实用指导(二)：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤
慢病毒使用操作指南
慢使用操作指南慢使用操作指南1.慢简介1.1 定义：慢是一种特殊的，能够在细胞中长期存活并进行复制。
1.2 用途：慢广泛应用于基因转导、基因敲除和基因表达等实验研究中。
2.慢使用前准备工作2.1 实验室准备工作2.1.1 实验室空间准备：确保实验室内有足够的操作空间和合适的消毒设备。
2.1.2 材料准备：准备好所需的培养基、细胞培养物、慢载体等。
2.1.3 设备准备：确保离心机、冰箱等设备正常工作，并准备好相关的仪器和器材。
2.2 人员准备工作2.2.1 人员培训：对参与慢操作的人员进行培训，了解操作步骤和安全风险。
2.2.2 个人防护：提供必要的防护装备，如实验服、手套、面罩等。
3.慢操作步骤3.1 细胞培养3.1.1 细胞培养物准备：根据实验需求选择合适的细胞培养物，并进行细胞的预处理和培养。
3.1.2 细胞密度调整：根据实验要求，调整细胞培养物的密度，以保证细胞的正常生长。
3.2 慢感染3.2.1 慢载体注射：将慢载体注射到培养好的细胞中。
3.2.2 感染条件控制：根据实验需求，控制慢感染的时间、浓度和温度等条件。
3.3 细胞培养和检测3.3.1 细胞培养：将感染好的细胞进行培养，并观察细胞的生长状态。
3.3.2 细胞检测：使用相关实验方法，对感染细胞进行检测和分析。
4.实验安全措施4.1 操作环境控制：确保实验室内通风良好，避免慢的扩散和污染。
4.2 废液处理：将产生的废液经过正确处理，避免对环境和人体造成污染和伤害。
4.3 事故应急处理：在发生事故或意外情况时，立即采取应急措施，并及时报告相关人员。
5.附件本文档所涉及的附件，包括但不限于实验记录表格、实验数据文件等。
6.法律名词及注释6.1 慢：指一种具有长周期和潜伏期的。
7.结束语感谢您阅读本文档，如有任何疑问或意见，请随时与我们联系。
慢病毒感染细胞 操作手册
实验步骤：
1．准备目的细胞
1.1 细胞复苏 1) 从液氮罐中取出细胞冻存管 2) 迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻 3) 完全解冻后，1000rpm，离心2min 4) 70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台 5) 吸去冻存液上清，加入1ml 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 ml 含 完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2 培养箱培养 6) 次日更换一次培养液后再继续培养 1.2 细胞传代 1) 将生长90%汇合的细胞进行传代 2) 弃去旧培养液，加入2 ml 灭菌的D-Hank’s 溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液 3) 加入1 ml 胰酶消化液，37℃消化约1-2 min，直到细胞完全消化下来 4) 加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来 5) 混匀细胞后分至两个新的6-cm dish 中，补足完全培养基至4ml，继续培养
慢病毒感染细胞 操作手册
实验流程描述
培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well 培养板培养，感染 当天按实验设计的组别加入慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3 天后荧光显微镜下 观察GFP 表达情况，荧光率达80％以上，待细胞长满培养板收集细胞检测。
实验材料：
试剂
试剂名称 胎牛血清 FBS DMSO DMEM 胰酶 Opti-MEM
2． 目的细胞慢病毒感染
1) 处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液 2) 将细胞悬液（细胞数约为5×104）接种于6-well 中，37℃ 5%CO2 培养箱培养待细胞融 合度达到约30% 3) 根据细胞MOI 值，加入适宜量的病毒 4) 12h 后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h 后更换培养基；如 果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基 5) 感染3 天后观察慢病毒上报告基因GFP 的表达情况，荧光率大于80%者，将细胞分成两 分，一份分于12孔培养板中待长满后收集细胞用于RNA提取，一份分于6孔板中待长满后收集 细胞用于蛋白提取；感染效率低于80%的实验组，重新进行感染实验 6) 以上的操作是针对贴壁细胞设计的。悬浮细胞的区别主要在细胞分盘上，它不需要提前 一天分盘。操作时将细胞离心后悬浮在不同的培养基中，计数分盘后，就可以加入病毒。 操作时污染了病毒的管子和枪头以及培养基和最后的细胞都CO2 培养箱 生物安全柜
慢病毒生产及使用操作技巧介绍材料
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一）293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共4 大格，每大格16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
慢病毒感染细胞实验原理及步骤
慢病毒感染细胞实验原理及步骤1. 实验原理慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。
2. 主要材料细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂3. 主要试剂配制（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）细胞生长培养液：临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。
4. 实验步骤（1）胰酶消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为0.5~1×105/ml（根据情况酌情调整），每孔200ul细胞悬液接种至24孔板，培养箱培养过夜。
次日进行慢病毒感染，此时细胞的融合度约为70%左右。
