细胞毒实验
医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验
医疗器械生物学评价第 5 局部：体外细胞毒性试验1范围GB/T 16886 的本局部阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。
这些方法规定了以下供试品以直接或通过集中的方式与培育细胞接触和进展孵育；a〕用器械的浸提液，和／或b〕与器械接触。
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反响。
2标准性引用文件以下文件中的条款通过GB/T 16886 的本局部的引用而成为本局部的条款。
但凡注日期的引用文件，其随后全部的修改单〔不包括订正的内容〕或均不适用于本局部，然而，鼓舞依据本局部达成协议的各方争论是否可使用这些文件的最版本。
但凡不注日期的引用文件，其最版本适用于本局部。
GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1 局部：评价与试验〔GB/T 16886.1-2023,idt ISO 10993- 1:1997〕CB/ T 16886. 12-2023 医疗器械生物学评价第12 局部：样品制备和参照材料〔idt ISO 10993-12 :1996〕3术语与定义GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1 中确立的以及以下术语和定义适用于本局部。
3.13.2 阴性比照材料negative control material依据本局部试验时不产生细胞毒性反响的材料。
注：阴性比照的目的是验证背景反响，例如高密度聚乙烯1〕牙科材料的阴性比照物。
阳性比照材料 pos itive control material依据本局部试验时可重现细胞毒性反响的材料。
已作为合成聚合物的阴性比照材料，氧化陶瓷棒则用作注：阳性比照的白目的是验证相应试验系统的反响，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯的阳性比照，酚的稀释液用于浸提液的阳性比照。
2）已用作固体材料和浸提液1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会〔Rockvillie, Maryland, USA〕和Hatano 争论所食品和药品安全中心〔Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan〕获得。
细胞毒性实验总结
细胞毒性实验总结一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识 (1)二、细胞毒性实验方案的确立 (3)三、细胞毒性实验方法稳定后的部分数据 (4)四、细胞毒性实验质量评价指标 (5)五、细胞毒性实验SOP (6)（一）目的 (6)（二）适用范围 (6)（三）责任人 (6)（四）规程 (6)1. 试验准备 (7)2. 试验操作 (8)3．数据处理和分析 (8)六、总结 (9)一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识细胞毒性是化学物质（药物）作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应。
按作用机制可分3种类型：①基本细胞毒性，涉及一种或多种上述结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞；②选择细胞毒性，存在于某些分化细胞上，主要通过化学物质的生物转化，与特殊受体结合或特殊的摄入机制所引发；③细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。
类似毒性作用可通过细胞因子、激素和递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或特殊的转运过程而实现。
毒性作用也可能来自化学物质对细胞外过程的干扰，任何一种非动物检测系统对多种因素都应加以考虑。
1983年Ekwall提出“基本细胞功能”的概念，即多数化学物质毒性作用是对细胞功能的非特异性损伤，却可引起器官功能的特异性改变甚至机体死亡。
有研究显示化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好的相关性。
化学物质产生的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变，由此推测体外细胞毒性可以预测体内急性毒性。
体外方法有助于预测化学物质急性暴露引发的全身和局部影响，并评估体内毒性浓度。
目前较为理想的抗HBV药物有拉米夫定（3TC）、恩替卡韦（ETV）等。
3TC是核苷左旋对呋体，早期用于艾滋病的治疗。
细胞毒性实验步骤-3
细胞毒性实验步骤一、样品准备准备规则尺寸样品，平行样≥3个。
所有样品采用75%酒精杀菌消毒how？，烘干后紫外照射how long？，灭菌处理。
二、浸提液制备样品灭菌后按照1.25cm2/mL（1cm2/mL、3cm2/mL）比例加入含10%小牛血清和100U/ml 双抗（青霉素和链霉素）的DMEM，置于37℃，5%CO2培养箱内培养24h（72h）得到浸提液，0.22μm微孔滤膜除菌后备用。
三、实验分组样品浸提液为实验组，阳性对照组为10%的DMSO（二甲基亚砜），阴性（空白）对照组为含10%小牛血清和100U/mL双抗的DMEM。
实验组共3（6）个点，分别为24h（72h）浸提液各培养1、3、5天。
四、L929细胞浓度选择及细胞计数选择生长状态良好的细胞用PBS冲洗三次，2.5g/L胰蛋白酶消化后离心，制备不同浓度的细胞悬液（1×103/mL、1×104/mL、2×104/ mL、3×104/ mL、1×105/ mL）。
细胞计数：将细胞悬液滴在细胞计数板上，盖上盖玻片（从一头压到另一头，防止气泡产生），在显微镜下计数，数计数板上四个角上四个区域所含细胞总数X，细胞浓度为X/4×104 /ml。
五、细胞形态观察和细胞毒性测定将配好浓度的细胞悬液加入3块96孔板，3块培养板分别编号1天、3天、5天，每孔100μL（根据实验组计算好加入量，每种金属浸提液对应8-16孔细胞悬液），37℃ , 5 % CO2条件下培养24h，待细胞贴壁生长后弃去原培养液，PBS冲洗3遍后分别加入实验组24h、（72h）浸提液、阳性对照组10%的DMSO、阴性对照组含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM,，每孔100μL继续培养。
1、3、5天各取一块培养板在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。
每孔加入10μL MTT后继续培养4h，小心抽出每孔内浸提液，每孔加入150 μL DMSO. 水平振荡器（脱色摇床）振荡培养板10min，570nm波长下用自动酶标检测仪上测定各孔OD值。
免疫学实验：NK细胞毒检测
·12·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数(cpm)， 即可计算出NK细胞毒活性。
·13·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
·14·
乳酸脱氢酶释放法
免疫学实验
靶细胞 NK YAC-1 杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH 释放到细胞外
无色底物
LDH底物 还 原
测OD570值
有色物质
实验值-自发释放值
杀伤率( %)= Max- S自发
×100
最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值
·2·
主要内容
❖实验分组及材料 ❖实验原理 ❖检测方法 ❖主要操作步骤 ❖结果判定
免疫学实验
·3·
实验分组及材料
免疫学实验
❖ 器材
1. 75%酒精
若干
2. 5ml注射器
1个/组
3. 100ml烧杯
1个/组
4. 无菌纱网
1块/组
5. 无菌平皿
1块/组
6. 无菌吸头（大、中、小）3盒/room
7. 无菌96孔培养板
❖同位素释放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR
❖乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用)
·11·
同位素释放法
免疫学实验
G0
G1
S
New DNA
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
