仔猪专用益生乳酸杆菌菌种的分离

（)?1B/ 等， 。健康仔猪膜菌群 成存在显著差异 !""’） 上的乳酸杆菌对帮助断奶腹泻仔猪恢复消化道粘膜 微生物区系， 从而促进胃肠健康恢复可能具有重要作 用。 本试验的目的是从健康断奶仔猪胃肠道粘膜分离 出足够数量的能用作益生素的乳酸杆菌菌种， 以供进 一步的体外选育。 乳酸杆菌类益生素曾广泛用于防治疾病、 保健和 （-;<=， 病后恢复健康 ， 使用效果与其菌种的质 &555） （>?@@;A， 量和来源关系很大 。 研制益生素的第一 &545） 步是获得优良菌种， 优良菌种的基本条件是能够在宿 主动物胃肠道粘膜细胞粘附、 繁殖并发挥对宿主动物 （周德庆和郭杰炎， 健康有益的作用 。不同种属 &555） 动物或同种不同年龄动物以及同种同年龄但不同胃 肠道部位分离的微生物对胃肠道的粘附具有动物种 属、年龄和胃肠道部位特异性，体外测定的粘附力试 验结果不能说明体外微生物对胃肠道粘膜细胞粘附 （+;=;A0;B 和 C1BB.DE， 的实际情况 。 分离自同种 &545） 同年龄动物胃肠道的菌种是益生素制剂菌种的最佳 来源（>?@@;A，&555） 。动物膜菌群与肠内容物菌群不 同，不受日粮类型、肠蠕动速度等影响，组成相对稳 定，膜菌群是构成定植抗力的重要因素之一（祝小枫 等， 。乳酸杆菌是猪胃肠道的优势菌群， 对胃肠 &55%） （>?@@;A 等， 道微生态区系有重要调整作用 何明 &574； ） 清等， 健仔猪膜菌群的乳酸杆菌组 &548 。断奶后病、
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材料与方法
肠乳酸杆菌分离培养基
将 -./.01 ,2 完全选择 性培养基 （+.G;@@ 等， 作适当修改， 配方如下： 胰蛋白胨， 酵母浸 !"""） &"/； 葡萄糖， 阿拉伯糖， 蔗糖， 七水硫酸 粉， %/； &"/； %/； %/； 镁， 四水硫酸锰， 硫酸亚铁， 吐温 "F %4/； "F !%/； "F ":/； 琼脂， 蒸馏水， 用醋酸调节 3) ( 4"， &/； &:/； & """H@， 至 %F "。 !F ! 胃乳酸杆菌分离培养基 根据 -./.01 ,2 完全选择性培养基（+.G;@@ 等， 作适当修改， 配方如下： 胰蛋白胨， 酵母浸 !"""） &"/； 粉， 葡萄糖， 阿拉伯糖， 蔗糖， 醋酸钠， %/； &"/； %/； %/； &%/；枸椽酸铵，!/；磷酸二氢钾，8/；七水硫酸镁， 四水硫酸锰， 硫酸亚铁， 吐温 ( "F %4/； "F !%/； "F ":/； ， ； 琼脂， ； 蒸馏水， ， 用醋酸调节 4" &/ &:/ & """H@ 3) 至 再用浓盐酸调 3) 至 ’F %。 %F ’， !F : 厌氧滚管的制备 在 :%H@ )?B/1I;0 管中加入 4H@ 培养基，用新配 制的 "F &6 刃天青溶液作氧指示剂，加热后趁热充 待培养基颜色变无色时， 加盖封口， JK! 气体， &!&L 蒸汽灭菌 %H<B 后， 在冰水浴中迅速做成滚管。
$%&%’( 焰上轻轻烘干固定。滴加结晶紫染色液， 染 +2>8， 水
洗； 滴加革兰氏碘液媒染， 作用 +2>8， 水洗； 滴加丙酮 乙醇混合液（丙酮D E-6 乙醇 F 0D B）脱色 0,’，水洗； 最后滴加沙黄染色液复染 +2>8，水洗，待干， 在普通 光学显微镜下观察，菌体呈红色的为阴性，紫色的为 阳性。 选择革兰氏阳性菌、 染色浓度深浅不均匀、 形态 一致的杆菌， 进一步做接触酶试验。 制作厌氧 $%&%’( )* 斜面培养 !" ." ! 基，取培养物约 ," !23 注入到装有 $%&%’( )* 培养基 斜面， 长出菌落后， 将 -6 ;<! 培养箱， 0B= 培养 !#C， 06 过氧化氢溶液滴加到菌落上，如果没有气泡冒出 说明是阴性， 如有气泡说明是阳性。 $%&%’( )* 厌氧培 养的培养物经革兰氏染色阳性和接触酶阴性的分离 培养物鉴定为乳酸杆菌属。 接触酶试验
“十五 ” “生物饲料添加剂研究与 国家 攻关计划 # 基金项目： 开发 ” ， 批准号： !""!#$%&’$ ( &! 黄沧海， 集美大学水产学院水产生物技术研究所， 博士， 讲师， 福建厦门集美区印斗路 ’: 号。 :8&"!& ， 谯仕彦、 李德发， 国家饲料工程技术研究中心。 陈东晓， 单位及通讯地址同第一作者。 收稿日期： !""’ ( "7 ( !!