（2）准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬时离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。
根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量，将其稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
慢病毒感染细胞 操作手册
慢病毒感染细胞实验方法一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。
若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。
若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。
二、实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清Ausbian VS500TDMEM Corning 10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50G Puromycin Clontech 631305D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制2.主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯IX71CO2培养箱日本三洋SANYO MCO-175倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco 21生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio 1200-Ⅱ-A2三、实验步骤1．准备目的细胞（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。
（2）完全解冻后，1300 rpm，离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。
（3）吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。
（4）24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。
2．目的细胞慢病毒感染（1）贴壁细胞：a.处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右。
贴壁细胞慢病毒转染步骤及方法
贴壁细胞慢病毒转染步骤及方法
一、细胞培养Panc-1 细胞，常规培养使用含10% FBS (GIBCO) 的DMEM 培养基（含1.5 mg/L-Glutamine，100 U/mL penicillin，100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。
二、病毒侵染实验材料及试剂DMEM培养基+ 10% FBSPBS（Life Science Products&Services）Trypsin-EDTA Solution (Gibco)24孔板（Corning）Lentivirus-NC 病毒液（GenePharma，1×109 TU/mL）
三、步骤
1. 将状态良好的Panc-1 消化后重悬，取适量细胞接种至24 孔板中，37°C培养箱中过夜；
2. 取阴性对照病毒，按1:10、1:100、1:1000 与DMEM培养基混合稀释，总体积约500 μL，并加入终浓度5 μg/mL Polybrene；
3. 吸去24 孔板中原培养基，换入阴性对照病毒梯度稀释液，37°C培养箱中培养；
4. 24h 后吸去阴性对照病毒稀释液，换入500 μL新鲜培养基，37°C培养箱中培养；
5. 48-96h 于荧光倒置显微镜下观察并记录结果。
慢病毒感染目的细胞实验步骤
慢病毒感染目的细胞实验步骤1. 感染预实验以 24 孔培养板为例，同时进行目的细胞和工具细胞的感染预实验。
工具细胞可选择 293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其它细胞。
实验材料：培养基、24 孔培养板，移液枪，枪头， EP 管，细胞计数板、冰盒、废液缸等。
（根据目的细胞情况，可酌情使用 Polybrene）Day1：准备细胞：培养细胞至对数生长期，细胞以胰酶消化计数后，用细胞计数测出细胞密度，每孔接种5×104个细胞，添加细胞培养液至500µL。
通常情况下，该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。
（接种目的细胞时，请根据细胞的实际生长速度调整接种量，使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度）Day2：（1）准备慢病毒颗粒：计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；（2）感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度；如细胞状态较好，则开始实验：A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划 8 字的方式轻柔混匀；C. 混匀后，细胞培养板置于37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。
Day3：更换培养液：感染 12-16 小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。
（目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不可感染超过 12 小时。
）Day4：继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常。
Day5：观察（评估）慢病毒颗粒感染效率：盖紧 24 孔培养板，使用 70% 乙醇清理培养板外壁，在倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。
（如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长，荧光表达所需时间也较长，建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。