细胞毒性试验流程
细胞毒性试验流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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T细胞介导的细胞毒试验名词解释
T细胞介导的细胞毒试验名词解释一、引言T细胞介导的细胞毒试验（T cell-mediated cytotoxicity assay）是一种常用的实验室技术，用于研究免疫系统的细胞毒性。
在这篇文章中，我们将对与这项试验相关的重要概念和技术进行解释和探讨。
二、T细胞介导的细胞毒试验的原理在免疫系统中，T细胞是一类关键的免疫细胞，具有细胞毒性，可以直接杀死某些感染细胞或异常细胞。
T细胞介导的细胞毒试验旨在评估T细胞的细胞毒性功能。
该试验通常通过将靶细胞与潜在杀伤细胞（如T细胞）共同培养，并测量细胞死亡的程度来评估细胞毒性。
三、培养条件和试剂需求在进行T细胞介导的细胞毒试验时，需要特定的培养条件和试剂。
培养基是细胞生长必需的营养物质和环境因子的混合物。
典型的培养基包括离心培养基和细胞因子。
离心培养基中包含氨基酸、糖、盐和维生素等成分，提供细胞生长所需的能量和营养。
细胞因子是一类调节细胞生长和功能的蛋白质，其中包括白细胞介素和干扰素等。
四、细胞标记和排序技术为了进行T细胞介导的细胞毒试验，通常需要标记细胞以便于后续的分析和排序。
细胞标记是利用染料、标记剂或荧光素等对细胞进行特异性标记的技术。
常用的细胞标记技术包括免疫荧光染色和共轭抗体标记。
这些技术可以帮助研究人员追踪和鉴定特定的细胞类型，以便于后续的流式细胞术或细胞分选。
五、测量细胞毒性的方法T细胞介导的细胞毒试验常用的方法之一是利用荧光素释放测定法。
这种方法基于细胞膜损伤的原理，通过测量目标细胞释放的荧光素或其他可测量的物质来评估细胞的死亡程度。
另外，还有一些其他的方法，如放射性同位素标记法和荧光光学方法，用于测量细胞的毒性。
六、应用领域和临床意义T细胞介导的细胞毒试验在免疫学和医学研究中具有广泛的应用。
它被用于评估免疫系统对肿瘤细胞的抗肿瘤反应，研究病毒感染等。
此外，该试验还可以用于评估新药的毒性和疗效，为药物研发提供重要的数据支持。
结论T细胞介导的细胞毒试验是一种重要的实验室技术，用于评估T细胞的细胞毒性功能。
医疗器械生物学评价体外细胞毒性试验
【分享】医疗器械生物学评价-体外细胞毒性试验什么是体外细胞毒性试验？体外细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境，检测医疗器械及生物材料接触机体组织后所发生的细胞溶解、抑制细胞生长和其他毒性作用的体外试验。
体外细胞毒性试验是医疗器械生物学评价体系中最重要的检测指标之一，几乎也是医疗器械及生物材料临床应用前的必选项目。
哪些产品需要进行体外细胞毒性试验？与人体接触或植入体内的医疗器械都需要进行细胞毒性试验。
与人体接触的部位包括：1）表面：皮肤，粘膜，损伤表面。
2）外部接入：组织/骨/牙，循环血液。
3）体内植入：组织/骨，血液。
体外细胞毒性试验的目的和意义目的：评级医疗器械和生物材料致细胞毒性反应的潜在性，并预测最终生物体应用时的组织细胞反应。
通过体外细胞培养技术，可检测供试品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、细胞溶解、死亡或其他毒性反应。
意义：可在短时间内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为动物试验的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械及生物材料的研制和应用提供了重要保证。
体外细胞毒性试验依据的相关标准o ISO 10993-5:2009 Biological Evaluation of MedicalDevices -- Part 5: Tests for in vitro Cytotoxicityo GB/T16886.5-2007医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验，GB/T16886是由ISO 10993转化过来的标准o GB/T 16175-2008 医用有机硅材料生物学评价试验方法o GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物试验方法o YY/T0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价第2单元试验方法细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法细胞系和培养基的选择优先采用已建立的细胞系并从认可的贮源获取。
试验只能使用无支原体污染细胞，使用前应该检测原代培养细胞是否存在支原体。
USP 87 细胞毒性 体外试验
87BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITROThe following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalian cell cultures following contact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or indirect patient contact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specimen cannot be determined, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to prevent contamination with microorganisms and other foreign matter.Three tests are described (i.e., the Agar Diffusion Test, the Direct Contact Test, and the Elution Test).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its intended use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; contacting media; inks; adhesives; absorption, adsorption, and permeability of preservatives; and conditions of storage. Evaluation of such factors should be made by appropriate additional specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its intended use. Materials that fail the in vitro tests are candidates for the in vivotests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88.USP R EFERENCE S TANDARDS 11— USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS.Cell Culture Preparation— Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells inserum-supplemented minimum essential medium having a seeding density of about 105 cells per mL. Incubate the cultures at 37 ± 1in a humidified incubator for NLT 24 h in a 5 ± 1% carbon dioxide atmosphere until a monolayer, with greater than 80% confluence, is obtained. Examine the prepared cultures under a microscope to ensure uniform, near-confluent monolayers. [NOTE—The reproducibility