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小结
经盐酸校正的 $%&%’( )* 培养基适用于分离仔猪 胃肠道的乳酸杆菌， 分离出来的 B ,,E 株乳酸杆菌为 下一步研究提供了良好选育材料。
参考文献
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! （ 取健康仔猪胃肠道粘膜 -?2 胃、十二指肠、空 肠、 回肠、 盲肠和结肠 ） ， 在无菌烧怀中， 用无菌生理盐
水冲洗粘膜上的食糜， 将粘膜浸入装有 +-23 5@A@) 缓冲液的烧杯中， 用镊子来回摇动粘膜 -2>8 后。 用无 菌注射器吸取 ," !23 上清液注入装有 $%&%’( )* 琼 脂的 578&(9:’ 滚管中，用手轻轻滚动使上清液均匀 分布在管中琼脂表面。 放入 -6 ;<! 培养箱， 0B= 培养 B!C 之后，在生物安全柜里无菌操作将白色针尖大小 的菌落用针头挑取转移到厌氧无菌 $%&%’( 肉汤里进 行培养，观察肉汤是否变浑浊，有浑浊的放置 #= 冰 箱贮藏备用。 !" . !" ." + 乳酸杆菌鉴定 革兰氏染色 用无菌注射器吸取少量上述 滴在载玻片上， 在酒精灯火 )* 肉汤培养物，
!" # $$ % &’(()*+ ,-. /- 0- 12**34. 256 1- 7- 1*338)*- 129:)*;2 2<<39;2:)6 4;:= :=) >2<:*;9 )?;:=)(;’@ 3A 5)352:2( ?;><- 0??(- 75B;*353(- !FGH ， %"I "H$ # "F! J K’25>. L- K-. M- N- O;23. P- &- Q;. R- M- /;23. 256 S- /- ,)5- 7AA)9:< 3A Q29:3D29;((; 35 :=) ?)*A3*@259). 6;2**=)2 ;59;6)59). T&0 9359)5E :*2:;35 256 >2<:*3;5:)<:;52( @;9*3D;2( A(3*2 3A 4)25;5> ?;><- 0<;25 U 0’<:- S- 05;@- M9; ， $VVJ ， !G W % X I JV! # JVF " Z-. 256 [- \);<<- ,)>’(2*. 535<?3*;5> >*2@ U ?3<;:;B) （)6- ） 1)*>)^ _ < C25’2( 3A P):)*@;52:;B) 129E *36<- ]5I M5)2:=. /- K- 0:)*;3(3>^WT3(- $X- \;((;2@<256 \;(8;5<. 12(:;@3*)， !FH‘， ! $VH # ! $%J ‘ /)6)*<)5. Y-. 256 a- \- b255398- L3(35;c2:;35 3A :=) ?3*9;5) >2<E !FHF ， ""I :*3;5:)<:;52( :*29: D^ (29:3D29;((;- 0??(- 75B;*35- C;9*3D;3( ， Y256()*. !V !! F H C;9*3D;E G
《饲料工业 》 ・!""# 年第 !$ 卷第 %" 期
试 验 研 究
仔猪专用益生乳酸杆菌菌种的分离
黄沧海 谯仕彦 李德发 陈东晓
摘 要 试验应用乳酸杆菌完全选择性培养基从仔猪胃肠道粘膜分离乳酸杆菌， 目的是从健 康断奶仔猪消化道分离到一定数量能够粘附到胃肠粘膜的乳酸杆菌。选择 && 头来自不同猪场的 断奶后健康仔猪， 麻醉后扑杀， 无菌取胃、 十二指肠、 空肠、 回肠、 盲肠和结肠等部位， 先用无菌生理 盐水冲洗胃肠粘膜至无可见食糜，再用 )*+*, 缓冲液洗脱粘附在胃肠粘膜上的细菌，应用常规 低 3) 值 -./.01 完全选择性培养基厌氧培养分 -./.01 ,2 完全选择性培养基分离肠道乳酸杆菌， 离胃乳酸杆菌， 经过革兰氏染色、 显微镜观察和接触酶试验， 从胃部分离的 & !4’ 株菌落中， 有 & !!" 株 是乳酸杆菌， 分离率达到 5%6 ； 从肠道分离的 % 5"7 株菌落中， 有 % 745 株是乳酸杆菌， 分离率达到 546 。 关键词 仔猪； 乳酸杆菌； 分离 中图分类号 ,4&89 8 ! 前言