病毒感染细胞实验整体流程和原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1。
1慢病毒1。
1.1原理慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus—siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞（比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞）。
2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究.4）无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
1。
1。
3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体,包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3) 培养 48hrs — 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5）分装、— 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告.1.2、腺病毒1。
2.1 原理腺病毒(Adenovirus,Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂.有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力.这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
慢病毒转染操作
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
实用指导一：慢病毒感染MOI预实验
设置 MOI 梯度：可以按照不加病毒,10,20,30,50,80,100 来设置 MOI 梯度，或者 根据实际情况设置梯度都可。不加病毒组是用来判定细胞状态的。
注：最好设置一组复孔。如下图：
细胞接种：一般用 24 孔板接种 2×10 4 个细胞左右。如果细胞特别大可以适当 减少，特别小可以增加。原则上以第二天汇合度达到 30%-40%为宜。
放入培养箱继续培养。
第五天：观察，拍照，确定合适的 MOI 值
在荧光显微镜下观察，并拍照。
确定合适的 MOI 值。
理论上 MOI 值越高，慢病毒感染上的可能性越大，感染效率越高，但是这 样对细胞的毒性也就越大。所以预实验确认 MOI 值是要在细胞成活率和感染效 率中找到一个平衡点。
一般如果 MOI 超过 100，甚至 200 还感染不上，说明慢病毒非常难感染这 株细胞，甚至感染不上，那么就要考虑换一种方式，比如腺病毒或者电转（此种 情况下比较不推荐再试脂质体，一般也很难转进去）。
匀。
注：Polybrene 对部分细胞毒性很大(比如原代神经元，树突细胞等)，不要加。如果实在 不知道应不应该加，可以增加一组预实验，只加 Polybrene 不加病毒，跟都不加的组对比。
放入培养箱继续培养。
第三天：换液
提前 37℃预热培养基。
弃去含病毒的旧培养基，加入预热好的新鲜完全培养基。
实用指导（一）：慢病毒感染 MOI 预实验
MOI：Multiplicity of Infection，译为感染复数，即病毒量与细胞数的比值。 每种细胞对慢病毒的敏感性不同，有的容易感染，有的则比较难，同时每种
病毒感染细胞实验整体流程和原理
病毒感染细胞实验整体流程和原理病毒感染细胞实验整体流程及原理⽬的基因不能直接整合到⼤多数真核细胞，常⽤的⼿段是将⽬的基因包装成病毒来感染细胞，从⽽得到表达满⾜实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒慢病毒原理慢病毒(Lentivirus )是逆转录病毒的⼀种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相⽐，⼀⽅⾯可以扩增替代瞬时表达载体使⽤，另⼀⽅⾯，Len tivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可⽤于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于⾮分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进⾏长时间的稳定表达。
特点1)直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和⾮分裂细胞均有感染作⽤，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(⽐如神经元细胞、⼲细胞或其它原代细胞)。
可以通过简单⽅式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
2)3) 可⽤于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) ⽆需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
慢病毒包装简要流程:1) 含有⽬的基因的慢病毒RNAi⼲扰载体的构建和质粒纯化提取。
2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C保存。
6)滴度测定⽬的基因检定，并出具检测报告。
、腺病毒原理腺病毒(Ade no virus , Ad)是⼀种⽆包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个⾎清型，⼤多数Ad 载体都是基于⾎清型2和5, 通过转基因的⽅式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能⼒。
这些重组病毒仅在⾼⽔平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是⼀种适⽤于治疗的⾼效控制系统。
特点消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
慢病毒感染细胞具体方法及详细步骤
慢病毒感染细胞具体方法及详细步骤
材料和试剂
1. 6 cm细胞培养皿(Fiosher).