of the In Vitro Biological Reactivity Tests depends upon obtaining uniform cell culture density. ]Extraction Solvents—Sodium Chloride Injection (see monograph—use Sodium Chloride Injection containing 0.9% of NaCl). Alternatively, serum-free mammalian cell culture media or serum-supplemented mammalian cell culture media may be used. Serum supplementation is used when extraction is done at 37for 24 h.Apparatus—Autoclave— Employ an autoclave capable of maintaining a temperature of 121 ± 2, equipped with a thermometer, a pressure gauge, a vent cock, a rack adequate to accommodate the test containers above the water level, and a water cooling system that will allow for cooling of the test containers to about 20, but not below 20, immediately following the heating cycle.Oven— Use an oven, preferably a mechanical convection model, that will maintain operating temperatures in the range of 50–70within ± 2. Incubator— Use an incubator capable of maintaining a temperature of 37 ± 1 and a humidified atmosphere of 5 ± 1% carbon dioxide in air.Extraction Containers— Use only containers, such as ampuls or screw-cap culture test tubes, or their equivalent, of Type I glass. If used, culture test tubes, or their equivalent, are closed with a screw cap having a suitable elastomeric liner. The exposed surface of the elastomeric liner is completely protected withan inert solid disk 50–75 µm in thickness. A suitable disk can be fabricated from polytef.Preparation of Apparatus— Cleanse all glassware thoroughly with chromic acid cleansing mixture and, if necessary, with hot nitric acid followed by prolonged rinsing with Sterile Water for Injection. Sterilize and dry by a suitable process for containers and devices used for extraction, transfer, or administration of test material. If ethylene oxide is used as the sterilizing agent, allow NLT 48 h for complete degassing.Procedure—Preparation of Sample for Extracts— Prepare as directed in the Procedureunder Biological Reactivity Tests, In Vivo 88.Preparation of Extracts— Prepare as directed for Preparation of Extracts inBiological Reactivity Tests, In Vivo 88using either Sodium Chloride Injection (0.9% NaCl) or serum-free mammalian cell culture media as Extraction Solvents. [NOTE—If extraction is done at 37for 24 h in an incubator, use cell culture media supplemented by serum. The extraction conditions should not in any instance cause physical changes, such as fusion or melting of the material pieces, other than a slight adherence. ]Agar Diffusion TestThis test is designed for elastomeric closures in a variety of shapes. The agar layer acts as a cushion to protect the cells from mechanical damage while allowing the diffusion of leachable chemicals from the polymeric specimens. Extracts of materials that are to be tested are applied to a piece of filter paper. Sample Preparation— Use extracts prepared as directed, or use portions of the test specimens having flat surfaces NLT 100 mm2 in surface area. Positive Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Negative Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation.Procedure— Using 7 mL of cell suspension prepared as directed under Cell Culture Preparation, prepare the monolayers in plates having a 60-mm diameter. Following incubation, aspirate the culture medium from the monolayers, and replace it with serum-supplemented culture medium containing NMT 2% of agar. [NOTE—The quality of the agar must be adequate to support cell growth. The agar layer must be thin enough to permit diffusion of leached chemicals. ] Place the flat surfaces ofSample Preparation, Negative Control Preparation, and Positive Control Preparation or their extracts in an appropriate extracting medium, in duplicate cultures in contact with the solidified agar