微生物限度检验方法验证记录
清洁验证微生物检查记录
编号：SMP-09-00702-g
清洁对象名称
供样单位
取样点
检验日期
年 月 日
编号
报告日期
年 月 日
温度
℃
相对湿度
％
检验依据
《中国药典》2015年版四部《非无菌产品微生物限度检查》
标准规定
需氧菌≤100cfu/100cm²；霉菌酵母菌≤100cfu/100cm²
供试液的制备：用棉签擦拭取样点100cm²，将棉签放入无菌具塞玻璃试管中，加入10ml生理盐水中，振摇混匀，作为1:10的供试液。按《非无菌产品微生物限度检查》进行检验。
检查结果
需氧菌
培养箱型号：
培养箱编号：RHBC-ZK-
设定温度：
霉菌、酵母菌
培养箱型号：
培养箱编号：RHBC-ZK-
设定温度：
1
2
阴性
对照
1
2
阴性
Hale Waihona Puke 对照1天1天2天
2天
3天
3天
4天
4天
5天
5天
6天
7天
平均
平均
结果
结果
结论
检验人
复核人
(2020版)药品散剂微生物限度检查法验证记录
（2020版）药品散剂微生物限度检查法验证记录文件编号：XXX-XX-XXXXXX制药有限责任公司XX年XX月XX日XX散微生物限度检查法标准起草说明XX散由XXXXXXXX药材制成，有XXXXX作用。
根据其用药途径和处方，应进行需氧菌总数、霉菌数和酵母菌总数的测定及控制菌大肠埃希菌检查。
本品参照2015版药典进行过方法适用性验证没有发现抑菌性，所以确定需氧菌总数、霉菌数和酵菌总数及大肠埃希菌采用常规法测定。
经对所采用的方法适用性进行试验，符合《中国药典》2020版四部1105非无菌产品微生物限度检查的微生物计数法和1106非无菌产品微生物限度控制菌检查法与1107非无菌药品微生物限度标准，方法可行。
XX散微生物限度检查法标准正文微生物限度：按微生物限度检查法（《中国药典》2020版四部1105非无菌产品微生物限度检查的微生物计数法和1106非无菌产品微生物限度控制菌检查法与1107非无菌药品微生物限度标准。
取样品10克，加PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100ml，制备成溶解均匀的1：10供试液。
需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数取本品1：10供试液1ml，注皿，平行制备平皿(2个平皿需氧菌总数和2个平皿霉菌与酵母菌总数)，按平皿法测定。
大肠埃希菌取本品1：10供试液10ml直接接至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查。
《中国药典》非无菌制剂项下标准规定：需氧菌总数103cfu/g ; 霉菌和酵母菌总数102cfu/g ; 不得检出大肠埃希菌(1g)。
XX散生物限度检查方法适用性试验1、样品名称：XX散批号XXX、XXX、XXX2、验证用菌种：铜绿假单胞菌CMCC﹙B﹚10104、、枯草杆菌CMCC﹙B﹚63501、金黄色葡萄球菌CMCC﹙B﹚26003、白色念珠菌CMCC﹙F﹚98001、黑曲霉CMCC ﹙F﹚98003 大肠埃希菌CMCC﹙B﹚44102.3．实验方法：《中国药典》2015版四部微生物限度方法适用性检查验证实验。
微生物限度检查法验证
氟康唑胶囊规格：0.1g微生物检查的方法验证单位名称：氟康唑胶囊微生物限度检查法验证实验1. 样品：氟康唑胶囊（0.1g）由，批号：1101012. 验证用菌种：枯草芽孢杆菌（CMCC（B）63501）、金黄色葡萄球菌（CMCC（B）26003）、大肠埃希菌(CMCC（B）44102)、白色念珠菌 (CMCC (F) 98001)。
均由中国药品生物制品检定所提供。
3.培养基：营养肉汤培养基，批号：100226；改良马丁培养基，批号：100610；营养琼脂培养基，批号100622；玫瑰红钠琼脂培养基，批号：100603胆盐乳糖培养基，批号：1003172；pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，批号：100708；以上均由北京三药科技开发公司生产。
4.方法：中国药典2010年版二部有关微生物限度检查法方法验证试验。
5.具体操作方法5.1菌液制备：（1）取经32.5±2.5℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物1ml+9ml 0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-4~10-6，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
（2）取经25.5±2.5℃培养18~24小时的白色念珠菌改良马丁培养基的液体培养物1ml+9 ml 0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-6，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
5.2 供试液制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液适量至100ml成1：10的供试液，低速离心（500r/min）3分钟，取上清液为供试液（1），再取供试液（1）2ml 用缓冲液稀释成20ml，为1：100的供试液（2）。
5.3 回收率测定：（1）试验组：a. 细菌薄膜过滤法（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌）：分别取1：10的供试液（1）1ml，每膜用300ml缓冲液（每次约100ml）冲洗，冲洗最后一次结束时加入50～100 cfu /ml试验菌株，菌面朝上放入琼脂培养基平皿中，置规定温度培养24~48小时观察，结果见表1。
微生物限度检查验证记录
品名
批号
验证日期
细菌：
培养基
培养时间
小时
培养温度
℃