2. 人类或小鼠细胞系，细胞试验所需要的生长培养基。
3. 凝聚胺(海美溴铵; Sigma H 9268)
4. 合适的选择性抗生素。
仪器
1. 细胞培养箱
步骤
慢病毒感染方法应该根据不同的细胞系和以细胞为基础的试验来进行优化。
例如，下列的参数应该在大规模的感染之前进行优化，以确定一个实验的最适条件：
1) 细胞种植密度
2) 慢病毒的数量
3) 嘌呤霉素的浓度
4) 感染时间
2. 在6cm培养皿中种植适当密度的细胞，每孔体积6ml。
1) 贴壁细胞：转染前1天种植细胞
2) 悬浮细胞：转染当天种植细胞，培养基中需要含有凝聚胺。
3. 细胞中加入病毒:
1) (贴壁细胞):弃掉培养基，加入新鲜的含有凝聚胺的培养基。
或者，弃掉部分培养基并且补充含有凝聚胺的培养基。
调整体积和凝聚胺的浓度，使得凝聚胺的终浓度为8ug/ml。
4. 病毒感染:
1) 孵育细胞过夜。
2) 感染后24h更换培养基。
弃掉培养基，换入6ml新鲜的培养基。
如果需要抗生素选择，则使用含有抗生素的新鲜培养基。
注意：嘌呤霉素的浓度应该根据每种细胞系来进行优化；常用的浓度范围为：2-5 μg/mL.
5. 孵育细胞，根据需要每隔几天更换培养基(如果需要，则要含有抗生素) 。
孵育时间的长短主要依赖于感染后的试验。
贴壁细胞培养流程
贴壁细胞培养流程1.将自己的细胞取出来，观察密度。
（细胞密度大于等于80%就可以处理了）2.准备传代需要的实验器材及试剂（5ml、1ml枪头，PBS,培养基，废液缸）3.将培养瓶中培养液倒出（培养瓶举高一点，不要太靠近废液缸，以免污染）4.每次加3ml左右PBS洗细胞，洗两次（注意不要将细胞吹打下来。
用PBS洗的目的：传代细胞所用的培养基一般含有血清，而血清能影响胰酶的活性，使其失效，因此一般在加胰酶之前会用PBS洗一下，避免胰酶活性降低）5.加入1ml胰酶，前后摇匀，在显微镜下观察其形态（为什么用胰酶消化：细胞外含有多种胞外蛋白,如胶原蛋白。
这些蛋白使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来。
用胰蛋白酶分解这些蛋白质后它们就分开了。
胰酶消化过度：消化过度，一方面会对细胞本身造成伤害，另一方面，造成细胞流失，也就是吸取消化液时，由于消化过度，其中大量溶在消化液中的细胞被吸走，导致细胞数量减少）6.等到细胞变圆，没有连成一片且开始慢慢脱落下来的时候就可以终止消化了（如果想加速消化，就把细胞放回培养箱）7.终止消化：加入5ml左右培养基，并将细胞吹打下来。
吹打完后在显微镜下观察吹打情况。
（注意四个角落的细胞是否吹打下来）8.把细胞吸到离心管中，离心5分钟1000转。
9.离心完后取出离心管，离心管底部有一团白色的细胞。
10.倒出培养液，加入2ml左右培养基并吹散细胞。
11.取出一个培养瓶，加入7ml左右培养基。
12.吸取左右细胞加入培养瓶，混匀培养瓶中细胞并前后摇匀。
做好标记，放入培养箱。
（吸取前先混匀离心管中细胞。
）。
慢病毒感染细胞实验原理与实用流程（一）
慢病毒感染细胞实验原理与实用流程（一）首先， 包装病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒：慢病毒（Lentivirus ）是逆转录病毒的一种。
可用于感染依靠传统转染试剂瞬转，难于转染的细胞系，如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
腺病毒 (Adenovirus ，Ad) 是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
几乎可以感染所有类型的细胞，可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒。
它的病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL 。
腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单。
感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。
慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较病毒表达系统慢病毒表达系统 腺病毒表达系统病毒基因组RNA 病毒 双链DNA 病毒复制 自主复制 自主复制是否整合 病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因 病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因感染细胞类型 感染分裂和不分裂细胞，适用于难转染的原代细胞（如神经细胞）及体内实验感染分裂和不分裂细胞 表达丰度 中水平表达 高水平表达表达时间 慢（1-3天） 快（1-2天）滴度 滴度最高可达10*8pfU/ml 滴度最高可达10*11pfU/ml 克隆容量 插入不超过8kb 的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低 插入高达8kb 的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性 低免疫原性 高免疫原性质粒DNA 和包装质粒共转染293T 细胞病毒包装原理（图片来源网络）293T细胞, 由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于包装病毒以过表达各种目标蛋白。