surface. Use no more than three specimens per prepared plate. Incubate all cultures for NLT 24 h at 37 ± 1, preferably in a humidified incubator containing 5 ± 1% of carbon dioxide. Examine each culture around each Sample, Negative Control, and Positive Control, under a microscope, using a suitable stain, if desired.Interpretation of Results— The biological reactivity (cellular degeneration and malformation) is described and rated on a scale of 0–4 (see Table 1). Measure the responses of the cell cultures to the Sample Preparation, the Negative Control Preparation, and the Positive Control Preparation. The cell culture test system is suitable if the observed responses to the Negative Control Preparation is grade 0 (no reactivity) and to the Positive Control Preparation is at least grade 3 (moderate). The Sample meets the requirements of the test if the response to the Sample Preparation is not greater than grade 2 (mildly reactive). Repeat the procedure if the suitability of the system is not confirmed. Table 1. Reactivity Grades for Agar Diffusion Test and Direct Contact TestGrade Reactivity Description of Reactivity Zone0 None No detectable zone around or under specimen1 Slight Some malformed or degenerated cells under specimen2 Mild Zone limited to area under specimen and less than 0.45 cm beyond specimen3 Moderate Zone extends 0.45 to 1.0 cm beyond specimen4 Severe Zone extends greater than 1.0 cm beyondGrade Reactivity Description of Reactivity ZonespecimenDirect Contact TestThis test is designed for materials in a variety of shapes. The procedure allows for simultaneous extraction and testing of leachable chemicals from the specimen with a serum-supplemented medium. The procedure is not appropriate for very low- or high-density materials that could cause mechanical damage to the cells.Sample Preparation— Use portions of the test specimen having flat surfaces NLT 100 mm2 in surface area.Positive Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Negative Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Procedure— Using 2 mL of cell suspension prepared as directed under Cell Culture Preparation, prepare the monolayers in plates having a 35-mm diameter. Following incubation, aspirate the culture medium from the cultures, and replace it with 0.8 mL of fresh culture medium. Place a single Sample Preparation, a Negative Control Preparation, and a Positive Control Preparation in each of duplicate cultures. Incubate all cultures for NLT 24 h at 37 ± 1in a humidified incubator containing 5 ± 1% of carbon dioxide. Examine each culture around each Sample, Negative Control, and Positive Control Preparation, under a microscope, using a suitable stain, if desired. Interpretation of Results— Proceed as directed for Interpretation of Results under Agar Diffusion Test. The Sample meets the requirements of the test if the response to the Sample Preparation is not greater than grade 2 (mildly reactive). Repeat the procedure if the suitability of the system is not confirmed.Elution TestThis test is designed for the evaluation of extracts of polymeric materials. The procedure allows for extraction of the specimens at physiological or。
医学免疫学实验：补体介导的细胞毒试验
补体介导的细胞毒试验一、实验目的学习并掌握补体介导的细胞毒试验的实验原理及实验步骤。
二、实验原理带有特异抗原的靶细胞（如正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞）与相应抗体结合后，在补体的参与下，引起靶细胞膜损伤，导致细胞膜的通透性增加、细胞死亡。
染料（例如：伊红-Y、台盼蓝）可通过细胞膜进入细胞内使细胞着色，故可用于指示死细胞或濒死细胞，而活细胞不着色。
此即补体依赖性细胞毒试验，利用细胞毒试验可以检查细胞膜抗原，亦可鉴定抗体的特异性。
本实验中，Thy-1 抗原是小鼠胸腺T 细胞特异的表面抗原，在体外利用抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体通过补体的协同作用，可杀伤95％以上的胸腺细胞。
三、实验材料1.解剖器械(眼科剪、眼科镊)、平皿、80～100 目不锈钢网2. 试管、lml 吸量管、尖吸管3. 载玻片、盖玻片4. C57BL／6J 小鼠5. 1640溶液6. 抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体（最适稀释度，本室制备）7. 补体(豚鼠新鲜血清并经小鼠胸腺细胞吸收，预先测定效价并稀释为最佳稀释度)8. 1％伊红-Y 染液四、实验步骤1. 小鼠胸腺细胞悬液的制备：将4～6 周龄小鼠采用颈椎脱臼法处死，取出胸腺放入已加入约4ml 冷1640溶液的平皿中，在100 目的不锈钢网上研磨后，过筛，放入试管，离心1000rpm，5 分钟，用1640溶液洗两次。
将沉淀的细胞重悬于1640溶液中，配成1×10^7／ml 细胞悬液。
2. 取试管3 支，标明顺序，依据下表依次加入1×107／ml 胸腺细胞悬液、抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体(最适稀释度)及1640溶液，放入37℃温箱30 分钟。
3.取出后每管加入1％伊红-Y 染液1 滴，混匀，室温放置2 分钟。
4.重新混匀后分别在一张载玻片上滴片，加盖玻片镜检。
先在低倍镜下观察，再用高倍镜观察，比较3 管中细胞死活情况。
五、实验结果死细胞呈红色，无光泽且肿胀变大；活细胞不着色、有光泽且形态正常。
药物毒性评价中的细胞毒性试验技术研究
药物毒性评价中的细胞毒性试验技术研究随着医药技术和药物研发的不断进步，药物毒性评价也变得越来越重要。
药物毒性评价是指确定药物是否会对人体产生不良作用的一项重要的评价工作。
其中细胞毒性试验技术是目前应用比较广泛的一种方法，本文将对其进行深入探讨。
Ⅰ. 细胞毒性试验技术简介细胞毒性试验技术是指以细胞为模型，通过赋予细胞某种物质刺激，观察细胞的形态、数量、代谢功能等方面的变化，以此来判断药物对细胞的毒性。
在药物毒性评价中，细胞毒性试验技术不仅可以对化学物质进行测试，并且也可以被用来检测各种药物，如抗癌药、抗生素、反病毒药和抗炎药等。
当前，人们较多采用细胞存活率作为细胞毒性的指标，常用的存活率检测方法有MTT法、CCK-8法、XTT法等。
这些方法的基本原理都是通过细胞内某些代谢酶的活性降低来获得细胞存活率信息。
细胞毒性试验技术具有快速、经济、可靠等特点，且能在药物研发早期进行并提供关键信息，使得其成为药物毒性评价中重要的手段之一。
Ⅱ. 细胞毒性试验技术的缺陷细胞毒性试验技术虽然在药物毒性评价中应用广泛，但也存在一定的缺陷。
首先，细胞毒性试验技术存在一些局限性。
细胞毒性试验技术在研究药物毒性时需要细胞样品，对于人体器官的毒性试验，只能通过小鼠或其他动物的细胞替代，在评价药物对人体的影响时，其数据参考价值受到一定的限制。
其次，细胞毒性试验技术也存在一定的误差。
细胞毒性试验技术评价结果可能会受到多种因素的影响，如细胞生长环境、样品浓度等，这些因素可能导致实验结果与药物的实际毒性存在差异。
最后，还需要注意细胞毒性试验技术中可能存在的静态度和单一性问题，即我们的测试条件很难完全模拟人体内分子的互动和动力学，如果我们只用细胞毒性试验技术来进行评价可能会给我们数据的精确度带来一定的误差。
Ⅲ. 细胞毒性试验技术的最新研究进展为了解决上述问题，近年来，学者们对细胞毒性试验技术进行了持续的研究和改进，如采用多维度生物信息分析技术，综合获取大小、形态、荧光、蛋白表达和单细胞遗传信息等来研究细胞毒性。
生物学评价之细胞毒性试验
生物学评价之细胞毒性试验1范围细胞毒性试验是利用细胞体外培养方法来评价医疗器械或其浸提液可滤出成分中急性细胞毒性的潜在性。
2 试验项目选择（推荐）根据GB/T16886.5-1997标准中有关细胞毒性试验的要求，现推荐下面任何一种细胞毒性试验方法评价医疗器械的细胞毒性，即琼脂覆盖法，分子滤过法，生长抑制法。
3 试验条件（1）细胞株可以使用已建立的细胞株，目前我国使用较多的是L-929（小鼠结缔组织成纤维细胞）和V-79（中国地鼠肺成纤维细胞）。
（2）培养基培养基及其血清浓度的含量应能适合所选择细胞株的生长，满足细胞生长的需要。
培养基内含抗生素的量应不引起细胞毒性，以免影响材料的评价，含血清和谷氨酰胺的培养基在2~8℃贮存不能超过一周，只含谷氨酰胺不含血清的培养基在2~8℃贮存不能超过一个月，培养基的pH值在7.2~7.4之间，所有培养用液都应是无菌的。
（3）样品的制备•试验样品的制备。
试验样品应选择材料本身或其浸提液进行。
试验材料应用最终产品。
制备材料浸提液的条件往往是夸大临床应用的条件来评价样品潜在的细胞毒性，但不能引起样品严重的变化（如溶解或其化学结构改变），浸提液应在制备后的24h内使用；固体材料应至少有一个平面使其利于在细胞层或琼脂层相接触，各种试验样品在试验时均应经无菌处理。
•阴性对照。
应是已知无细胞毒性的物质。
对于合成高分子材料，高密度聚乙烯较为适宜，牙科材料则可用氧化铝陶瓷作为阴性对照。
•阳性对照。
是已知的有一定细胞毒性的物质。
推荐含锡的聚氯乙烯作为固体材料或浸提液的阳性对照。
稀释苯酚亦可作为浸提液的阳性对照。
4 试验方法1)琼脂覆盖法•目的：本试验是为了评价医疗器械科浸提成分的急性细胞毒性。
•范围：本试验方法适用于固体（粉末，纤维状，金属），液体等试验材料。
•试验样品的制备。
试验样品：将试验样品制成100mm2的圆形，要求边缘光滑整齐。
液体材料用0.1mL的样品吸收在同面积的无菌滤纸片或纤维素上。
细胞毒性试验总结
（一）实验前应明确的问题1。
选择适当的细胞接种浓度.一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系.否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛.根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛.切记!否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间.3. 时间点的设定.在不同时间点的测定OD值,输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显).4。
培养时间.200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果，我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6。
理论未必都是对的。
要根据自己的实际情况调整.7.实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔.调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。
对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。
用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性.因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行.在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
(二）实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000—10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
细胞毒性检查法
附件细胞毒性检查法本法系将供试品或供试品液接触细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价供试品对体外细胞的毒性作用。
试验用细胞推荐使用小鼠成纤维细胞L-929。
试验时采用传代48～72h生长旺盛的细1 相对增殖度法阴性对照液制备为不加供试品的细胞培养液。
阳性对照液制备取生物毒性阳性参比物质，照供试品制备项下的规定进行，如6.3%苯酚的细胞培养液。
检查法取33个培养瓶，分别加入4×104个/ml浓度细胞悬液1ml，细胞培养液4ml，置(37±1)℃，（5±1）%CO2的条件下培养24h。
培养24h后弃去原培养液。
阴性对照组：取13个培养瓶加入5ml阴性对照液；阳性对照组取10个培养瓶加入5ml根据各组细胞浓度按下式计算细胞相对增殖度（RGR）：100⨯=均值阴性对照组细胞浓度平组）细胞浓度平均值供试品组（或阳性对照RGR 结果评价 试验组相对增殖度（以第7天的细胞浓度计算）为0级或1级判为合格。
试验组相对增殖度为2级，应结合形态综合评价，轻微毒或无毒的判为合格。
试验组相对增殖度为3级～5级判为不合格。
2 琼脂扩散法供试品制备 将样品用纯化水冲洗干净（根据实际情况需要），用滤纸吸干。
若用供试品液进行试验，将制备的供试品液附着到生物惰性吸收性的基质﹙例如超细硼硅玻璃纤维滤纸﹚上，制成面积不少于100mm 2的圆形供试品。
阴性对照制备 取无生物毒性阴性参比物质，例如高密度聚乙烯。
按照供试品制备项下的规定进行。
阳性对照制备 取生物毒性阳性参比物质，例如含二乙基二硫代氨基甲酸锌的聚氨酯（ZDEC ）。