验证菌种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
样品底
菌数
对照组
试验组
菌液组
对照组
试验组
菌液组
对照组
试验组
菌液组
平皿号
菌落数（个/皿）
平均菌数（个/皿）
回收率（%）
霉菌和酵母菌数：
培养基
培养时间
小时
培养温度℃Biblioteka 验证菌种白色念珠菌
黑曲霉菌
样品底菌数
试验组
菌液组
试验组
菌液组
平皿号
菌落数（个/皿）
平均菌数（个/皿）
回收率（%）
金黄色葡萄球菌：
培养基
营养肉汤增菌液
培养温度
培养时间
营养肉汤增菌液
甘露醇氯化钠或卵黄氯化钠
染色镜检
血浆凝固酶试验
结果
阴性
样品
阳性
铜绿假单胞菌检查：
培养基
胆盐乳糖增菌液
培养温度
培养时间
胆盐乳糖增菌液
溴化十六烷基三甲铵琼脂
染色镜检
生化反应
结果
氧化酶
绿脓菌素
阴性
样品
阳性
梭菌检查：
培养基
0.1%新鲜庖肉培养基
培养温度
培养时间
庖肉培
增菌液
混浊
产气
消化
碎肉
哥伦比亚培养基
染色镜检
过氧化氢酶试验
结果
阴性
样品
80℃保温样品
阳性
本品按检查，
结果。
检验人：复核人：
纯化水微生物验证方案和记录
纯化水微生物限度检测验证记录项目名称纯化水微生物限度检测验证记录项目编号验证形式检验方法验证原始记录验证日期2014年10月起草人刘君审核人朱小群批准人刘荣富泰柯棕化（张家港）有限公司2014年10月验证小组名单组长：成员：验证报告批准目录1、引言 (5)1.1概述 (5)1.2验证的目的 (5)1.3验证的意义 (5)1.4验证的时机 (5)1.5验证的依据 (5)1.6验证人员的职责 (5)2、验证内容 (5)2.1供试品 (5)2.2仪器设备 (6)2.3培养基 (6)2.4菌种 (7)2.5稀释液 (7)2.6器具 (7)2.7相关文件 (7)3、方法建立 (8)3.1实验组 (8)3.2菌液组 (8)3.3供试品对照组 (8)3.4稀释剂对照组 (8)4、实验操作 (8)4.1供试液的制备 (8)4.2菌液的制备 (8)4.3试验记录.............................................................................................9-11 4.4回收率计算 (12)4.5结果判断 (12)5、验证结论 (12)1、引言：1.1 概述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数及控制菌检查。
1.2 验证的目的:确认所采用的薄膜过滤法适合于纯化水的细菌,霉菌及酵母菌数的测定。
1.3 验证的意义:保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
1.4 验证的时机：（1）建立纯化水的微生物限度检查法时。
（2）修订的检查方法时。
（3）供试品的生产工艺或原检验条件发生改变可能影响检验结果时。
（4）定期的方法验证。
1.5 验证的依据：1）中国药典2010版附录Ⅺ J微生物限度检查方法验证。
2）中国药典2010版附录ⅪⅩ P微生物限度检查法应用指导原则。
2 验证内容：2.1 供试品：品名：纯化水规格：批号：单位：泰柯棕化（张家港）有限公司。
微生物限度检查方法学验证原始记录
微生物限度检查方法验证原始记录（平皿法）
验证类别：□初次验证□周期性再验证
样品来源：□研发中试产品□研发试生产产品□正式生产产品
验证药品名称：规格：
验证起止时间：年月日～年月日
一、计数方法验证
1、实验条件
样品名称：批号：
培养基：营养肉汤培养基批号：配制日期：营养琼脂培养基批号：配制日期：
改良马丁液体培养基批号：配制日期：
改良马丁琼脂培养基批号：配制日期：
玫瑰红钠琼脂培养基批号：配制日期：
胆盐乳糖培养基批号：配制日期：
MUG培养基批号：配制日期：
蛋白胨批号：配制日期：
稀释剂：0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液配制日期：
培养箱：□设备型号：SPX-150 培养温度：30～35℃
□设备型号：LRH-150B 培养温度：23～28℃
2、环境测试
测试时间：年月日操作人：复核人：沉降菌菌落数：无菌室：左中右
净化台：左中右空白对照
3、菌种
大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B)44102〕编号：
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〔CMCC(B) 26 003〕编号：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 〔CMCC（B）63501〕编号：
白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕编号：
黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F)98 003 编号：
（1）微生物生长检查记录（1）
样品名称：样品批号：
样品名称：样品批号：
时间：年月日计数人：复核人：
样品名称：样品批号：
（2）回收率记录
统计时间：统计人：复核人：。
微生物限度检验
2007.4
1
微生物限度检查 (Microbial Limits Test) ：
是指非无菌制剂及原，辅料受到微生物污染程度的检查。 包括：
1）细菌计数； 2）霉菌及酵母菌计数； 3）控制菌检查：大肠杆菌，沙门菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡 萄球菌，大肠菌群
2
细菌、霉菌及酵母菌计数
稀释剂对照组：
蛋白胨稀释液 9.9ml 104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
计数B （阴性对照）
菌种组：
104 102
计数C （阳性对照）
空白样品组：
计数D
24
结果判断依据：