脂质体，某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南一、慢病毒的储存与稀释：1.病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）注：A．病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。
B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
2.病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完)，分装后使用。
二、慢病毒用于体外（in vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI值）以及在体内（in vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）2.慢病毒感染目的细胞预实验①慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的（HEK293T，Hela）细胞作为平行实验的对照细胞。
B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清、双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C．Invabio提供的病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为>1X108TU/ml即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。
②以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。
实验室用慢病毒包装与感染细胞实验方案
实验室用慢病毒包装与感染细胞实验方案1.实验材料：细胞株：293细胞质粒：pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro（简称CDHv）pMDL-gag/pol RRE（简称RRE）pVSV-G（简称VSVG）pRSV-Rev（简称REV）转染试剂：聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI），贮存液浓度为1mg/ml。
Sigma公司产品，Cat No. 408727-100ML感染增强剂：polybrene(hexadimethrine bromide)，中文名称为：凝聚胺或海地美溴铵其它：一次性注射器、0.45um针头滤器等2. 实验程序：1. 首先将目的基因克隆至CDHv的多克隆位点区获得CDHv-Gene，而后制备包括CDHv、RRE、VSVG和REV在内的5种质粒；2. 培养293细胞至其生长情况良好，接种至10cm细胞培养皿中，细胞数目以12hr后或第二天转染时细胞覆盖率为70-80%为佳；3. 转染293细胞：分别在两个洁净的1.5ml离心管加入500ul无血清MEM（或DMEM、PBS、saline），其中一只管中混合包装病毒用四种质粒（CDHv或CDHv-Gene、RRE、VSVG和REV），各质粒用量依次比例为4ug:4ug:3ug:2ug(或为4ug:4.2ug:3.2ug:2.1ug)，轻轻吹打3-5次混匀；另一只管中加入PEI溶液，用量（ul数）与质粒量（ug数）大致保持1:1的关系，即第一只管中加入13ugDNA，此管中即加入13ul 浓度为1mg/ml 的PEI溶液，同样轻轻吹打混匀后，将第一管中的质粒溶液加入至第二管中的PEI溶液中，室温放置孵育15分钟后，直接加入铺有293细胞的培养皿中（此处293细胞转染前可不换液），轻轻晃动培养皿混匀后继续常规培养；4.（可选）大约8hr后，更换新鲜的完全培养基（温育为佳），继续常规培养；5. 培养48-72hr后，培养基变黄，部分293细胞浮起，收集上清至离心管中离心数分钟（目的是除去可能掺杂的293细胞，不至于下一步过滤时阻塞针头滤器），利用一次性注射器和洁净的0.45um针头滤器过滤上清至洁净的离心管中，此上清可直接冻存于-80℃备用，直接感染细胞最佳；6. 感染目的细胞：可直接将过滤后的病毒上清直接加入弃去原有培养基的铺有目的细胞的培养皿中（此时的目的细胞也应生长状态良好，覆盖率不宜过高，个人认为50-60%为宜，过高可能会因为细胞过度生长营养不足且感染效率低，或过低会形成大量病毒攻击少数细胞，两者都可能会引起大量细胞死亡），12hr 后丢弃病毒，更换新鲜培养基。
慢病毒实验操作步骤
慢病毒实验操作步骤一、Waymouth 培养液配置（含血清和不含血清的培养液均已配好）Waymouth MB 752/1 培养基1.4g、0.00253g 丙酮酸钠、0.3g 胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、加dddH2O定容至80ml，用7.6%NaHCO3滴定调至PH 7.0-7.2 。
加双抗：青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml，用补至100ml，无菌过滤后分装4ºC 保存备用，即为不含FBS的培养液。
将上述液体加入10ml 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，即10%FBS Waymouth培养液，4ºC 保存备用。