按照供试品制备项下的规定进行。
可采用10%二甲基亚砜(DMSO)溶液，附着到生物惰性吸收性（例如超细硼硅玻璃纤维滤纸）的基质上。
检查法取细胞悬浮液（1×105个/ml ）7ml ，均匀分散至直径60mm 的培养皿中。
置于含（5±1）%CO 2气体的细胞培养箱中培养24h 至近汇合单层细胞，弃去培养皿中培养基，将溶化琼脂冷却至48℃左右与含20%血清的2倍新鲜哺乳动物细胞培养基混合，使琼脂最终质量浓度不大于2%，在每只培养皿内加入新制备的含琼脂培养基（要足够薄以利于可沥滤物的扩散）。
细胞毒实验
要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及 注意事项。
SI
50 40 30 20 10
0 100:1
Excel 作 图
NK杀伤实验
50:1 E：T
25:1
检测方法
1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法 alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体
酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织 厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组 间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤， 适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不 影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增 细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细 胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞 系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔 即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果
抗原与抗体结合
+ 补体
台盼蓝染液
抗体依赖性细胞介导细胞毒实验 （ADCC）：
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用是指表达IgGFc受体的 NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在病毒感 染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀 伤这些靶细胞的作用，是不同效应细胞群介导的杀伤性效应机 制之一。
细胞毒性试验方案
精品文档细胞毒性实验设计方案1.准备材料： DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素） DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45滤膜mμ灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头2.实验方案本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时2夹心二氧化硅中药物得以释放。
本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO-SS-HA/DOX）的细胞毒性。
实验组为SiO-SS-HA/DOX、SiO-SS-HA、DOX，222空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。
采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO-SS-HA/DOX、2SiO-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。
培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 2双抗(青霉素/链霉素)。
配制不同浓度的SiO-SS-HA/DOX、SiO、HA、DOX药物载22体培养基溶液。
(1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型:培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87%具体操作步骤：细胞的复活：①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。
②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。
（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。
）③将培养瓶放入培养箱中培养。
细胞的传代：将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。
①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。
②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口.精品文档用火烧。
微量淋巴细胞毒试验原理
微量淋巴细胞毒试验原理微量淋巴细胞毒试验（Microcytotoxicity Assay）是一种常用的体外细胞毒性试验方法，用于评估各种细胞毒性物质对淋巴细胞的毒性作用，以及测定血清中的细胞毒性抗体水平。
本文将详细介绍微量淋巴细胞毒试验的原理、步骤以及相关应用。
原理：微量淋巴细胞毒试验是通过观察淋巴细胞在体外与毒性物质作用后的死亡情况来评估其毒性作用。
该试验通常使用杀伤细胞（如大鼠淋巴瘤细胞线T-Lymphoma Cell line）和靶细胞（如人的白血病细胞）进行共培养，并加入待测物质，观察细胞死亡情况，从而判断待测物质对细胞的毒性作用。
步骤：1.准备试验样本：收集待测物质（如药物、化合物、血清等）和细胞悬液。
2.划定试验板：将细胞悬液和待测物质依次加入96孔板的对应孔中，以确保每个孔的浓度相同。
3.孵育混合物：将孔板孵育在合适的温度下，通常是37℃，并充分孵育一定的时间（如2小时）。
4.加入染色剂：在每个孔中加入染色剂，如溴化乙啶（Ethidium Bromide，EtBr），以染色活细胞和死细胞区分开。
5.观察和记录：使用荧光显微镜观察细胞的存活情况，根据染色剂的染色情况，可以判断待测物质的细胞毒性作用。
应用：1.评估药物的细胞毒性：微量淋巴细胞毒试验可用于评估药物对淋巴细胞的毒性作用，帮助药物研发人员选择合适的候选药物。
2.检测细胞毒性抗体：通过微量淋巴细胞毒试验，可以检测血清中的细胞毒性抗体水平，用于诊断和监测某些自身免疫性疾病，如溶血性贫血和自身免疫性甲状腺炎等。
3.评估环境毒性：微量淋巴细胞毒试验也可用于评估环境样品（如水源、土壤和空气）中的毒性物质，帮助判断环境污染的严重性和对人体健康的影响程度。
4.评估化妆品安全性：微量淋巴细胞毒试验可用于评估化妆品中添加的化学物质对细胞的毒性作用，以确保化妆品的安全性。
优势和限制：微量淋巴细胞毒试验具有以下优势：-简单易行：试验步骤简单，操作相对容易，不需要复杂的设备和技术。
环境毒理学研究中的细胞毒性试验技术应用
环境毒理学研究中的细胞毒性试验技术应用
近年来，全球环境问题日益严峻，各种化学物质在不断排放，对生态环境和人类健康产生了极大危害。为了评估化学物质对环境和健康的风险，环境毒理学研究不断深入，细胞毒性试验技术也显得愈加重要。
一、细胞毒性试验技术的意义
细胞毒性试验技术主要包括细胞存活率、细胞凋亡、基因毒性、细胞细胞周期等一系列技术，可用来评价化学物质对细胞的影响。在环境毒理学中，细胞毒性试验技术可用于评估化学物质对水生生物、野生动物和人类健康的风险。
二、细胞毒性试验技术的应用
在环境毒理学研究中，细胞毒性试验技术被广泛应用，特别是在新材料和化学品的开发和应用过程中。以下是一些细胞毒性试验技术的具体应用：
1.感光细胞毒性试验（PC assay）
感光细胞毒性试验可检测环境污染物是否对细胞膜的完整性或细胞膜外基质有影响。其原理是通过检测PC12细胞对荧光素酞的摄取量变化来分析化学物质的毒性。感光细胞毒性试验被广泛应用于排放水、废水等环境污染物的检测和监测。
首先，细胞毒性试验技术可以帮助评估化学物质对水生生物的影响。水生生物是生态环境的重要组成部分，如有毒化学物质排放到河流或湖泊中，将对生存于其中的水生动植物造成不可逆的伤害。通过对化学物质对水生生物的细胞毒性试验，可以评估出某种化学物质对水生生物的影响，从而制定相关的环保政策，保护水生生物的生存环境。
其次，细胞毒性试验技术还可以评估化学物质对野生动物的影响。野生动物是自然生态系统中不可或缺的生物群体，某些有毒化学物质排放到森林或草原中，会严重威胁野生动物的生存。通过对野生动物的细胞毒性试验，可以评估化学物质对野生动物的损害情况，从而控制化学物质的排放，维护自然生态系统的平衡。
细胞毒试验流程
细胞毒试验流程一、啥是细胞毒试验呢？细胞毒试验就像是一场细胞之间的“小战争”。
我们想看看某种物质对细胞有没有毒害作用呀。
这在医学研究、药物研发等好多领域都特别重要呢。
比如说我们要研究一种新的抗癌药物，那就得看看这个药对癌细胞有没有细胞毒作用，同时还得瞅瞅对正常细胞的影响大不大。
要是对癌细胞毒性很大，对正常细胞影响小，那这个药就很有潜力啦。
二、准备工作。
1. 细胞。
咱们得先有细胞呀。
就像打仗得有士兵一样。
这些细胞得好好养着，要在合适的培养条件下，像温度、湿度、二氧化碳浓度这些都得合适。
不同的细胞可能还需要不同的培养基，就像不同的人喜欢吃不同的食物一样。
比如说，有些细胞喜欢高糖的培养基，有些就喜欢低糖的。
2. 试验物质。
然后就是我们要测试的那个东西啦，不管是药物还是其他啥化学物质之类的。
这个也得好好准备，要保证它的纯度、浓度啥的都是准确的。
要是浓度弄错了，那这个试验结果可就全乱套了。
3. 其他设备和试剂。
像培养皿、移液枪这些就不用说了，那都是必备的“小工具”。
还有检测细胞活性的试剂，这就像给细胞做健康检查的“小医生”。
没有这些，我们就不知道细胞到底是被毒害得不行了，还是依然活力满满。
三、开始试验。
1. 细胞接种。
把细胞均匀地种到培养皿里，就像种小种子一样。
不过这个过程可得小心，不能让细胞聚堆儿了，不然它们会“互相挤着不舒服”，生长得就不好啦。
而且种的细胞数量也得合适，太多了会太拥挤，太少了又不容易检测到变化。
2. 加入试验物质。
等细胞在培养皿里“安了家”，就可以把我们要测试的东西加进去了。
这就像是给细胞的生活环境里加了个新东西，看看它们怎么应对。
这个时候得记录好加入的量和时间哦，就像写日记一样，这样以后才能清楚地知道试验过程是啥样的。
3. 培养观察。
加了试验物质之后，就把细胞放在培养箱里让它们待着啦。
不过这期间可不能完全不管哦。
得时不时去看看它们，就像照顾小宠物一样。
看看细胞的形态有没有变化，是不是有一些细胞开始变得奇怪了，或者是有很多细胞都死了。
细胞毒性试验培训班用讲义
细胞复苏步骤
1）准备一杯40度的温水。 2）将细胞从液氮罐中取出迅速放入温水中， 晃动使之溶解，注意过程控制在半分钟内。 3）离心，弃上清，加入新鲜培养基，接种 至新培养瓶中。
试验材料：仪器
超净工作台、CO2培养箱、冰箱、倒置光 学显微镜、光学显微镜、蒸汽灭菌器、液 氮瓶、抽滤瓶、电热恒温水浴锅、96孔培 养板、可调式微量加样器、酶标仪纯水机、 液氮罐、天平、离心机等。
有几类细胞毒性试验方法？
GB/T 16886.5－2003/ISO 109935:1999中推荐了三类细胞毒性试验： 1）浸提液试验 2）直接接触试验 3）间接接触试验（包括琼脂扩散试 验、滤膜扩散试验）
常用的细胞毒性试验方法
• 1）浸提液试验（四唑盐（MTT）比色蓝紫色的物质，用 二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液， 用酶标仪测定其浓度，从而定量测定细胞 的存活比例。该试验用于细胞毒性细定量 评价。对该试验有干扰的供试品不适于本 试验。 2）间接接触试验：琼脂扩散法或琼脂覆
试验步骤:MTT法
c) 弃去原培养液，每孔加入100µL的空白对照液， 阴性对照液，阳性对照液，100％ 和50％浓 度的试验样品浸提液。每组至少设8孔。 注：浸提原液或以培养基作稀释剂的系列浸 提稀释液。 采用0.9%氯化钠注射液浸提时, 建议在稀释浸 提液时使用浓缩的(如2倍或 5倍)培养基。 d) 置含5％二氧化碳的二氧化碳培养箱, 在 7℃±2℃温度下进行培养。培养间期可分 为24h、48h、 72h。
试验步骤:MTT法
h) 结果计算： i) 结果判断： 根据RGR值，判定试验样品的细胞毒性。 阴性对照组反应不大于1级。 1 阳性对照组反应至少为3级。 阴性对照组和阳性对照组反应不符合规定时应重 新试验。
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实验步骤
• 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣 碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩 余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。
LAK细胞并非是一个独立的淋巴群或亚群，而是NK细胞或T细 胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀 伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细 胞（lymphokine activated killer cells,LAK）。目前应用 LAK细胞过继免疫疗法（adoptive immunotherapy）与直接注 射IL-2等细胞因子联合治疗某些肿瘤，已获得一定的疗效。
(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一
吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。
乳酸脱氢酶释放法
靶细胞 NK
YAC-1
杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH 释放到细胞外
无色底物
LDH底物 还 原
测OD570值
有色物质
实验值-自发释放值
杀伤率( %)=
Max- S自发 ×100
• 细胞计数： 1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中， 混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取 20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 2. 调脾细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为1ml 3. 调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml
抗原与抗体结合
+ 补体
台盼蓝染液
抗体依赖性细胞介导细胞毒实验 （ADCC）：
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用是指表达IgGFc受体的 NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在病毒感 染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀 伤这些靶细胞的作用，是不同效应细胞群介导的杀伤性效应机 制之一。
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定
细胞毒T淋巴细胞 (CTL)活性测定是研究机体细胞免疫功 能的重要方法之一。传统的51 Cr释放法虽然有效 ,但也 存在某些不足。随着荧光标记、流式细胞分析和报告基 因等技术的广泛应用 ,促进了寻找灵敏可靠、简单易行 的非同位素法测定CTL活性的方法学研究。
淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测 定
同位素释放法
• 应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞， 当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏， 释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损 伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉 冲数 （cpm)，即可计算出NK细胞活性。
同位素释放法
NK细胞
利用测Cr的放射脉 冲得效应细胞活性
行测定。
