烟草试验方案设计

“浓香型”烤烟品种的选育及应用研究
实验方案设计
每个品种一垄，一垄15株，5株/组，实验对母本和子本之间的差异性进行研究，实验设每品种三次重复。

1、腺毛形态及密度检测方案：
每个品种每组挑选3个植株，每个植株在相同位置用3 mm打孔器分别在每组植株主叶脉一侧的对称位置各剪取叶片组织3小块(每个部位平行取样)，放置在样品台上，用导电胶带从盖玻片的两侧固定后，置于Nikon扫描电子显微镜（QUANTA-200），显微镜放大倍数为200×下观察，统计每一视野中的腺毛数量、腺毛形态。

统计长柄，短柄，分泌型和非分泌性纤毛的数量。

并且分别计算出其对应的密度。

对两个亲本和一个子本的不同部位的腺毛密度进行横向对比和纵向对比。

纵向对比：分别对三个品种的叶尖，叶中和叶基部位进行品种内的统计讨论。

横向对比：取三个品种的相同部位（如叶尖，叶中和叶基部位）的腺毛密度进行横向比较。

发现杂交品种后代与亲本之间的腺毛密度变化。

2、烟叶腺毛分泌物的检测方法
提取方法：
1）用直径为1.6 cm的不锈钢打孔器对每个品种的3个植株电镜观察相对称的部分，分别取12个叶盘（4个孔/植株，12个孔/品种）。

，距离中脉2-3 cm。

将叶盘立即转移到20 mL闪烁瓶，并存储在冰上运输到实验室。

每份叶盘用7.5 mL HPLC色谱纯CH2Cl2涡旋震荡30 s 2次。

每个闪烁平加入约0.5 g无水
Na2SO4，并且将闪烁瓶放置一夜。

萃取液通过10 –20 μm的孔隙度的多孔玻璃漏斗过滤到25 mL螺旋盖试管，闪烁瓶用1 mL的CH2Cl2洗涤2次。

将1 mL含有50 μg/mL的十七烷和十七烷醇溶于甲苯的内标物添加。

随后，溶剂通过皮尔斯氮吹仪加热模块和Reacti-vap III manifold在40 ℃下蒸发。

添加100 μL的BSTFA:DMF=1:1的混合物，实验试管头部用N2紧紧的包裹住，并且样品在75 ℃下加热30 min，冷却后，加入100 μL的BSA: pyridine=1:1的溶剂溶解碳氢化合物。

样品储存在-20 ℃的环境下直到检测。

检测前，将样品恢复至室温并且蜗旋。

烟叶腺毛分泌物化学成分分析
进行GC 或GC/MS 以及Wiley 谱库图谱检索进行定性，和定量分析。

GC/MS (Trace DSQII 美国finnigan) 分析条件如下：
色谱柱：DB-5 30.0 m ×0.32mm × 0.25 μm
进样口温度：240 ℃；检测器温度：375℃
升温程序：从160 ℃起，以4 ℃/min 升至310 ℃，停10 min
进样量： 1.0 μL；载气是He，线性气体速度约为28cm/s。

（以上是初步方法，最终具体分析方法根据现有条件再次摸索最佳条件进行分析）
定性、定量分析方法：
1）分泌物所含成分分析：待分析主要成分如BMVSE、顺-冷杉醇及黑松三烯二醇（DVT）等成分是与购买标准品同等条件下进行GC/MS分析，（GC/MS条件将根据实际样品进行最佳条件摸索），然后在最佳条件下进行GC/MS分析，根据各成分的保留时间(RT)和分子量大小(MW)等指标进行比对，确定各成分的化学结构。

2）已知成分定量分析：即各已知成分的含量计算，由归一化法已知成分的峰面积根据公式计算。

3）其余未知成分分析：根据最佳条件下所得未知成分分子量与GC/MS数据库中分子量进行比较，核对分子量的对应百分比达到90%以上，方可确定其化学成分，然后确定其化学成分的结构和根据峰面积做含量分析（同上）。

（以上是初步方法，最终具体分析方法根据现有条件再次摸索最佳条件进行分析）
3、烟叶致香物质的检测
提取萃取方法：
“水蒸气蒸馏—二氯甲烷溶剂萃取”法。

在500mL圆底烧瓶中加入1.0 g烟样，1.0 g柠檬酸，500 μL内标(302 μg/ mL硝基苯)，再加入350 mL蒸馏水．安装同时蒸馏萃取装置，从冷凝管上方加入40 mL二氯甲烷于250 mL烧瓶中，待开始沸腾时进行同时蒸馏萃取，开始出现分层时开始计时, 2.5 h后，收集250 mL 烧瓶中的有机相，加入10 g左右无水硫酸钠摇匀至溶液澄清，转移有机相到鸡心瓶，水浴浓缩有机相l mL左右。

烟叶致香物质化学成分分析
内标物的配制：硝基苯作为内标物
样品分析：取烟叶致香物质提取浓缩物2 mL，加入1 mL 内标，再浓缩至1 mL，进行GC 或GC/MS 以及Wiley 图谱库检索进行定性，和定量分析。

定量的主要成分包括：烟碱、α-西柏三烯-4-醇、β-西柏三烯-4-醇、α-西柏三烯-4,6-二醇、β-西柏三烯-4,6-二醇以及其他成分。

GC/MS (Trace DSQII 美国finnigan) 分析条件如下：
色谱柱：TR-5MS 60.0 m × 320 μm × 0.25 μm
进样口温度：250 ℃；传输线温度：280℃；离子源温度：117℃
升温程序：从50 ℃（5min），120℃（5min），180℃（5min），250℃（15min）分流比：1:15
进样量：2.0 μL；载气是He。

（以上是初步方法，最终具体分析方法根据现有条件再次摸索最佳条件进行分析）
不同品种烟叶中致香成分的具体定性、定量分析方法：
1）进行比较不同品种烟叶中含量较多的糠醛、苯甲醇、苯乙醇、茄酮、BETA- 大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮、西柏三烯二醇、新植二烯、十六酸等致香成分与标准品对照进行保留时间和分子量的定性；
2）已知成分定量分析：即各已知成分的含量计算，由自成分的峰面积根据公式计算；
3）其余成分根据GC/MS数据库中分子量比较，核对分子量的对应百分比确定其各化学成分的结构和根据峰面积做含量分析。