二、Polybrene稀释分装：（-20℃保存）感染添加剂，显著提高感染效率。
储存液浓度为10mg/ml，共20μl；使用浓度为5-10μg/ml。
用D-hanks、PBS或培养基进行稀释100倍（即100μg/ml，10×工作液）：20μl Polybrene储存液加入1980μl PBS稀释至总体积2ml ，分装10管，-20℃保存，每管200μl，100μg/ml。
使用时在每孔600μl培养液里约加入60μl分装的10×Polybrene工作液即可。
三、在无菌条件下，取3日龄KM小鼠卵巢组织。
四、1)取标本后在24 孔板中按以前的培养方法进行卵巢组织培养；2)36h后，将卵巢组织转移到600μl 无血清培养液的培养孔中；3）取1μl 23692（滴度为8×108TU/ml）的重组腺病毒浓缩液及60μl 10×Polybrene 工作液加入每个培养孔中混合，轻轻晃动混匀（阴性对照组加入1μl 阴性对照病毒）；盖上培养板盖子，用70%乙醇擦洗培养板外侧及超净工作台，放入孵育箱中37℃孵育。
（注意此过程不要有病毒液体溅出及沾染）沾染过病毒液体的枪头用保鲜膜包好，装入垃圾袋中，包埋处理?4）培养24h后，把培养板中的卵巢转至含血清的新鲜培养液的培养孔中继续培养，使总培养天数为8天。
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤及注意事项贴壁细胞培养步骤一、复苏1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml 培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。
二、传代1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个，继续培养。
10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。
三、冻存1.把原有培养基吸掉。
2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。
7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
配制溶液一、培养基配制（1）（DEME培养基）89%基础培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗（2）（1640培养基）89%基础1640培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗二、冻存液90%血清+10%DMSO；DMSO要慢慢滴加，边滴边摇三、消毒液75%的酒精注意事项（1）进入细胞间必须严格按照下列步骤操作①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
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实用指导（二）：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤
和元生物|2016-03-1513:51
慢病毒慢病毒（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体，基因组为RNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。
慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。
以24孔为例：
第一天：准备细胞将状态良好的目的细胞接种到24孔板中，细胞计数后，进行铺板，每孔加入500ul培养基。
保证第二天感染病毒时融合效率达到30-40%。
通常，24孔板内以
5-8*10^4cells/孔的密度铺板。
第二天：病毒感染，换液1计算病毒加药量
选择合适MOI值，进行病毒感染。
加药量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl）。
2弃去部分培养基
将每组中加入的病毒及感染增强剂的体积去掉，保证加入病毒和感染增强剂后，每孔中仍保持500ul的液体量。
3加入慢病毒加药量计算方法
（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl），培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
4添加感染增强剂polybrene,保证终浓度为5ug/ml
Polybrene是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。
Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10μg/ml）。
过长时间暴露于Polybrene（>12小时）可对某些细胞产生毒性作用。
5病毒感染8~12小时后，观察细胞状态。
如细胞状态差，尽快换新鲜培养基；如细胞状态良好，可以在24小时内换液，但不宜超过24小时。
弃去培养基后每孔加入500μl新鲜的完全培养基。
5%CO2培养箱培养。
第五天：观察荧光表达情况病毒感染细胞72h后，在荧光显微镜下观察细胞，估计慢病毒感染目的细胞的效率。
若荧光弱，可到96h后观察。
如果96h仍无荧光，即感染实验失败。