
病毒经Ｖｅｒｏ传代５代后病变不明显．但随着
传代次数的不断增加，１５代后可见细胞肿胀、变圆、颗粒变性及脱落。
第２６卷
段的线性单股正链ＲＮＡ，目前仅见有１个血清型。ＰＥＤＶ基因组靠近３７端５ｋｂ区域内有５个主要的开发阅读框，编码有典型的冠状病毒结构蛋白：Ｎ蛋白、Ｍ蛋白、ｓＭ蛋白和Ｓ蛋白；其中ＯＲＦ３位于ｓＭ蛋白和Ｓ蛋白之间，编码功能未知的多肽性片段‘７—９｜。２０１０年底首先在我国华南，随后蔓延至全国的哺乳小猪“顽固性腹泻”疾病，具有流行范围广、发病地区多、发病率高和死亡率高等特点，该病主要导致ＮＳＬ－＇ｂ猪出现水样腹泻、呕吐等主要临床特征和肠道出血为主要病理特征。福建省于２０１１年２月初在沿海地区首先出现，随后向内陆逐步发展，发病猪场哺乳小猪的发病率１００％，死亡率在８０％以上，尤其是５日龄内的仔猪，死亡率达到１００％，给养猪业发展造成沉重的打击。当前，由于该病病因复杂，有专家认为是流行性腹泻或传染性胃肠炎，也有专家认为可能是博卡病毒、Ｋｏｂｕ病毒或者是新出现的病毒。本研究针对福建省某猪场发生的腹泻性疾病，采取常规病毒分离的方法，分离到１株猪流行性腹
福建农业学报２６（６）：９４７～９５１，２０１１
ＦｕｊｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１００８—０３８４（２０１１）０６—９４７—０５
猪流行性腹泻病毒ＦＪ—１１Ａ株的分离与ＯＲＦ３基因序列分析
陈如敬，吴学敏，车勇良，王隆柏，魏宏，庄向生，严山，周伦江
ＰＥＤＶ分离株ＯＲＦ３基因处在同一个分支，而弱毒株则处在相对独立的分支。关键词：猪流行性腹泻病毒；ＯＲＦ３基因；序列分析中图分类号：Ｓ
８５２．６５
文献标识码：Ａ
ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＰｏｒｃｉｎｅＥｐｉｄｅｍｉｃＤｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎＦＪ－１１Ａｉｎ
Ｆｕｊｉａｎ
ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ
Ｍｉｘ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。非
ｏｃ
ＤＲｌ３）和弱毒疫苗参考株（ＣＶ７７７）
洲绿猴传代肾细胞（Ｖｅｒｏ）由实验室保存，ＤＨ５大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）感受态细胞自制。
的ＯＲＦ３全基因进行序列比对，并进行遗传进化分析，绘制其遗传进化关系树。
万方数据
第６期
陈如敬等：猪流行性腹泻病毒ＦＪ一１ｌＡ株的分离与（）ＲＦ３基因序列分析
ｏｐｅｎ
ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（０ＲＦ）
ｗｉｔｈ２２４ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＯＲＦ３ｇｅｎｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｉｎＧｅｎＢａｎｋｂｙＤＮＡｓｔａｒｓｏｆｔｗａｒｅ，ｔｈｅＯＲＦ３ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＦＪ一１１Ａｓｔｒａｉｎｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｈｏｍｏｌｏｇｙ
ａｔ
９９．３％ｗｉｔｈＣＰＦｌ０７４ａｎｄＰＦＦ５１３。
ｏｎ
ｉｓｏｌａｔｉｎｇｉｎＳｏｕｔｈＫｏｒｅａ，ａｎｄａｌｓｏｈａｄ９７．８％ｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎＣＶ７７７．Ｂａｓｅｄ
ｇｅｎｅｔｉｃ
ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ，
ｔｈｅＰＥＤＶｓｔｒａｉｎｓｗｈｉｃｈｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＣｈｉｎａｗｅｒｅｉｎｔｈｅｓａｍｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ，ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｃａｎｄｉｄａｔｅｖａｃｃｉｎｅｓｔｒａｉｎｓ（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄＤＲｌ３ａｎｄＣＶ７７７）ｗｅｒｅｉｎｔｈｅｏｔｈｅｒｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃｌｉｎｅａｇｅ．