球体形成实验联合药物筛选建立耐顺铂胰腺癌干细胞株
胰岛细胞药物筛选模型的建立_小鼠胰岛的原代培养_丘渭遥
文章编号： 1006－6233（ 2011） 12－1654－04
胰岛细胞药物筛选模型的建立—小鼠胰岛的原代培养
丘渭遥
（ 深圳大学医学院生化中心， 广东 深圳 518057）
摘 要： 目的： 用胰岛细胞作为糖尿病新药的细胞筛选模型需保持其结构完整、生理功能稳定和
足够长的存活时间，为此本文对小鼠胰岛分离纯化和培养方法进行优化。方法： 用胶原酶、透明质酸 酶和 DNA 酶消化，Ficoll 400 密度梯度离心法分离胰岛； DTZ 染色法和台盼兰染色测定胰岛的纯度和
参考文献： ［1］ 姜泗长，方耀云． 耳鼻咽喉科临床误诊误治及处理［M］．
昆明： 云南科技出版社，2000． 128－129． ［2］ 中华医学会耳鼻咽喉科学分会、中华耳鼻咽喉科杂志编
辑委员会． 慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期及内窥镜鼻 窦手术疗效评定标准［J］． 中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33 （ 3） ： 134． ［3］ 江满杰，李泽卿，王秋萍． 南京城区儿童慢性鼻窦炎流行 病学调查［J］． 医学研究生学报，2006，19（ 1） ： 613． ［4］ 陈和平，李春林，樊宏． 鼻内镜手术治疗慢性鼻窦炎鼻息 肉［J］． 中国耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，15 （ 4） ： 842 － 843． ［5］ 李轶． 38 例内窥镜鼻窦手术临床观察和分析［J］． 中国实 用医药，2008，3（ 20） ： 288－290． ［6］ 尹秋鸿，刘虹，李长国，等． 鼻内镜手术治疗鼻窦炎鼻息肉 87 例分析［J］． 中国内镜杂志，2006，12 （ 1） ： 456－458．
Ficoll 液 1mL，然后依次沿 管 壁 慢 慢 分 层 加 入 23% 、 20% 和 11% 的 Ficoll 液 各 1mL。4℃ 400rpm 离 心 4min，继之 2000rpm 离心 12min。收集位于第二层面 的胰岛加入 Hanks 液 600rpm，1min 离心清洗。之后加 入 RPMI1640 完全培养基（ 含 10% FBS） 37℃ 5% 二氧 化碳培养。培养 24h 后，成纤维细胞均已贴壁，再次收 集胰岛并反复洗涤离心，获得完整单离的纯净胰岛。 1． 4 胰岛的培养 1． 4． 1 培养基质的预处理方法： Poly －L －Lys 的处理 方法： Poly－L－Lys 均匀涂附培养板壁面，置于 37℃ ，0． 5h，用去离子水洗涤，晾干即可。明胶和 laminim 的处 理方法： 将相应培养基质溶液均匀涂附培养板壁面，置 于 4℃ 过夜，用前再用少许培养基冲洗一次。胶原处 理方法： 用吸管吸少许胶原涂于灭菌培养瓶 /孔板内壁 培养面 上； 向 培 养 瓶 内 通 以 氨 气 后 封 上 瓶 盖，作 用 30min，待胶原凝固，然后用无菌生理盐水冲洗、凉干， 即可使用。 1． 4． 2 胰岛的培养： 用以上方法处理的培养板培养胰 岛。 1． 5 胰岛生物活性的测定 1． 5． 1 胰岛数目和活力的测定： DTZ 染色计算收获胰 岛数目。台盼兰染色计算细胞活力，参照 Freshneiy 方 法［6］。 1． 5． 2 培养上清中胰岛素含量的测定： 每天取培养孔 内全部上清用胰岛素放射免疫试剂盒检测胰岛素含 量，同时补充等量的新鲜培养基。以接种后培养第 1 天内的胰岛素分泌良为基准，胰岛素的分泌水平表达 为同一培养孔后来检测的胰岛素含量与第 1 天的胰岛 素分泌量相除所得到的比值。 2 结果与讨论 2． 1 不同酶体系对小鼠胰岛分离效果的影响： 采用不 同组分配比的酶液分别对小鼠胰腺组织进行消化，结 果如表 1。
Yap1_相关的化疗耐药机制研究进展
Yap1相关的化疗耐药机制研究进展刘添1，2，盖佳桢1，2，胡宇莹1，2，杨佩颖11 天津中医药大学第一附属医院肿瘤科国家中医针灸临床医学研究中心，天津300381；2 天津中医药大学研究生院摘要：随着化疗的推进，部分患者逐渐出现耐药现象，从而导致治疗中止或失败，因此逆转耐药已经成为肿瘤临床治疗中亟待解决的问题。
Yes相关蛋白1（Yap1）在肿瘤发生、发展中发挥关键作用，下调Yap1表达能提高耐药后肿瘤的药物敏感性，减少或延缓耐药事件发生。
Yap1主要通过增强肿瘤干细胞表型、促进上皮-间充质转化、抑制自噬、调节肿瘤微环境及基因表达来促进耐药的发生；通过Yap1抑制剂、自噬激活剂及其他相关因子调控剂联合应用能够在临床中延缓患者生存期，同时也可将Yap1作为预后、治疗监测指标辅助临床决策。
关键词：肿瘤；化疗耐药；Yes相关蛋白1doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.31.019中图分类号：R730.5 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）31-0075-04尽管免疫和靶向治疗的应用显著提高了晚期或转移性肿瘤患者的生存率，但在临床中仍然首选化疗作为一线治疗，来减少肿瘤负荷，延迟疾病进展［1］。
随着治疗推进，耐药性成为化疗的主要限制因素［2］。
虽然可采用多药联合及不同剂量强度的方式来对抗耐药，但药物剂量-效应非线性关系的变化、肿瘤的异质性以及复杂的肿瘤微环境均会驱动耐药［3-4］。
因此亟需探索逆转耐药的新途径及方法。
有研究发现，Yes相关蛋白1（Yap1）的表达与阿霉素耐药乳腺癌患者的预后存在关联，其高表达患者的存活率较低［5］。
Yap1蛋白由Yap基因调控编码，参与基因表达、肿瘤免疫、上皮-间充质转化（EMT）等多个耐药环节，在不同肿瘤化疗耐药过程中发挥作用。
Yap1既能够修复化疗后的DNA损伤，又能抑制DNA的合成，具有双向调节作用，同时不会影响人体正常细胞及蛋白的表达［6-13］。
干细胞成球原理
干细胞成球原理
干细胞成球的原理**基于肿瘤干细胞在特定条件下的自我更新和增殖能力。
肿瘤干细胞是一类具有自我更新能力和较强侵袭迁移能力的细胞，它们对肿瘤的存活、增殖、转移及复发起着重要作用。
在体外实验中，肿瘤干细胞的成球能力被用作衡量其干性的一个标准。
这种成球能力反映了单个细胞在无血清、非贴壁的培养条件下自我更新的能力，通常用细胞球形成效率（Sphere Formation Efficiency，SFE）来表示。
在无血清、非贴壁的培养条件下，分化的肿瘤细胞会死亡，而具有干性的肿瘤细胞则能够存活并增殖，形成漂浮的细胞球。
这种培养方法称为建立培养法，它是一种便捷有效的分离肿瘤干细胞的方法。
当这些细胞球体被接种到动物模型体内时，它们能够长出肿瘤，并且能够连续多次种植，这表明细胞球体内富集了具有自我更新能力的肿瘤干细胞。
综上所述，干细胞成球的原理主要是利用肿瘤干细胞在特定培养条件下能够形成细胞球的特性，这一特性反映了它们的自我更新和增殖能力，是研究肿瘤干细胞的重要手段。
《铂类药物临床应用与不良反应管理专家共识》
铂类药物临床应用与不良反应管理专家共识（广东省药学会2018年5月23日发布）铂类药物开发于20世纪60年代，属于细胞周期非特异性药物，主要通过进入肿瘤细胞后与DNA 形成Pt-DNA加合物，从而介导肿瘤细胞坏死或凋亡，进而产生抗癌效果。
铂类药物因其独特的抗癌机制和广泛的抗癌谱，成为目前临床上使用最广的化疗药物之一，作为基本药物被广泛用于肺癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、结直肠癌和头颈部肿瘤等常见恶性肿瘤的治疗。
为了促进药师进入临床团队，规范铂类药物在临床上的使用，广东省药学会组织省内医疗机构专家通过分析临床常用铂类药物的药学特点，制定了该类药物临床应用与不良反应管理专家共识。
一、铂类药物简介1、作用机制铂类抗癌药物属于细胞周期非特异性药物，进入机体内作用于细胞DNA，包括4个过程：①跨膜运转进入细胞；②在细胞内发生离解反应生成水合配离子；③向靶DNA迁移；④与DNA配位形成Pt-DNA加合物，使DNA的合成受阻。
以顺铂为例，当其进入肿瘤细胞后，由于胞浆中氯离子浓度低，顺铂首先发生水解，两个氯离子被氢氧根离子取代，此后氢氧根离子又被细胞内DNA分子链中腺嘌呤、鸟嘌呤上的含氮碱基取代，形成铂化DNA，且由于顺铂分子中两个氯离子相处邻位，故可与DNA链中相邻的碱基结合，结合后DNA的结构和构象改变不明显。
另有数据表明，DNA链中许多相邻的碱基间两个氮原子距离为340pm，而顺铂中两个氯原子间距离为330pm，两者恰好匹配，形成的铂化DNA寿命较长，且不易被细胞蛋白如高移动性蛋白识别并修复。
这类顺铂诱导性DNA加合物可表现为DNA链内交联、DNA链间交联和DNA-蛋白交联，其中形成数量最多者是相邻嘌呤和碱基之间的1,2-d(GPG)和d(APG)。
DNA链间也可形成cis-[pt(NH3)2-d(GPG)]交联。
这些交联可破坏肿瘤细胞DNA的复制，抑制细胞分裂，最终杀灭肿瘤细胞。
2、铂类药物的发展历程自1978年第一代铂类抗肿瘤药物顺铂在美国上市至今，铂类新药研究开发经历了近40年的发展历程。
胰腺癌干细胞作为胰腺癌治疗靶点的研究进展
㊃综述㊃d o i:10.3969/j.i s s n.1671-8348.2021.07.029网络首发h t t p s://k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/50.1097.R.20210204.1559.009.h t m l(2021-02-04)胰腺癌干细胞作为胰腺癌治疗靶点的研究进展*刘旭,董勤综述,王震侠,赵建国ә审校(内蒙古医科大学附属医院肝胆胰脾外科,呼和浩特010050)[摘要]胰腺导管腺癌(P D A C)是胰腺癌最常见的类型,其总体生存期为6~12个月,5年生存率低于7%,这主要是由于该肿瘤的早期局部侵袭和转移,以及肿瘤内存在的一种高度可塑性的肿瘤干细胞(C S C s)㊂C S C s是肿瘤内具有干细胞特性的一个小亚群,在P D A C中,占胰腺所有肿瘤细胞的不到1%,但其可使P D A C 产生化疗耐药㊁增强致瘤能力,并且还和肿瘤的发生㊁发展㊁转移有着密切的联系㊂越来越多的证据支持C S C s 作为P D A C诱导细胞的存在,并且正在努力开发针对这些细胞的治疗策略㊂该文总结了目前对胰腺癌干细胞(P C S C)的认识及近年来的研究进展,概述以P C S C为靶点治疗P D A C的研究现状㊂[关键词]肿瘤干细胞;胰腺导管腺癌;靶向治疗[中图法分类号] R657.5[文献标识码] A[文章编号]1671-8348(2021)07-1212-05 R e s e a r c h p r o g r e s s e s o f p a n c r e a t i c c a n c e r s t e m c e l l s a st h e r a p e u t i c t a r g e t s o f p a n c r e a t i c c a n c e r*L I U X u,D O N G Q i n,WA N G Z h e n x i a,Z HA O J i a n g u oә(A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f I n n e r M o n g o l i a M e d i c a l U n i v e r s i t y,H u h e h o t,I n n e r M o n g o l i a010050,C h i n a)[A b s t r a c t] P a n c r e a t i c d u c t a l a d e n o c a r c i n o m a(P D A C)i s t h e m o s t c o mm o n t y p e o f p a n c r e a t i c c a n c e r, w i t h a n o v e r a l l s u r v i v a l o f6-12m o n t h s a n d a5-y e a r s u r v i v a l r a t e o f l e s s t h a n7%,w h i c h i s m a i n l y d u e t o t h e e a r l y l o c a l i n v a s i o n a n d m e t a s t a s i s o f t h e t u m o r,a n d a k i n d o f h i g h l y p l a s t i c t u m o r s t e m c e l l s(C S C s)e x i s t i n g i n t h e t u m o r.C S C s a r e a s m a l l s u b s e t o f s t e m c e l l s w i t h t u m o r c h a r a c t e r i s t i c s.I n P D A C,t h e y a c c o u n t f o r l e s s t h a n1%o f a l l t u m o r c e l l s i n t h e p a n c r e a s,b u t t h e y c a n m a k e P D A C r e s i s t a n t t o c h e m o t h e r a p y,e n h a n c e t u-m o r i g e n i c i t y,a n d a l s o c l o s e l y r e l a t e d t o t h e o c c u r r e n c e,d e v e l o p m e n t a n d m e t a s t a s i s o f t u m o r s.M o r e a n d m o r e e v i d e n c e s u p p o r t s t h e e x i s t e n c e o f C S C s a s P D A C i n d u c e d c e l l s,a n d t h e e f f o r t s a r e b e i n g m a d e t o d e v e l o p t h e r a p e u t i c s t r a t e g i e s f o r t h e s e c e l l s.T h i s a r t i c l e s u mm a r i z e s t h e c u r r e n t u n d e r s t a n d i n g o f p a n c r e a t i c c a n c e r s t e m c e l l s(P C S C)a n d t h e r e s e a r c h p r o g r e s s i n r e c e n t y e a r s,a n d a l s o u mm a r i z e s t h e r e s e a r c h s t a t u s q u o o f P C S C a s a t a r g e t i n t h e t r e a t m e n t o f P D A C.[K e y w o r d s]t u m o r s t e m c e l l s;d u c t a l a d e n o c a r c i n o m a o f t h e p a n c r e a s;t a r g e t e d t h e r a p y胰腺导管腺癌(p a n c r e a t i c d u c t a l a d e n o c a r c i n o-m a,P D A C)是胰腺癌(p a n c r e a t i c c a n c e r,P C)最常见的类型,并且P D A C的发病率呈逐年上升趋势,预计到2030年,它将成为癌症相关死亡的第二大原因, P D A C预后非常差,5年生存率低于7%[1]㊂该病的低生存率主要是由于高侵袭性,固有的化疗耐药性,以及缺乏有效的靶向治疗途径㊂大多数P D A C患者确诊时已是晚期,只有不到20%的患者有条件行手术治疗[2],所以,大多数患者必须接受化学药物治疗,但常用的化疗药物延长P D A C患者的生存期的效果并不理想㊂近年来,随着人们对P D A C的认识不断加深,越来越多的证据表明,P D A C的耐药和转移主要受肿瘤干细胞(c a n c e r s t e m c e l l s,C S C s)的影响㊂C S C s不仅在肿瘤的发生㊁发展过程中起着重要作用,在肿瘤的抗药性和转移中也起着至关重要的作用,对P D A C患者而言,C S C s可能是有效的新的治疗靶点㊂本文就近年来国内外对胰腺癌干细胞(p a n c r e a t i c c a n c e r s t e m c e l l s,P C S C)的研究进展进行综述,并分2121重庆医学2021年4月第50卷第7期*基金项目:国家自然科学基金项目(81560384);内蒙古自治区科技计划项目(2019G G085);内蒙古自然科学基金项目(2019M S08025);内蒙古自治区草原英才创新人才团队项目(D C1900003486)㊂作者简介:刘旭(1995-),在读硕士,主要从事肝胆胰脾外科工作㊂ә通信作者, E-m a i l:d o c t o r1998z j g@163.c o m㊂析和讨论针对P C S C的治疗方案㊂1 C S C s干细胞是一种未分化的细胞,其主要特征是具有无限的增殖能力,使自我更新和分化为不同类型的细胞㊂无限的增殖潜能㊁自我更新和对凋亡的抵抗是癌细胞反映的干细胞特性㊂对于C S C s的来源有一种假设,即肿瘤内部存在一个层次结构,有一个独特的C S C s群维持着癌症进展[3]㊂自从人类第一次在体外分离出C S C s细胞后,C S C s几乎在所有实体肿瘤中被发现,包括P D A C[4]㊂目前C S C s的确切来源尚不清楚,但由于其功能与干细胞相似,许多学者认为其可能来自转化的干细胞或祖细胞,或通过存在于成人组织中的分化细胞的去分化而产生㊂在成人胰腺细胞中,即使是终末分化的细胞也表现出高度的可塑性㊂另外还有一种假说,认为癌细胞的可塑性在C S C s和非C S C s状态之间转换,是癌症维持和发展的原因,同时认为癌细胞的 干细胞性 可能是一种状态,而不是一个实体[5],即非C S C s可补充C S C s池,使P D A C患者体内的肿瘤细胞很难彻底清除,不能得到较好的治疗效果㊂C S C s的典型特征是他们的致瘤能力,虽然C S C s 在肿瘤内的细胞数量有限,但它们会促进肿瘤的生长,具有自我更新和产生异种癌细胞系的潜力㊂C S C s 不仅具有自我更新能力还有多分化能力,还具有缓慢的细胞周期动力学㊁通过药物外排转运体对化疗药物的有效处理㊁增加醛脱氢酶-1活性和改变线粒体的代谢等特点[6]㊂目前,在P D A C中,鉴定P C S C的方法主要有表面标记物检测,成球生长实验,侧群细胞检测㊂识别P C S C的最佳方法之一是在P C中使用流式细胞术检测C D44㊁C D24㊁E S A㊁C D133和c-m e t等细胞表面标记物㊂H E I D T等[4]在2007年首次使用流式细胞术分离出P C S C,认为C D44+C D24+E S A+是P C S C表面标记物,并认为其具有侵袭性和致瘤能力㊂为了更方便地在临床早期识别P C S C,可以通过血液标本进行检测,目前有一种方法可使用微流控平台对循环肿瘤细胞和C S C s进行分离,该平台依旧使用针对P C-S C表面标记物进行分离,可以可靠地分离C S C s,并评估肿瘤的进展,以及进行复发检测[7]㊂2 P C S C的表面标记物缺乏可靠的细胞表面标记物阻碍了P D A C患者的早期诊断,并且越来越多的证据表明,细胞表面标记物与P C的耐药㊁转移相关㊂最常见的鉴别方式是使用流式细胞术分离他们,包括C D24㊁C D44㊁C D133㊁c-m e t㊁乙醛脱氢酶1(a c e t a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e1, A L D H1)等㊂H E I D T等[4]的研究提示C D24+C D44+ E S A+干细胞亚群与自我更新能力及信号通路上调有关,同时他们还增加了肿瘤的生长潜力和侵袭性㊂尽管目前认为C D133+细胞比C D44+和C D24+细胞具有更多的致瘤和转移潜能,但更多的观点认为C D133表达对P D A C患者总生存期无明显影响㊂c-m e t是一种参与肿瘤生长和转移的新标记物㊂笔者发现,A L-D H1在正常和恶性的干细胞中活性明显增加,其可作为不良预后的一个预测指标㊂其他的P C S C表面标记物还有微管调节器D C L K1㊁o c t4㊁E p C AM等㊂但到目前为止并未有P C的100%特异性标记物,加上C S C s的异质性,使得早期检测P C S C变得异常困难㊂然而,P C S C中并不是某一特性标记物单独存在,往往都是几种标记物共表达㊂尤其是C D22㊁C D44㊁E S A三联体阳性在P C中的作用㊂最近的研究表明,其他C S C s标志物如D C L K1和C D133的表达可能与C D24㊁C D44㊁E p C AM阳性有关,这一观察结果表明P C中大多数C S C s标志物之间存在着较强的相关性[8]㊂此外,S K O D A等[9]发现,在生存期最短的患者肿瘤来源的细胞系中,C D24+C D44+E p C AM+ C D133+细胞比例最高㊂这些研究表明在P C中, C S C s表面标记物之间存在着广泛复杂的相关作用和关系,并且他们的相互作用可能会对P D A C的发展和治疗产生较大影响㊂3 P C S C的信号通路已有研究表明,多种信号通路参与P C S C的进展,对这些信号通路的进一步了解有助于设计和开发新的治疗靶点㊂3.1 W n t/β-c a t e n i n信号通路W n t/β-c a t e n i n信号通路参与许多组织和器官的体细胞和干细胞的维持,并通过调节细胞周期进程㊁凋亡㊁E MT㊁血管生成㊁干性㊁肿瘤免疫微环境等参与P C的发生,并且W n t失调已显示出引起P C的耐药性[10]㊂以W n t/β-c a t e n i n信号通路为靶点可以增强P D A C化疗药物的敏感性,并且有研究表明,天然化合物桦木酸苷可能通过抑制β-c a t e n i n蛋白的表达,从而影响肿瘤的生长[11]㊂3.2 H e d g e h o g(HH)信号通路HH信号通路在胚胎发育和成体组织的维持中起着至关重要的作用㊂它的失调与肿瘤的发生密切相关,在70%的P D A C中发现了它的过度表达[12],在P D A C中它能促进肿瘤的生长和转移[13]㊂有趣的是,健康胰腺中不存在HH配体的过度表达,但从胰腺腺管内上皮瘤到浸润性腺癌,这种表达显著增加[12]㊂最近的研究表明,天然化合物雷公藤内酯醇和绿磷脂二酮哌嗪-N T1721通过抑制HH信号抑制P C细胞增殖,和吉西他滨等化疗药物联合使用可增加P D A C患者药物敏感性,延长生存期[14-15]㊂3.3 N o t c h信号通路3121重庆医学2021年4月第50卷第7期N o t c h信号通路在多细胞的增殖㊁干细胞维持㊁细胞调控㊁分化和内环境稳定中发挥重要作用,并参与血管生成[16]㊂C U I等[17]的研究表明,长链非编码R N A-S N H G1通过激活P C的N o t c h-1信号通路促进P C细胞的生长和转移㊂N o t c h信号通路也有助于E MT的调节,利用s i R N A抑制N o t c h信号传导部分逆转E MT表型,这表明N o t c h通路参与P C S C的自我更新和E MT过程㊂3.4 P I3K/A K T/m T O R信号通路P I3K/A K T/m T O R信号通路是癌症的主要调节因子,在肿瘤的发生过程中,他在生长㊁增殖㊁运动㊁存活和血管生成中起着重要作用㊂最近的一项研究结果表明,m T O R抑制剂雷帕霉素联合顺铂可抑制P C 细胞P I3K㊁A K T㊁磷酸m T O R的表达,导致细胞凋亡率明显升高,从而增加化疗敏感性[18]㊂但一项使用吉西他滨和雷帕霉素联合治疗P C局部晚期和转移性晚期患者的Ⅰ/Ⅱ期临床试验显示,这种联合治疗的结果是可行的,不良反应可控,但没有显示出任何显著的临床疗效[19]㊂在P C S C的调控中,除了上面已经阐述的几种信号通路外,还有H I P P O㊁J A K-S T A T㊁MA P K-E R K㊁F O X M1㊁I L-8/C X C R1等信号通路也都参与了P C S C 活性的调节㊂天然化合物在阻断P C S C的上述信号通路上均显示出比较好的效果,并且已获得较多实验证实,但其具体临床效果及临床意义并不是很明确,需要更多的临床试验进行证明㊂4 P C S C参与的化学耐药性及针对P C S C为靶点的治疗目前P D A C的理想治疗标准是先行手术后辅助化疗,但由于缺乏早期检测和筛查方法,对化疗的耐药及转移,导致P D A C患者整体治疗效果比较差㊂其中化疗耐药是肿瘤治疗成功的主要障碍㊂许多药物不能消除P D A C,是肿瘤复发和转移的主要原因㊂C S C s的未分裂状态G0期可保护他们免受化学药物的细胞毒性,并代表治疗后期肿瘤复发的生物学基础[20]㊂C S C s介导的化疗药物的耐药机制还不清楚,很可能是由A T P结合盒(A B C)药物转运蛋白,解毒酶,D N A修复能力和抗凋亡蛋白过表达介导的耐药性㊂并且,C S C s在逃避免疫检测和免疫消除方面具有优势,有证据表明C S C s表达低水平的T细胞激活共刺激分子和高水平的T细胞抑制分子,包括P D-L1[21]㊂此外,即使C S C s与肿瘤转移的确切关系尚不清楚,但肿瘤仍具有转移能力,这可能是继发于C S C s 与癌细胞E MT之间的密切关系,这是由于存在共同的信号通路,如W n t/β-c a t e n i n和N o t c h信号通路㊂除了上述的细胞表面标记物和信号通路参与P C S C发生㊁发展,研究人员还发现,C S C s中的多个生物活性过程可以通过m i R N A s来调控,m i R N A s是一种内源性非编码R N A,它能通过影响多种细胞和分子途径和靶点发挥其调节作用,如血管生成㊁生长㊁分化㊁转移㊁稳态等[22]㊂m i R N A-21与吉西他滨耐药有关,还有其他与P C S C相关的m i R N A,如m i R-221㊁m i R-19㊁m i R-155等,被证明可促进肿瘤生长㊁转移和侵袭㊂因此,抑制这些m i R N A功能可以提高化疗效果㊂然而,m i R-30b的上调会抑制E MT过程,特别是在C D24+C D44+E p C AM+患者,可以对P D A C患者进行治疗[23]㊂这说明不同的m i R N A对P C S C分别起不同的作用,并且都将参与到P C S C的调节中,故对m i R N A的研究将有助于清除P C S C,提高P D A C 患者的生存期㊂上述信号通路中已讲到,某些天然化合物也可能有助于P C S C的根除,并通过多种信号通路途径治疗P D A C患者㊂姜黄素和表儿茶素没食子酸酯(E G C G)通过下调S T A T3信号抑制C D44+干细胞中被证明有效,而E G C G在人P C裸鼠体内的研究表明,E G C G 通过调节F O X O3转录因子和诱导细胞凋亡而抑制生长[24]㊂还有槲皮素和白藜芦醇,他们都通过抑制E MT过程来影响P C S C,HO C A等[25]的研究证实了这一点,并且还认为槲皮素对P C S C的E MT的阻止作用大于白藜芦醇,比白藜芦醇更能有效地抑制肿瘤转移㊂同时,一些非癌症相关药物对不同的人C S C s显示出抗癌作用,他们通过抑制一些重要的P C S C通路,对P D A C患者起到辅助治疗的作用㊂其中抗生素类药物最为繁多㊂盐霉素已被证实通过靶向C D133+途径可以有效地杀灭C S C s;G r a m i c i d i n是一种离子载体抗生素,通过调节巨噬细胞与肿瘤细胞的相互作用而发挥作用,并且发现它可以通过下调C D47,发挥对P C S C的抑制作用[26];还包括其他的抗生素,如阿奇霉素㊁替加环素㊁氯霉素等都相继被证实可对P C S C 有影响㊂二甲双胍通过抑制C S C s利用的线粒体氧化代谢途径和m T O R途径,减少P C S C的数量,靶向治疗P D A C患者;他汀类药物不仅能降低胆固醇,还能抑制癌细胞的生长㊁蛋白质合成和细胞周期进程,从而降低P C S C的生存能力;阿司匹林使C S C s对吉西他滨敏感,已被证明可以阻止P D A C进展,并有助于防止复发[27]㊂目前越来越多的非癌相关药物被发现可以靶向针对P C S C进行治疗,抑制P D A C的进展㊁耐药㊁复发和转移,但其对正常细胞的影响及具体临床疗效尚不明确,需要更多的临床试验去证明㊂为了提高化疗药物的生物利用度,纳米颗粒(n a n o p a r t i c l e s,N P s)被开发用于靶向C S C s,降低细胞毒性,提高治疗效果[28]㊂有研究表明,金纳米颗粒可以增强肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性,并且逆转4121重庆医学2021年4月第50卷第7期P C细胞的E MT过程,从而降低P C细胞的致瘤性,抑制P C S C生长,抑制肿瘤转移的潜在信号通路[29]㊂姜黄素纳米颗粒显示出比较大的生物利用度,在大鼠模型中,与传统姜黄素相比,吉西他滨的血液浓度-时间曲线下的面积增加了40倍以上,在人体试验中增加了27倍[30]㊂利用N P s靶向C S C s,进行治疗P D A C不断被重视,并且取得了越来越多的研究成果㊂虽然N P s可以辅助各种靶向药物治疗P D A C,但目前N P s仍存在载药量低㊁效率低的问题,已知的N P s负载双药模式可以暂时解决这一问题,但其仍存在双药选择和配比问题,所以需要进一步开发更加有效的以P C S C为靶点的药物递送的N P s去彻底解决这一问题㊂5小结目前,大多数针对P D A C的药物因为耐药而不能很好地清除肿瘤细胞,导致患者预后不良,急需寻找新的靶向药物㊂现在发现P C S C在P D A C发生㊁发展中的作用越来越大,它们是P D A C患者手术和化疗后复发的原因之一㊂C S C s通过有限数量的关键途径发挥作用,但这些细胞维持和操纵肿瘤环境的详细机制尚不清楚㊂笔者认为,以P C S C的表面标记物和关键信号通路为靶点进行治疗是延长P D A C患者术后生存期的关键,但以P C S C为靶点进行治疗的同时,药物对人体正常干细胞产生的影响不可忽视,因为P C-S C与正常干细胞有相似的特征,如果能找到特异性的靶向药物或找到完美的N P s去精准递送化疗药物,那么这将成为治疗P D A C患者的一个突破,但以上假设依赖于能够精准识别P C S C,这就需要更多的实验去探索P C S C完美的细胞表面标记物,以及更多的临床实验去证明相关靶向药物的有效性,以提高P D A C 患者早期诊断和总体治疗效果㊂参考文献[1]R A H I B L,S M I T H B D,A I Z E N B E R G R,e t a l.P r o j e c t i n g c a n c e r i n c i d e n c e a n d d e a t h s t o2030: t h e u n e x p e c t e d b u r d e n o f t h y r o i d,l i v e r,a n dp a n c r e a s c a n c e r s i n t h e U n i t e d S t a t e s[J].C a n c-e r R e s,2014,74(11):2913-2921.[2]R O D R I G U E Z A Z N A R E,W I E S MU L L E R L,S A I N Z B,e t a l.E MT a n d s t e m n e s s-k e y p l a y-e r s i n p a n c r e 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抗肿瘤药物多药耐药机制的研究进展
牡丹江医学院学报 J ournal of MuDanJiang Medical U niversity
Jun. 2021 Vol. 42 No. 3 2021
-pn型受体结合，并被TBR- I识别，形成TBR-n -TGF-p-TBR- I三聚体复合物，复合物中的TBRI被TBR- n磷酸化,促使TBR- I 和 TBR- n的激 活，使调节型Smad2/3磷酸化，磷酸化后的Smad2/3 与 Smad4 结合形成 Smads 复合体并转至胞核， 与多 种转录因子共同调节靶基因转录，从而影响肿瘤细 胞的成长和发展［15］。近年来,TGF-B信号在肿瘤 耐药中的作用受到重视。用阿霉素(50 mmol/L)来 处理HCT-116细胞,发现TGF-p信号上调以及PGP蛋白含量显著增加，相比之下，用siRNA干扰 Smad4,抑制TGF-p信号，发现HCT-116细胞对阿 霉素的敏感性明显增加［16］。在肝癌细胞中,TGF-p 可以调节细胞对紫杉醇耐药［17］。综上所述,可以推 测TGF-p信号可能会成为治疗的新靶点。 3.2 PI3K/AKT信号通路当细胞受各种因子刺激 后使PI3K激活，活化的PI3K在细胞膜上生成 PIP3,PIP3与AKT结合,从而使AKT磷酸化激活， 激活后的AKT转运至胞质或胞核内，进而发生一系 列的底物磷酸化，促进细胞的增殖及抗凋亡等。 mTOR是AKT的下游分子,有研究发现将mTOR抑 制剂RAD00/R与吉非替尼联合治疗吉非替尼耐药 的胃肠道间质瘤，发现能提高耐药患者的治疗效 果［18］。此外,泛素羧基末端水解酶1(UCH-L1)是 泛素羧基末端水酶家族的成员，能够参与泛素单体 循环，还能够调节靶蛋白的讲解和活性，研究表明 UCH-L1可能通过MAPKS信号和PI3K/AKt信号 通路调节P-gP的表达以及其泛素化降解,从而调 控细胞的耐药性［19］。 3.3 JAK/STAT信号通路JAK/STAT信号通路是 近年来研究的热点，它参与细胞的增殖、分化、凋亡 以及免疫调节等过程。 当细胞因子与受体结合后导 致受体发生二聚化，二聚化的受体激活JAKS，活化 的JAKS可以催化STAT上的酪氨酸残基磷酸化，同 时STATS的SH2功能区与受体中磷酸化的酪氨酸 残基作用使STATS活化,STATS进入核内，调节基 因的表达［20］。用siRNA干扰前列腺癌耐阿霉素细 胞株Du145/Adr中STAT-1的表达，发现可以提高 Du145/Adr对多烯紫杉醇的敏感性,这一过程可能 是通过JAK/STAT调节clusterin的表达，从而影响 肿瘤细胞对药物化疗敏感性［21］。Jagadeeshan［22］用 SNME来抑制卵巢癌细胞系NCI/ADR-RES中 JAK1和STAT3的表达，发现STAT3的失活可以抑 制MDR-1的表达从而影响药物在细胞的累积。综 上可以推测JAK/STAT信号通路会调控肿瘤细胞化 学耐药性。
球体形成实验联合药物筛选建立耐顺铂胰腺癌干细胞株
球体形成实验联合药物筛选建立耐顺铂胰腺癌干细胞株杨德君;傅红兵;卫子然;徐嘉鹏;朱振新;蔡清萍【摘要】目的探索建立顺铂耐药人胰腺癌干细胞株,并进行初步鉴定.方法通过球体形成实验联合顺铂药物筛选建立耐顺铂胰腺癌干细胞株;MTT法计算耐药指数;免疫荧光半定量检测OCT-4、SOX-2表达水平,检测干细胞标记物;免疫荧光半定量检测MUC-1表达水平,检测细胞分化能力;通过流式细胞仪测量侧群细胞和表面特异抗原标记(CD44+/CD24+)检测肿瘤干细胞含量.结果耐顺铂干细胞株的耐药指数是亲代株PANC-1的71.5倍;干细胞标记物的免疫荧光检测发现,耐药株中OCT-4、SOX-2、MUC-1均有不同程度的表达;耐药干细胞株及亲代株SP细胞比例分别为(25.1±1.1)％和(7.8士0.9)％,差异有统计学意义(t=6.89,P＜ 0.01);耐药株及亲代株中CD44+/CD24+表型的细胞亚群分别占(20.8±1.3)％和(2.4±0.8)％,差异有统计学意义(t=16.13,P＜ 0.01).结论球体形成实验联合顺铂药物筛选能建立耐顺铂胰腺癌细胞株,该细胞株能高效富集胰腺癌肿瘤干细胞.【期刊名称】《肝胆胰外科杂志》【年(卷),期】2014(026)001【总页数】5页(P38-42)【关键词】胰腺癌;肿瘤干细胞;球体形成实验;耐药;筛选【作者】杨德君;傅红兵;卫子然;徐嘉鹏;朱振新;蔡清萍【作者单位】第二军医大学附属长征医院胃肠外科,上海200003;第二军医大学附属长征医院胃肠外科,上海200003;第二军医大学附属长征医院胃肠外科,上海200003;第二军医大学附属长征医院胃肠外科,上海200003;第二军医大学附属长征医院胃肠外科,上海200003;第二军医大学附属长征医院胃肠外科,上海200003【正文语种】中文【中图分类】R392.12胰腺癌是所有肿瘤中致死率最高的疾病，患者5年存活率仅为3%～5%，平均存活时间仅为6个月[1]。
临床试验中的铂类抗肿瘤药探析
目前,铂类抗肿瘤药物的临床应用和科研开发均比较广泛与活跃。该类药物的毒副作用与交叉耐药等不良反应限制了其临床应用,所以研究和开发出具有广谱的高活性抗肿瘤药物,并对机体细胞无损害的全新铂类药物仍是当今科研的主题。与此同时,对于铂类药物的联合应用的研究以及扩大其在肿瘤治疗中的适用范围，提高治疗效果也显得更为重要。
[6]徐蔚,张纪.卡铂缓释剂的研究进展.昆明医学院学报,2016,22l 100.
[7]宋慧忠,张石革.回顾铂类化合物的发展历程及临床评价.中国医院用药评价与分析,20抗肿瘤药物的临床应用和科研开发均比较广泛与活跃，下面是小编为大家搜集的一篇相关论文范文，欢迎阅读参考。
1目前已经在临床应用的铂类药物
1.1顺铂[1]特点:①药物具有广谱及高效等特点,药物靶点为细胞核内DNA分子,杀伤肿瘤活性高,可以非特异性的抑制细胞周期。抗肿瘤活性可达60%以上,在应对一些对于其他化疗药物不敏感的肿瘤治疗中可以发挥比较好的作用。②不良反应主要表现在呕吐和肾功能损伤,因为其毒副作用与其他化疗药物不同,所以可以与其他化疗药物联合用药,并且可以逆转联合用药的副作用。③临床上可以利用该药物与多种化疗药物连用发挥作用，并且不会产生交叉耐药，有利于联合治疗的效果。④在与放疗同时作用时,其可以帮助放疗增敏。相关学者发现顺铂与环磷酰胺联合治疗会对P388、成骨肉瘤、L1210等肿瘤有协同作用,并且对卵巢癌患者的预后达到50%以上。
1.4奈达铂nedaplatin1995年在日本上市,对小鼠白血病P388,黑色素瘤B16均有很好的疗效。在对肺癌的治疗中,其效果估于顺铂,但会与顺铂产生耐药。用低剂量的奈达铂和5氟尿嘧啶与放疗一起治疗食管癌,部分有效率79%,完全有效率51%.
1.5依铂heptaplatin化学名称顺丙二酸双氨甲基异丙基二氧戊环合铂,1999年在韩国上市。其有良好溶解性和高稳定性。其通过与细胞内DNA交联来抑制基因的复制与转录,从而对细胞的有丝分裂进行抑制。临床实验显示,在一定程度上其可以对胃癌产生作用,在对抗胃肠道癌和子宫癌时可以与5氟尿嘧啶联用、肺癌的治疗效果与顺铂接近,副反应弱于卡铂。依铂为毒性小,杀伤肿瘤能力强,治疗指数高的一类对胃癌,肺癌有良效的铂类化疗药物。
3D细胞培养
3D多细胞肿瘤球的培养原创2017-04-20医生科研助手3D多细胞肿瘤球是在体外应用组织培养方法使肿瘤细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。
与传统的2D贴壁细胞培养模型相比，3D多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征。
因此，3D多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用于干细胞培养和分化、癌症研究、药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。
虽然3D多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性，但是与2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的3D多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段。
本文利用Liquid Overlay的制备方法，以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7为模型制备3D多细胞肿瘤球并采用倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜对其进行详细表征。
1实验前准备工作1.提前24 h取12 mL DMEM和RPMI 1640完全培养基（含10%FBS，下同）于50 mL离心管内，置于4℃冰箱中预冷；2. 将分装好的Matrigel基质胶提前24 h从-20℃放入4℃，使其融化成液体状态；3. 将无菌的1 mL移液器枪头放入无菌50 mL离心管内，置-20℃冰箱预冷。
2琼脂糖包被96孔板1. 准确量取6 mL RPMI 1640培养基（或DMEM培养基）于2个10 mL的注射玻璃瓶内，加入90 mg琼脂糖，盖塞后放入80℃的水浴锅内加热溶解30 min；2. 加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115℃灭菌30 min；3. 灭菌完成后，迅速取出注射瓶放入超净台内。
将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板内。
注意：由于琼脂糖溶液在室温时会凝固，因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至96孔板中。
此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，需要同时灭菌加样槽和100 μL的移液器枪头。
体内外循环筛选法构建新型的胰腺癌吉西他滨耐药模型
ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｓｕｂｓｋｉｎ ｏｆ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．Ａｆ ｔｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍａｓｓ，ｔｈｅ ｍａｓｓ ｗａｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｏ ｔａｉｌ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｓ ｏｆ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｂｉｎｅ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍ ａ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃ．Ｍ ｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＰＡＮ Ｃ一１ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ。
干细胞培养基成球培养法筛选结肠癌干细胞的生物学特性
３中 国人 民解放 军 第 ３２医院 ） ０
摘要 ： 目的
探讨 干细胞培养基 成球 培养法筛选结肠癌干细胞 的相关蛋 白表达 及生物学特性 。方法
用干ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ细
胞 培养基成 球培养法筛选结肠癌干细胞 ， ｓ ｒ ｌ 检测干细胞 相关 蛋 白的表 达 ， Ｗｅｔ ｎｂｏ ｅ ｔ 流式细胞仪检测细胞 周期 ； 同时
山东 医药 ２ １ ０２年第 ５ ２卷第 ２ ５期
干 细胞 培 养基 成球 培 养 法筛 选 结 肠 癌 干 细胞 的生 物 学 特性
杨 东 ， 张金龙 黄轶 轩 栾青 春 刘 ， ， 。 健 盂 希亭 王海 娟 钱 海利 李贵新 林 ， ， 。 ， ， 晨
（ １中国医学科 学 院肿 瘤 医院分子 肿 瘤学 国家重 点 实验 室 ， 京 １０ ２ ； 坊 医学 院； 北 ０ ０ １ ２潍
检测干细胞增殖、 黏附 、 耐药及侵袭能力 ， 并摸 索结肠癌 干细胞最佳冻存条件 。结果 附性 、 耐药性 、 侵袭性均强于亲本细胞。结论 肠癌干细胞的研究提供 了良好的细胞模 型。 关键词 ： 结肠癌干 细胞 ； 附性 ； 黏 耐药性 中图分类号 ： ７ ３ ３ Ｒ ３ ． 文献标 志码 ： Ａ 文章 编号 ：０２２６ ２ １ ）５０ １－４ １０ －６ Ｘ（０ ２ ２ － ２０ ０ 用 干细胞培养基 成球培养 法
Ｃ ｅ ｈｎ
（ ｔｔ Ｋ ｙＬ ｂｒｔｒ ｌ ｕ ｒＯ ｃｌ ｙ Ｃ ｎｅ ｓ ｔｔ Ｈ ｓｉ ｌ Ｃ ｉｅ ｃｄｍ １Ｓａｅ ｅ ａ ｏａｏｙｏ Ｍｏｅ ｌ ｎｏｏ ， ａ ｃｒ ｎｔｕ ｆ ｃａ ｇ Ｉ ｉ ｅ＆ ｏ ｔ ， ｈｎｓ Ａ ａ ｅ ｙ ｐａ ｅ
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干细胞球实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解干细胞球的制备方法。
2. 掌握干细胞球在体外培养过程中的观察指标。
3. 分析干细胞球在体外培养过程中的生长特性。
二、实验原理干细胞球是一种由未分化或低分化干细胞组成的细胞团，具有自我更新和多向分化的潜能。
在体外培养条件下，干细胞球可以保持其干细胞特性，并可通过调节培养条件诱导其分化为特定类型的细胞。
三、实验材料与试剂1. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、L-抗坏血酸、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、地塞米松、胰岛素、转铁蛋白、TGF-β1、表皮生长因子（EGF）等。
2. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器等。
3. 细胞：人胚胎干细胞（hESCs）或人诱导多能干细胞（hiPSCs）。
四、实验方法1. 干细胞球的制备（1）取hESCs或hiPSCs，用胰酶消化后接种于培养皿中，培养于DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素。
（2）待细胞贴壁后，加入bFGF、L-抗坏血酸、地塞米松、胰岛素、转铁蛋白、TGF-β1、EGF等诱导因子，形成干细胞球。
（3）将干细胞球转移至新的培养皿中，继续培养。
2. 干细胞球的观察（1）每天观察干细胞球的外观，记录其生长情况。
（2）使用倒置显微镜观察干细胞球的形态、大小、颜色等特征。
（3）通过流式细胞术检测干细胞球的表面标志物表达情况。
3. 干细胞球的诱导分化（1）根据实验需求，选择合适的诱导分化方案。
（2）将干细胞球转移至新的培养皿中，加入诱导分化试剂。
（3）观察干细胞球的分化情况，记录其形态、功能等特征。
五、实验结果1. 干细胞球的制备成功制备了干细胞球，外观呈球形，大小不一，细胞排列紧密。
2. 干细胞球的观察干细胞球在培养过程中逐渐增大，细胞数量增多，形态保持稳定。
3. 干细胞球的诱导分化通过诱导分化，干细胞球可分化为多种细胞类型，如神经细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等。
六、实验讨论1. 干细胞球的制备方法对干细胞球的生长和分化具有重要影响。
采用肝癌球体细胞筛选鉴定识别肝癌干细胞的单抗
肿瘤细胞成球实验原理
肿瘤细胞成球实验原理
肿瘤细胞成球实验是一种常用的体外细胞培养技术，用于模拟体内肿瘤的生长和发展过程。
该实验可以通过培养肿瘤细胞成三维球体，更真实地反映肿瘤的特性和生物学行为。
实验开始前，我们需要从患者体内获取肿瘤组织，并将其分离出单个的肿瘤细胞。
这些细胞通常具有一定的肿瘤干细胞特性，包括自我更新和多向分化的能力。
我们将肿瘤细胞悬浮在含有适当培养基和营养物质的培养皿中。
培养基中的成分和浓度需要根据具体的实验目的进行调整，以提供细胞生长所需的营养和环境。
然后，我们将培养皿放置在恒温培养箱中，维持适当的温度和湿度，以模拟人体内的生理条件。
在培养过程中，细胞会自发地聚集在一起，形成三维的球体结构，称为肿瘤球。
肿瘤球的形成是由肿瘤细胞间的相互作用和通讯所驱动的。
在这个过程中，细胞之间会发生细胞黏附、细胞间信号传导和基质重塑等重要的细胞生物学事件。
通过观察和研究肿瘤球的形态、大小和结构，我们可以了解肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性和抗药性等特性。
此外，肿瘤球还可以用于测试新药的疗效和评估抗肿瘤治疗策略的有效性。
肿瘤细胞成球实验的优势在于它更好地模拟了体内的肿瘤生长环境，相比于传统的二维细胞培养，更能保留肿瘤细胞的原始特性和生物学行为。
这使得肿瘤球实验成为研究肿瘤生物学和开发抗癌药物的重要工具。
肿瘤细胞成球实验通过培养肿瘤细胞形成三维球体结构，模拟体内肿瘤的生长和发展过程。
这种实验方法可以更真实地反映肿瘤的特性和生物学行为，为肿瘤研究和治疗提供重要的参考依据。
抗胰腺癌干细胞单克隆抗体的筛选和鉴定
抗胰腺癌干细胞单克隆抗体的筛选和鉴定孙立新;遇珑;解亦斌;莫文秀;刘辉琦;杨治华;冉宇靓;孙力超【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2014(022)007【摘要】目的:从抗胰腺癌干细胞单抗库中筛选、鉴定识别胰腺癌干细胞的功能性单抗,为胰腺癌干细胞靶向治疗提供候选抗体药物.方法:无血清悬浮培养及PKH26染色确定胰腺癌HPAC细胞系中肿瘤干细胞的存在.流式细胞术检测HPAC的干细胞标志物CD133在球体细胞中的阳性比例,检测20株杂交瘤单抗在HPAC亲本和球体细胞中的阳性表达.双色荧光标记流式细胞术检测CD133和单抗在HPAC亲本和球体细胞中的共表达比例;无血清悬浮培养法观察单抗15E9对HPAC成球细胞自我更新的影响.CCK-8法检测单抗15E9对HPAC细胞增殖和耐药的影响.结果:HPAC细胞能在无血清培养基中存活、增殖并形成细胞球,成球率为4.8％±0.6％.HPAC球体细胞中CD133+细胞的比例较亲本细胞提高至11.6倍.20株候选杂交瘤单抗中有3株单抗能识别HPAC球体细胞中CD133+细胞,其中单抗15E9共染比例为3.5％,并能显著抑制HPAC细胞的成球,抑制率达到30.4％.单抗15E9联合吉西他滨能显著抑制HPAC球体细胞的增殖,联合组和对照组IC50分别为30.8 nmol/L和58.1 nmol/L.结论:本研究成功筛选出1株杂交瘤单抗可以识别胰腺癌干细胞,并且可识别CD133+的胰腺癌干细胞;体外功能显示该抗体具有抑制HPAC干细胞的自我更新能力,抗体干预后显著降低HPAC耐药能力,可能是潜在的胰腺癌干细胞的靶向治疗抗体药物.【总页数】5页(P1492-1496)【作者】孙立新;遇珑;解亦斌;莫文秀;刘辉琦;杨治华;冉宇靓;孙力超【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室抗体工程药物与肿瘤标志物中关村开放实验室,北京100021;中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室抗体工程药物与肿瘤标志物中关村开放实验室,北京100021;中国医学科学院肿瘤医院腹部外科,北京100021;中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室抗体工程药物与肿瘤标志物中关村开放实验室,北京100021;中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室抗体工程药物与肿瘤标志物中关村开放实验室,北京100021;中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室抗体工程药物与肿瘤标志物中关村开放实验室,北京100021;中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室抗体工程药物与肿瘤标志物中关村开放实验室,北京100021;中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室抗体工程药物与肿瘤标志物中关村开放实验室,北京100021【正文语种】中文【中图分类】R73-36+2;R735.9【相关文献】1.抗人胰腺癌细胞单克隆抗体的研制及初步鉴定 [J], 王晓燕;沈飞;何杨;吴翼伟2.抗胃癌干细胞单克隆抗体的筛选鉴定及功能研究 [J], 遇珑;舒雄;刘军;孙力超;杨治华;冉宇靓3.抗肝癌干细胞单克隆抗体的鉴定及功能 [J], 遇珑;舒雄;何永燕;孙力超;杨治华;冉宇靓4.一组抗胰腺癌单克隆抗体的制备、鉴定及血清学诊断应用 [J], 袁玫5.抗人胰腺癌单克隆抗体的制备及其鉴定 [J], 李敏杰;何杨;沈飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
肿瘤多细胞球体制备
肿瘤多细胞球体制备肿瘤多细胞球体制备是一种常用的实验方法，用于研究肿瘤的生物学特性和治疗效果。
肿瘤多细胞球体是由肿瘤细胞自发形成的球状结构，具有更接近体内肿瘤的组织结构和生理功能，因此被广泛应用于肿瘤研究和药物筛选等领域。
肿瘤多细胞球体制备的方法有多种，下面将介绍其中常用的方法。
一、悬浮培养法悬浮培养法是最常用的制备肿瘤多细胞球体的方法之一。
首先，将肿瘤细胞进行消化和离心，得到单细胞悬浮液。
然后，将细胞悬浮液加入含有细胞培养基和适当浓度的凝胶基质的培养皿中，使细胞在三维环境中生长。
适当的凝胶基质可以提供细胞生长所需的支持和结构。
在培养的过程中，细胞会自发形成球状结构，即肿瘤多细胞球体。
二、低附着培养法低附着培养法是另一种常用的制备肿瘤多细胞球体的方法。
与悬浮培养法不同，低附着培养法在培养皿中加入一层低附着的涂层物质，如聚乙二醇、聚丙烯酸等。
这样可以使细胞在培养过程中不粘附于培养皿的表面，而形成球状结构。
低附着培养法的优势在于可以更好地模拟肿瘤细胞在体内的生长环境，提高肿瘤多细胞球体的质量和稳定性。
三、三维打印法近年来，随着三维打印技术的发展，三维打印法也逐渐应用于肿瘤多细胞球体的制备。
这种方法通过将肿瘤细胞和生物材料一起打印成三维结构，实现肿瘤多细胞球体的快速制备和定制化。
三维打印法可以精确控制肿瘤细胞的位置和密度，进一步提高肿瘤多细胞球体的可控性和可重复性。
肿瘤多细胞球体制备的应用肿瘤多细胞球体制备的方法不仅在肿瘤研究中得到了广泛应用，还在药物筛选和个体化治疗等领域发挥着重要作用。
肿瘤多细胞球体可以更好地模拟体内肿瘤的生长环境，具有更接近体内肿瘤的组织结构和生理功能。
因此，通过研究肿瘤多细胞球体的生物学特性，可以更好地理解肿瘤的发生机制和生长规律。
肿瘤多细胞球体制备的方法可以用于药物筛选。
传统的肿瘤细胞培养方法往往无法准确评估药物对肿瘤的抑制效果。
而肿瘤多细胞球体可以更好地模拟体内肿瘤对药物的反应，从而提高药物筛选的准确性和可靠性。
细胞生物学实验_南京大学中国大学mooc课后章节答案期末考试题库2023年
细胞生物学实验_南京大学中国大学mooc课后章节答案期末考试题库2023年1.抽取小鼠腹腔液的正确方法是（）。
参考答案:只打开腹部皮肤而不打开腹膜，用手从外侧推开腹部内脏后用注射器从腹腔空隙处吸取2.被实验小鼠咬伤后，需要注射狂犬疫苗或同时注射狂犬免疫球蛋白，有效注射时间不能超过（）。
参考答案:24小时3.酶解法制备植物原生质体时，复合酶液中含有纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶等。
参考答案:错误4.漂浮法纯化原生质体时，离心后原生质体应出现于两液交界处。
参考答案:正确5.用磁分选仪分离表面有特定抗原的细胞时，混合细胞悬液流过磁场中的分离柱时，先流出来的细胞就是目标细胞。
参考答案:错误6.用流式细胞仪分选细胞前细胞需要先进行荧光染色或用荧光抗体标记。
参考答案:正确7.原生质体漂浮液中用不同浓度的葡萄糖调节溶液的漂浮密度。
参考答案:错误8.动物细胞培养常用的条件为（）。
参考答案:37℃,5%CO29.细胞在下面哪种条件可以长期保存？参考答案:-196℃10.细胞冻存后的复苏在下面哪种温度条件下进行较好？参考答案:37℃11.视频“细胞生物学实验技术在人类疾病治疗中的应用实例”中，讲到镰刀型贫血病基因治疗涉及的细胞生物学技术包括下面哪些？参考答案:骨髓干细胞培养_基因转染与定点整合_基因检测与鉴定_红细胞形态观察与功能验证12.细胞培养物中有（）污染时，显微镜下不可见。
参考答案:支原体13.开发TNF抗体类药物的依据是，细胞表面存在引起细胞凋亡的TNF受体。
参考答案:错误14.细胞培养操作过程，将已提前消过毒的器皿从超净台外移入超净台前无需再用酒精棉球消毒表面。
参考答案:错误15.培养细胞过程中，细胞培养液颜色呈紫色时必须换液。
参考答案:错误16.在细胞增殖与活力研究的检测方法中，（）能适用于失去活性的样品进行检测。
参考答案:Ki-67标记法17.采用细胞计数板计数，滴加细胞悬液时如果计数室出现了气泡，那么此时细胞计数的结果与实际细胞密度相比（）。
干细胞成球实验
肿瘤干细胞培养：
一次成球：
1、将生长状态良好的细胞消化后离心，去掉含血清培养基，用PBS清洗2次；
2、用干细胞培养基重悬细胞，计数；
干细胞培养基：DMEM/F12+1XB27+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF
3、细胞铺板：选择超低吸附细胞培养六孔板，每孔N个细胞（500-5000个，根据细胞的成球能力），补加4毫升培养基；
4、10天左右（不同细胞培养时间不同）完成培养，观察成球状态。
二次成球：
1、收集一次成球得到的细胞球，离心去上清，胰酶消化；
2、加含血清的培养基终止消化，离心去掉含血清培养基，用PBS清洗2次；
3、用干细胞培养基重悬细胞，计数；
4、细胞铺板：铺板的细胞数量应与一次成球铺板的细胞数量相同；
5、10天左右（不同细胞培养时间不同）完成培养，观察成球状态。
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（ ２ ． ４土０ ． ８ ）％ ，差异有统 计学意 义 （ ｔ ＝ １ ６ ． １ ３ ，尸＜０ ． ０ １ ） 。结论
耐 顺 铂 胰 腺 癌 细 胞 株 ，该 细 胞 株 能 高 效 富 集胰 腺癌 肿 瘤干 细 胞 。
球体形成实验联合顺铂 药物 筛选 能建立
［ 关键词］ 胰腺癌 ；肿瘤干细胞 ；球体形成 实验 ； 耐 药 ；筛选 ［ 中图分类号］Ｒ ３ ９ ２ ． １ ２ ［ 文献标识码］Ａ ［ 文章编号］ ｌ ０ ０ ７ — １ ９ ５ ４ （ ２ ０ １ ４ ） 一 ０ ０ ３ ８ — ０ ５
Ｃｈｉ ｎａ
Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｃ ｉ ｓ ｐ ｌ ａ ｔ ｉ ｎ ・ － ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｐ ａ ｎ ｃ ｒ ｅ ａ ｔ ｉ ｃ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｐ ＡＮ Ｃ・ － １ ａ ｎ ｄ￣ ｄ ｅ ｎ ・ －
水平 ，检 测干 细胞标记物 ；免疫 荧光半定量检 测 Ｍ Ｕ Ｃ － １ 表达水平 ，检测 细胞 分化 能力；通过流式细胞仪 测 量侧 群细胞和 表面特异抗原标记 （ Ｃ Ｄ ４ ４ ／ Ｃ Ｄ ２ ４ ）检 测肿瘤干细胞含量 。结果 耐 顺铂干细胞株 的耐 药指数 是亲代株 Ｐ Ａ Ｎ Ｃ — ｌ 的７ １ ． ５ 倍；干 细胞标记物 的免疫 荧光检 测发现 ， 耐 药株 中Ｏ Ｃ Ｔ － ４ 、Ｓ Ｏ Ｘ － ２ 、Ｍ Ｕ Ｃ － １ 均有不 同
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杨德 君 ，傅 红兵 ，卫子 然 ，徐 嘉鹏 ，朱振 新 ，蔡 清萍
（ 第 二军医 大学附属 长征 医院 胃肠外科 ，上海 ２ ０ ０目的 探 索建立顺铂耐药人胰腺癌干 细胞株 ，并进行初 步鉴定。方法 通过球体形成实验联 合
顺铂 药物 筛选 建 立 耐 顺 铂 胰 腺 癌干 细 胞株 ；Ｍ Ｔ Ｔ法 计 算 耐 药指 数 ； 免疫 荧 光半 定量检 测 Ｏ Ｃ Ｔ － ４ 、Ｓ Ｏ Ｘ － ２表 达
Ｅｓ ｔ ａ ｂｌ ｉ ｓ ｈ ｍｅ ｎｔ ｏ ｆ ｃ ｉ ｓ ｐｌ ａ ｔ ｉ ｎ－ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎｔ ｐａ ｎｃ ｒ ｅ ａｔ ｉ ｃ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｔ ｈｒ ｏ ｕｇ ｈ ｓ ｐｈ ｅ ｒ ｅ － ｆ ｏ ｒ ｍ ａｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｓ －
球体形成实验联合药物筛选建立耐顺铂胰腺癌干细胞株杨德君傅红兵卫子然第二军医大学附属长征医院徐嘉鹏朱振新蔡清萍胃肠外科上海200003摘要目的探索建立顺铂耐药人胰腺癌干细胞株并进行初步鉴定
第２ ６卷
肝 胆 胰 外 科 杂 志
第 １期
・
实验 研 究 ・
球体形成实验联合 药物 筛选建立耐顺铂 胰腺癌干细胞株
程度 的 表 达 ；耐 药干 细 胞株 及 亲 代株 Ｓ Ｐ细胞 比 例 分别 为 （ ２ ５ ． １士 １ ． １ ）％ 和 （ ７ ． ８土 ０ ． ９ ）％ ，差 异 有 统 计 学意 义 （ ｔ ＝ ６ ． ８ ９ ，Ｊ Ｄ ＜０ ． ０ １ ） ；耐 药株 及 亲 代 株 中 Ｃ Ｄ ４ ４ ／ Ｃ Ｄ ２ ４ 表 型 的细 胞 亚 群 分 别 占 （ ２ ０ ． ８土 １ ． ３ ）％ 和
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