• 因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的 CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析 和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素 测定法。
MTT（或MTS）还原法
本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细 胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进 入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后 比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可 计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便易行，无需预标靶细胞，与 51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。 MTT类似物MTS在细胞内还原的formazan产物具有水溶性，性质较稳定， 其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假 阳性结果。
细胞毒实验
分类 原理 检测方法 应用
分类
细胞毒检测技术主要根据原理 不同进行区分
补体依赖细胞毒实验
细胞介导细胞毒实验 抗体依赖性细胞介导细胞毒实验（ADCC) 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定 淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测定 肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定
补体依赖的细胞毒实验
系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。
NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗
原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。
YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细
胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。
100ul YAC-1 cells+ 50ul spleen Cells + 50ul 10%1640
100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells + 75ul 10%1640
100ul YAC-1 cells+ 100ul 1% NP-40
100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640
200ul 10% 1640
4-6
7-9
B,C,D
A
实验孔值-自然释放孔值
Max- S自发
×100%
10-12
加 法板
方
Max=E-F S自发=A-G
结果处理
算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐标 为E:T,纵坐标为SI值。
把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用 Excel作的图一起贴到实验记录本上。
• 注： S自发 ＜0，做“0”处理
A
自然释放孔
B
(E:T=100:1）
C
(E:T=50:1）
D
(E:T=25:1）
E
最大释放孔
F
最大释放对照孔
G
培养基对照孔
SI=
1-3
100ul YAC-1 cells+ 100ul 10% 1640
100ul YAC-1 cells+ 100ul spleen Cells
NK细胞分离方法
• 密度梯度离心
Ficoll 密度梯度离心 Percoll密度梯度离心
• 磁化细胞分离器分离法
同位素释放法
同位素释放法
G0
G1
S
New DNA
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值 最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。
• 细胞培养：
1. 按图所示加板。
2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%CO2培养箱中，培养2小时。 • LDH底物：
1. 在培养2小后，1000rpm，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入LDH底物 100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。
1.2.1 PE-mAb/FITC-annexin V 荧光标记法 正常细胞的磷酯酰丝氨（PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡时翻转露于 膜外侧，可与annexinV高亲合力结合。研究发现PS外翻为细胞凋亡的早 期事件，先于膜通透性增加所致51Cr或其他染料的释放。将效应细胞与 靶细胞充分共育后，用PE结合的效应细胞特异性单克隆抗体（如CD8PE）标记效应细胞（不能与PE-mABA结合的细胞即为靶细胞），再用 FITC-annexin V标记凋亡靶细胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同 的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞%。本法①简单快捷，无需 预标记，直接将上二试剂加入测定管即可；②与51Cr法相关性好 （r=0.989），在早期时段更为灵敏，还可在进行分析，尤其适用于动力 学分析；③可允许效应细胞与靶细胞长时间共育，对探讨E通过合成及 分泌某些细胞因子（如TNF）而杀伤靶细胞的机理性研究特别有利；④ 可用荧光显微镜观察测定。
要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及 注意事项。
SI
50 40 30 20 10
0 100:1
Excel 作 图
NK杀伤实验
50:1 E：T
25:1
检测方法
1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法 alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体
酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织 厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组 间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤， 适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不 影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增 细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细 胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞 系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔 即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果
2. 室温避光保存15min。
3. 取出，加入1mol/L柠檬酸， 30l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。
• 结果测定：
1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。
2. 结果判定：
实验孔值-自然释放孔值
SI=
Max- S自发
×100%
• Max （ 靶细胞最大释放）=最大释放孔均值-最大释放对照孔均值 • S自发 （靶细胞自发释放） =自发释放孔均值-培养基对照孔均值
调细胞浓度 7
1×10 /ml
30l /孔 1mol/L柠檬酸