1、样品组和稀释剂对照组微生物计数结果吻合，表明： - 添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。 2、稀释剂对照组和菌种组微生物计数结果吻合，表明： - 中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。 - 测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。 3、空白样品组测试结果阴性，表明： - 本次测试样品合格。 - 无菌操作正确。没有污染事件发生。
甘露醇氯化钠琼 脂 (或卵黄氯化钠琼 脂) 35-37 ℃,18-72h
0.2ml 涂抹于 含庆大霉素的哥 伦比亚琼脂 厌氧, 35-微生物限度检查法与英美比较
比较项目
检验条件规定 计数测定方法 控制
ChP2005
总体10000级、局部100级 平皿法、薄膜过滤法、MPN 大肠埃希菌、大肠菌群、沙门 菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡 球菌、梭菌、其他致病菌 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液； pH6.8/7.6PBS；0.9%NaCl 细菌数：营养琼脂，48hrs 霉菌及酵母：玫瑰红钠琼脂， 72hrs,5～7天
10
恢复试验
- 微生物方法验证的实质就是评价和考察微生 物恢复试验（恢复生长）的可信度。 - 恢复试验就是确认某一检验方法，它可以使 加入其中的各种微生物都能够恢复生长。
微生物限度方法学验证完整版
微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。
（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。
（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。
（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。
微生物限度检查方法及其验证报告记录(修改)
微生物限度检查方法及其验证报告记录(修改)————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录1 样品相关信息1.1 基本信息2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备2.2 试验用培养基2.3 试验用试剂2.4 试验用菌种3 试验环境3.1 无菌室3.2 洁净工作台3.3 生物安全柜4 试验方案4.1 验证试验目的4.2 微生物限度检查方法草案5 方法验证试验5.1 菌液制备5.2 计数培养基适用性检查5.3 控制菌检查用培养基使用性检查5.4 供试液制备5.5 方法验证5.5.1 菌落计数方法验证试验5.5.2 控制菌检查方法的验证5.6 方法验证结论6 供试品微生物限度检查结果1 样品相关信息1.1 基本信息（三批）品名多烯酸乙酯软胶囊或蛹油α-亚麻酸乙酯胶丸规格0.25g/粒，30粒/瓶或0.3g/粒，30粒/瓶批号2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备仪器名称型号编号培养箱HH·BⅡ·360ZL-025 MJX-150ZL-042 SPX-150B ZL-046 JJ-5 ZL-026电子天平JY1001 ZL-013超净工作台JH-DCB ZL-028生物安全柜BSC-1100ⅡA2ZL-0292.2 试验用培养基2.2.1 对照培养基培养基名称批号生产厂家胰酪大豆胨琼脂培养基中国食品药品检定研究院胰酪大豆胨液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基RV沙门增菌液体培养基2.2.2 试验用培养基培养基名称配制批号胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基RV沙门增菌液体培养基2.3 试验用试剂试剂名称配制批号含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%氯化钠1%红四氮唑2.4 试验用菌种菌种名称菌种编号工作用菌种批号及代数信息大肠埃希菌CMCC（B）44 102 E3-02枯草芽孢杆菌CMCC（B）63 501 E3-02金黄色葡糖球菌CMCC（B）26 003 E3-02乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094 E3-02 白色念珠菌CMCC（F）98 001 E3-02黑曲霉CMCC（F）98 003 E3-023 试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
新版GMP微生物限度检查法验证报告
*******微生物限度检查法验证报告文件编号：VMP-VV-502REP-00起草人：审核人：批准人：批准日期：年月日通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查，根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
2.验证目的及范围确认所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该品种药品的微生物限度检查，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
本次验证为试验组和对照组的菌回收率试验；控制菌检验方法的灵敏性、检出率及专属性试验。
3.验证风险评估对于本次验证的执行进行了如下的风险分析：4.验证前准备4.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。
培训人员记录见附件1。
