实用指导(二)：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤

实用指导（二）：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤

和元生物|2016-03-1513:51

慢病毒慢病毒（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体，基因组为RNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。

以24孔为例：

第一天：准备细胞将状态良好的目的细胞接种到24孔板中，细胞计数后，进行铺板，每孔加入500ul培养基。保证第二天感染病毒时融合效率达到30-40%。通常，24孔板内以

5-8*10^4cells/孔的密度铺板。

第二天：病毒感染，换液1计算病毒加药量

选择合适MOI值，进行病毒感染。

加药量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl）。

2弃去部分培养基

将每组中加入的病毒及感染增强剂的体积去掉，保证加入病毒和感染增强剂后，每孔中仍保持500ul的液体量。

3加入慢病毒加药量计算方法

（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl），培养基的总量必须充分覆盖住细胞。

4添加感染增强剂polybrene,保证终浓度为5ug/ml

Polybrene是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10μg/ml）。过长时间暴露于Polybrene（>12小时）可对某些细胞产生毒性作用。

5病毒感染8~12小时后，观察细胞状态。

如细胞状态差，尽快换新鲜培养基；如细胞状态良好，可以在24小时内换液，但不宜超过24小时。弃去培养基后每孔加入500μl新鲜的完全培养基。5%CO2培养箱培养。

第五天：观察荧光表达情况病毒感染细胞72h后，在荧光显微镜下观察细胞，估计慢病毒感染目的细胞的效率。若荧光弱，可到96h后观察。如果96h仍无荧光，即感染实验失败。