慢病毒包装实验步骤

慢病毒包装实验的要点：

1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；

2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；

3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；

实验前要准备的试剂、耗材和仪器；

试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。

耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。

第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；

实验前准备：

安全柜开紫外灯照30分钟；

把培养基和试剂放置常温；

消化细胞：

从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS

1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS 吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。

细胞铺板：

在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。

插入铺板后图片

刚铺板后

铺板1天后

第三天：上午

细胞转染：

细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右；

吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。

取出2个1.5ml的离心管，一份加入142ul的无血清培养基和58ulTRL转染试剂，吹打混匀。另一份加入包装质粒18ul、目的质粒10ul和无血清培养基总体积200ul充分混匀。

将2个离心管液体吹打混匀，室温静置20分钟

20分钟后，取出培养箱中的293FT细胞，将混合液用200ul的小枪头轻轻滴入培养皿中,避免细胞在转染过程中漂起来，然后轻轻十字混匀，放置于培养箱中培养8h。

细胞培养8h后，吸出原培养基，沿皿壁缓慢加入10ml完全培养基，放入培养箱中继续培养。

第四天

转染24h后取出293FT细胞，倒置荧光显微镜观察转染效果

第五天

转染48h后;

准备好1.5ml离心管，10ml无菌注射器和0.22umPVDF滤膜；收集48h后的病毒上清；第六天

转染72h后，收集72h后病毒上清。

慢病毒包装完成后如何用慢病毒感染目的细胞

步骤一:感染前一天用6孔板铺板，每孔铺5×10^5个293FT细胞，放置于培养箱中培养24h。

步骤二：准备3个离心管分别加入1ml、500ul、200ul的病毒液，再依次加入1ml的完全培养基和Polybrene吹打混匀（Polybrene终浓度为8ug/ml）。

步骤三：从培养箱中取出6孔板培养的293FT细胞，吸出原有培养基，再依次加入3个离心管中的混合液，混匀后放入培养箱中培养24h。

步骤四：24h后吸出含病毒的培养基，加入1ml完全培养基，培养箱中培养48h。

步骤五：48h后，带有绿色荧光蛋白标签的病毒，通过倒置荧光显微镜观察感染效率。步骤六：带Puromycin基因筛选标记的病毒，换上终浓度为1ug/ml的Puromycin的培养基,筛选稳定转导的细胞株(两至三天换一次液)。

72h观察

96h观察

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