慢病毒转染步骤

转染法步骤：

1分至适宜浓度的细胞到六孔板中，次日细胞应30%~50%融合

2.第二天，吸掉板中的生长培养基并加入新的含聚凝胺的培养基，加入适当数量的病毒于细胞中（见“决定慢病毒效价”部分），每孔溶液终体积为3ml

注意：考虑到细胞在自旋过程中不一定能完全被培养基覆盖，不推崇减少六孔板中的溶液终体积。调整孔中聚凝胺的终浓度为8mg/ml.通过涡旋六孔板轻轻地混合培养基，病毒以及聚凝胺。

3.为减少自旋-转染过程中悬浮物质的形成以及孔与孔之间液体接触的情况发生，用无菌微孔密封膜封闭六孔板（直接盖在板上），封闭好后，再在密封膜上加上一层未经灭菌的密封箔，最后盖上六孔板盖。

4.在标准的组织培养离心机中，37°C，2250rpm（1200g）条件下自旋-转染细胞60min.

5.一自旋-转染后就移走密封膜和密封箔，将孔中原有的培养基换为新鲜的生长培养基（每孔2ml就足够）

6.转染24h后，吸掉孔中的培养基并每孔加入新鲜的含有嘌呤霉素的2ml生长培养基。

注意：嘌呤霉素的浓度应被每个细胞株充分利用，一般规定在1-5μg/mL

7.进一步的培养时间主要取决于细胞株的类型以及转染后的实验分析。通常，嘌呤霉素筛选细胞需要大约48h。

下面推荐的是结合给定的细胞株和分析实验来得到的嘌呤霉素筛选

时间

>转染后实验分析嘌呤霉素筛选细胞时间> mRNA knockdown (qPCR) 2+ days

> Protein knockdown (Western) 3+ days

> Phenotypic assay 表型分析3+ days

8.检测目的感染细胞的表面分子