4.2将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没4.3仪器与器具：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台、无菌培养皿、无菌移液管。
5.验证内容5.1测试环境条件要求所有检查在环境洁净度C级下的局部A级洁净度的单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。
5.2试验样品*******批号：；规格：）5.3验证用菌种及培养基：5.3.1来源：食品药品检验所5.3.2菌落计数用菌种注：编号由菌种首字母-传代代数-配制日期组成。
5.3.3培养基及其制备方法：取市售的脱水培养基，分别按照规定方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌，在实验前加温熔化备用。
5.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：按照中国药典2010年版微生物限度检查法中的平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数。
药品微生物限度检查方法验证试验
吉林九鑫药业有限公司检验原始记录药品微生物限度检查方法验证试验1、检品名称：更年宁检品批号：201110012、验证依据：《中国药典2010年版》微生物限度检查方法验证试验3、仪器：BP211D塞多利斯电子天平SPX－2503型生化培养箱SKP－01电热恒温培养箱YJA－电动匀浆仪4、培养基：营养琼脂培养基批号：081217 玫瑰红钠琼脂培养基批号0902022：营养肉汤培养基批号：20110211 胆盐乳糖增菌液批号：20110612 乳糖胆盐发酵培养基批号：0901052 MUG 培养基批号：20110302甘露醇氯化钠琼脂培养基批号：0930023 麦康凯琼脂培养基批号：2010pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液批号：20110212 改良马丁琼脂培养基批号 20100101 生产单位：北京三药科技开发公司靛基质试液 0.9%氯化钠溶液5、细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证5.1 验证用菌种：大肠埃希菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌白色念球菌黑曲霉菌来源：巿药检所5．2菌液制备：5．2.1 取经35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物2～3白金耳加入9ml 0.9％氯化钠溶液中，10倍稀释至10-3～10-7约为50～100cfu/ml,做活菌计数用。
5、2．2 取经25℃培养18～24小时的白色念珠菌液体培养物2～3白金耳加入9ml 0.9％氯化钠溶液中，10倍稀释至10-3～10-7约为50～100cfu/ml,做活菌计数备用。
5.2.3 取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9％氯化钠溶液3ml，洗下霉菌孢子，取0.1ml 加入9ml 0.9％氯化钠溶液中，10倍稀释至10-3～10-7约为50～100cfu/ml,做活菌计数备用。
5.3 操作方法：本品按照常规方法检验，细菌、霉菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌回收率均大于70％，所以细菌、霉菌及酵母菌数测定应采用常规法。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 参考标准 (3)4. 接受标准 (3)5. 人员职责 (3)6. 抽样计划 (4)7. 设备、试剂和菌种信息 (4)8. 方法适用性试验 (5)9. 文件控制 (6)10. 不合格情况处理 (6)11. 再验证周期 (6)12. 附件清单 (6)1.目的根据中国药典2020版微生物限度检查法的要求，对产品的微生物限度检查法进行验证，以确定所采用的方法适合于本产品的微生物限度检查，即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。
保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
2.适用范围适用于本司产品的微生物限度检查。
3.参考标准《中华人民共和国药典》（2020版第四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定》《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的估计》4.接受标准4.1.阴性对照组不长菌；4.2.回收率（试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值）应在0.5~2范围内；4.3.若回收率小于0.5，考虑产品有抑菌性，则重新考虑检查方法的建立。
5.人员职责5.1.成员及其职责详见表一：表一人员及职责5.2.培训要求确保参与验证的所有人员了解其职责和角色，以及验证的过程和要求。
验证开始前，负责本次验证的检验员将对参与确认执行的人员讲解验证的过程和要求，并记录在《培训记录》中。
适用时，培训考核记录作为附录包含在验证报告中。
6. 抽样计划随机抽取3个批次，每个批次随机抽取7套样品。
具体信息详见表二：表二 样品信息确认人/日期： 复核人/日期： 7. 设备、试剂和菌种信息 7.1. 设备信息详见表三表三 设备信息确认人/日期：复核人/日期： 7.2. 试剂信息详见表四表四 试剂信息确认人/日期： 复核人/日期： 7.3. 菌种信息详见表五表五 菌种信息确认人/日期：复核人/日期：7.4.菌液的制备用接种环取枯草芽孢杆菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取金黄色葡萄球菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取铜绿假单胞菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的斜面培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。
微生物限度检验记录式样
微生物限度检验记录式样名称：________________种类：________________生产批号：___________________检验日期：___________________检验项目：微生物限度检验检验目的：为了评估样品的微生物质量，保证产品的安全性和稳定性。
检验原理：根据国家标准方法，对样品进行微生物限度检验。
检验仪器和试剂：1.培养基：牛肉膏培养基、营养琼脂培养基等2.培养基固化器3.可灭菌离心管4.称量仪5.稀释液6.离心机7.干燥器8.显微镜9.微量移液器和移液枪10.注射器11.恒温培养箱12.培养基平板13.称重天平14.微生物限度试剂15.培养基扩展工具16.无菌培养皿检验步骤：1.样品准备将样品称量约10g，加入已经去离子水或生理盐水中，并使用搅拌棒搅拌均匀，使样品完全悬浮。
2.稀释取1mL悬浮样品加入9mL稀释液中，得到10倍稀释液。
依序对稀释液进行1/10、1/100，求得合适的稀释倍数。
3.培养基涂布取样品稀释液分别用无菌鉴别板扩展在牛肉膏培养基和营养琼脂培养基上，使用温度适宜的顶酵母、肠球菌染色和试纸进行培养基涂布。
4.培养将涂布后的培养基平板密封好，放置在恒温培养箱中，设置适宜的培养温度和时间。
5.细菌计数培养箱培养结束后，取出培养基平板，使用显微镜对每个培养基平板上的细菌进行计数。
计算每个培养基平板上的菌落形成单位（CFU）数目。
6.菌种鉴定依据菌落形态、生理生化反应、药敏试验等方法进行菌种的初步鉴定，记录鉴定结果。
7.结果记录将每个培养基平板上的菌落形成单位数目记录在表格中，并记录每个菌落的特征和形态。
8.结论与建议根据检验结果，评估样品的微生物质量，判断样品是否符合限度标准。
如果有异常菌落存在，则建议进行进一步检验、处理或采取相应的措施。
记录：检验项目，检测结果--------------，-------------------------菌落计数，牛肉膏培养基：__CFU/g营养琼脂培养基：__CFU/菌种鉴定--------------，-------------------------鉴定结果：1.菌种1：________2.菌种2：________3.菌种3：________结论：样品通过微生物限度检验，各指标符合国家标准。
微生物限度检查方法学验证报告模板
微生物限度检查法验证试验报告1、样品：奥氮平盐酸氟西汀胶囊（批号20140807，20140808，20140809），规格：12mg/25mg2、试液与稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：）、0.9%无菌氯化钠（批号：）、1%红四氮唑（批号：）、含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：）。
3、主要的设备及器具：净化工作台（型号）、培养箱（型号）、电子天平（型号）、恒温摇床（型号）、生物安全柜（型号）、无菌培养皿、菌落计数器、接种环、、酒精棉球、酒精灯、刻度吸管（1ml，10ml）、锥形瓶、试管及试管塞、吸耳球、显微镜等。
4、验证试验用菌种：大肠埃希菌CMCC(B)44 102、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63 501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003、白色念珠菌CMCC(F)98 001、黑曲菌CMCC(F)98 003，均由中国药品生物制品鉴定所提供。
5、对照培养基：4-甲基伞形酮葡萄苷酸（MUG）培养基（批号），胆盐乳糖发酵培养基（批号），胆盐乳糖培养基（批号）；玫瑰红钠琼脂（批号）；营养琼脂（批号），营养肉汤培养基（批号），均由中国食品药品检定研究院提供。
6、试验用培养基：营养琼脂培养基（批号）；玫瑰红钠琼脂培养基（批号）；营养肉汤培养基（批号）；改良马丁培养基（批号），胆盐乳糖培养基（批号）；4-甲基伞形酮葡萄苷酸(MUG)培养基（批号），由******公司提供（配制）。
7、试验方案按《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ微生物限度检查法规定，本品微生物限度标准应为：1g供试品中，细菌数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
7.1 验证试验的目的对所采用的方法进行验证，确认该方法适用于本品的微生物限度检查，即确认本品在该检验量及检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除至可忽略不计，以确保检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
微生物限度检查方法学验证实验
生物安全柜（Biological safety cabinets， BSCs）是为操作原代培养物、菌毒株以及诊 断性标本等具有感染性的实验材料时，用来 保护操作者本人、实验室环境以及实验材料， 使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的 感染性气溶胶和溅出物而设计的。
生物安全柜正广泛用于微生物和生物工程及 其他对操作环境有苛刻要求的场所，目前正 在为医疗卫生、制药、科学研究领域提供无 菌、无尘的可移动的工作环境。
用于微生物限度验证的菌种
菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)
菌种的要求：不得超过5代,采用适宜的方法保存。
CMCC (China Medical Culture Collection Center) 中国医学微生物菌种保藏管理中心 B- Bacteria(细菌) F-Fungi(真菌)
(1) 不确定性:药品受外来微生物的污染,这种 污染是可有可无;在有中又可多可少;其种类可 以多样.污染的情况依生产,设备,原材料,管理, 剂型等等条件而定,非药品本身所固有.所以微 生物限度检验的对象是不确定的.药品所规定 的项目,除无菌检查,热原具有上述性质,其他 项均无此特征.这一点往往被忽视.污染对药品 而言是一个意外事件.污染批号中的不合格品 是一个随机变量.
结果时 。 定期的验证。
同一产品不同批次、不同企业生产的同一产品。
当建立药品的微生物限度检查方法时，应进 行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证， 以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、 霉菌及酵母菌数的测定。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵 母菌计数所规定的方法及下列要求进行，对 各试验菌的回收率逐一进行验证。
产单位全面质量管理水平与提高药品质量的 重要措施.
微生物限度检查记录
取样点
稀释度
碟号1
碟号2
平均
菌落数
总菌落数
报告
菌落数
空白
培养基
名称
标准规定
结论
供试液
玫
瑰
红
钠
培
养
基
不
得
过
25个/25cm2
阴性对照
供试液
阴性对照
供试液
阴性对照
供试液
阴性对照
供试液
阴性对照
供试液
阴性对照
检验人复核人
微生物检查记录（验证）（附页）
表-ZL00124
大肠杆菌检查培养温度（36℃±1℃）始温℃末温℃
细菌菌落数测定培养温度（30℃~35℃）始温℃末温℃
培养时间月日时分至月日时分
取样点
稀释度
碟号1
碟号2
平均
菌落数
总菌落数
报告
菌落数
空白
培养基
名称
标准规定
结论
供试液
营
养
琼
脂
培
养
基
不
得
过
100个
/25cm2
阴性对照
供试液
阴性对照
供试液
阴性对照
供试液
阴性对照
供试液
阴性对照
供试液
阴性对照
表-ZL00123霉菌菌落数测定培养温度（25℃~28℃）始温℃末温℃
取样点
BL
MUG
I
EMB
（Macc）
革兰氏染色
Lac
IMViC
结果
标准
规定
结论
供试液
不
得
检
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
计数 (CFU)
均值 (CFU)
22 26 24
金黄色葡萄 球菌
36 39
38
枯草芽孢杆 菌
62 66
64
铜绿假单胞 菌
58 54
56
生孢梭菌 20 20
20
菌种 计数(CFU) 均值(CFU)
表2 真菌数计数结果 黑曲霉菌
白色念珠菌
86
93
86
83
89
85
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
5
第5页
10－4稀释 10－5稀释 10－7稀释
试验次数
1 2 1212
金黄色葡萄球菌
56 60
枯草芽孢杆菌
77 79
白色念珠菌
86 70
黑曲霉菌
80 76
铜绿假单胞菌
47 50
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
方法： 中国药典相关微生物程度检验法方法验 证试验。
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
30
第30页
详细操作方法
菌液制备： (1)取经37℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌 、大肠埃希菌、枯草杆菌肉汤培养物 1ml+9ml盐水，10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌 数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
20
第20页
供试液制备：每2支以100ml生理盐 水溶解，混匀备用。
薄膜过滤：将要求量供试品按薄膜 过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在最 终一次冲洗液中逐一加入试验菌少于 100CFU。按要求将培养基直接加至 滤筒内。天天观察并统计结果。
微生物检验方法验证方案
微生物限度检查方法验证XX公司微生物限度检查方法验证方案目录1. 验证目的2.验证小组及职责分工2.1验证小组2.2职责分工3.验证程序4.验证结论及综合评价1. 验证目的确认所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该药品的微生物限度检查。
2.验证小组及职责分工2.1验证小组组长：小组成员：2.2职责分工组长：负责验证期间各部门的协调及整个验证过程的具体实施。
分析中心（微生物室）：负责验证方案的起草及具体实施，确保验证过程能按方案规定的程序进行，对各种验证资料（验证结果）应及时交与GMP组相关人员整理。
GMP办：负责验证方案的编写规范；负责各种验证资料（检查结果）的收集整理及结果的审核；审查验证报告及发放验证报告。
质量管理部：参与验证方案的编制；负责验证方案的审核及批准；负责出具检验报告；并对微生物限度检查环境进行检测；负责验证文件的管理。
3．验证内容3.1品种：XXXX；批号：。
3.2培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，批号；霉菌液体培养基，批号；营养肉汤培养基，批号；营养琼脂培养基，批号；0.1%蛋白胨溶液，批号；虎红钠琼脂培养基，批号；由中检所培养基室提供。
（根据检验要求选择适宜的培养基）3.3方法：微生物限度检查方法验证（《中国药典》2005年版）。
3.5计数方法的验证3.5.1 验证试验用菌种：验证试验用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
a.大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44102〕b.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〔CMCC(B) 26 003〕c.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 〔CMCC(B) 63 501〕d.白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕e.黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F)98 003.5.2菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养18～24h；黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基，培养5～7天。
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微生物限度检验方法验证记录1.适用范围本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。
2.目的通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，确保该产品微生物限度检查结果的正确性。
3.职责项目责任人:负责验证方案的起草及具体实施。
验证管理员:负责验证工作的组织、协调及管理。
QA现场监控员:负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。
QC负责人:负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。
QC检验员:负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。
质量部经理:负责验证方案及报告的审核和批准。
4. 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。
根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行实验，根据实验结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查;若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
5.检查和确认5.1微生物限度检验室，洁净级别1万级;超净工作台，局部100级(确认方法:审阅相关的验证资料)。
微生物限度检验室(洁净级别1万级)验证报告超净工作台(洁净级别100级)验证报告检查结论:验证资料完整，符合相应洁净度要求且在有效期内。
检查人: 日期:5.2与验证相关的文件(确认方法:检索)。
微生物限度检查法操作规程和检定菌传代操作规程净化工作台使用操作规程微生物限度检验室清洁消毒规程培养箱标准操作规程检查结论:验证所需资料齐全、完整，符合验证要求。
检查人: 日期:5.3检验用仪器设备(确认方法:检查、核对)。
符合3Q(IQ、OQ、PQ)要求。
5.3.1 培养箱型号: HP400S生产厂家: 武汉瑞华仪器设备有限公司校验有效期至: 年月日设定温度: 32.5?型号: PYX-280S-A生产厂家: KELI 科力仪器校验有效期至: 年月日设定温度: 25.5?5.3.4超级净化层流台型号: YJ-875生产厂家: 苏州市姑苏空调净化有限公司验证有效期至: 年月日检查结论: 符合要求检查人: 日期:5.4检验用菌种、培养基和试液(确认方法:检查、核对)金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003] 批号生产厂: 中检所枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501] 批号生产厂: 中检所大肠埃希菌[CMCC(B)44102] 批号生产厂: 中检所白色念珠菌[CMCC(F)98001] 批号生产厂: 中检所黑曲霉菌[CMCC(F)98003] 批号生产厂: 中检所β-内酰胺酶:2ml(大于200单位/ml)批号生产厂: 中检所硫乙醇酸盐流体培养基批号: 生产厂: 北京三药科技开发公司改良马丁培养基批号: 生产厂: 北京三药科技开发公司营养肉汤培养基批号: 生产厂: 北京三药科技开发公司改良马丁琼脂培养基批号: 生产厂: 北京三药科技开发公司检查结论: 符合要求检查人: 日期:6. 菌液制备(1)金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml 9ml0.9%无菌NaCl溶液至_______含菌量_______CFU/ml [CMCC(B)26003] 第_____代 10倍系列稀释(2)枯草芽孢杆菌新鲜肉汤培养物1ml 9ml0.9%无菌NaCl溶液至_______含菌量_______CFU/ml [CMCC(B)63501]第_____代 10倍系列稀释(3)大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml 9ml0.9%无菌NaCl溶液至_______含菌量_______CFU/ml [CMCC(B)44102]第_____代 10倍系列稀释(4)白色念珠菌新鲜改良马丁培养物1ml 9ml0.9%无菌NaCl溶液至_______含菌量_______CFU/ml [CMCC(F)98001]第_____代 10倍系列稀释(5)黑曲霉新鲜孢子洗脱液1ml 9ml0.9%无菌NaCl溶液至_______含菌量_______CFU/ml [CMCC(F)98003]第_____代 10倍系列稀释7. 实验方案7.1无抑菌活性的供试品供试液的制备7.1.1稀释剂:pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液7.1.2液体供试品:供试品10ml置锥形瓶中，加入90ml稀释剂，混匀，作为供试液(1:10)。
7.1.3固体、半固体、粘稠性供试品: 称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液(1:10)。
7.2具有抑菌活性的供试品供试液的制备当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下:7.2.1离心沉淀集菌法:取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟(供试液如有沉淀，先以500转/分钟离心5分钟，取全部上清液再离心)，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。
7.2.2薄膜过滤法:取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，按薄膜过滤法测定其菌落数。
7.3 菌液组测定所加的试验菌数。
采用平皿法，取试验用的1ml菌液(约50,100cfu)分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
7.4试验组7.4.1平皿法:取试验可能用的最低稀释级1ml供试液和50,100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
7.4.2薄膜过滤法:取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50,100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。
至少要一张膜。
7.4.3离心沉淀集菌法:取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心3~5分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1ml液体，并用稀释剂洗涤管底，将洗涤液与1ml液体一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。
7.5 供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数(方法和试验组相同)。
7.6稀释剂对照组若供试液需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法等处理时，应增加稀释剂对照组，用稀释剂代替供试品，加入试验菌，使最终浓度为每1ml 供试液含50,100cfu，按试验组的供试液制备方法和计数方法计数。
7.7回收率计算7.7.1试验组回收率计算试验组的菌回收率—供试品对照组平均菌落数试验组的菌回收率, ×100% 菌液组的平均菌落数7.7.2 稀释剂对照组回收率计算稀释剂对照组平均菌落数稀释剂对照组回收率, ×100% 菌液组的平均菌落数计数方法验证至少应进行3次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
7.8结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)?70%。
若试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)?70%。
照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，使试验组菌回收率大于70%。
8. 验证方法(见附表)9.再验证9.1.药品的组分发生改变可能影响检验结果时。
9.2.验证时检验条件发生改变可能影响检验结果时。
附表: 微生物限度检查法验证报告品名头孢克肟分散片规格 g 来源头孢片剂车间批号检验依据中国药典2010年版二部附录微生物限度检查法验证时间年月日1、供试液制备:称取样品10g，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，振摇混匀，以上清液作为1:10供试液，备用。
方 2、细菌检查试验组:取1:10供试液10ml(相当于1g供试品)过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲法液 ml分次冲洗，最后一次冲洗液中分别加入上述3种代表试验菌液各1ml，抽干，取出滤描膜，贴于营养琼脂培养基平板上依法培养，计数。
述 3、霉菌和酵母菌检查试验组:取浓度为1:10供试液各1ml;分别加上述2种代表试验菌液各1ml，按常规法检验。
4、菌液组、供试液对照组等其他组别参照上述方法制作。
细菌实验结果培养箱设定温度:细菌32.5?;真菌25.5?菌种名称金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠埃希菌白色念珠菌黑曲霉菌种代数代代代代代菌液组菌落数第试验组菌落数供试液对照菌数一试验组菌回收率次稀释剂对照菌数稀释剂菌回收率菌液组菌落数第试验组菌落数供试液对照菌数二试验组菌回收率次稀释剂对照菌数稀释剂菌回收率菌液组菌落数第试验组菌落数供试液对照菌数三试验组菌回收率次稀释剂对照菌数稀释剂菌回收率上表可见，细菌采用薄膜过滤法、霉菌采用常规方法检验头孢克肟分散片，人工污染5株代表菌株，该供试品对5株代表菌株的回收率均高于70%，表明方法成立。
确定头孢克肟结论分散片微生物限度检查法为细菌数采用薄膜过滤法(冲洗ml)、霉菌数采用常规法进行检查。
检验人: 年月日复核人: 年月日审核结论:审核人: 年月日。