慢病毒转染PROTOCOL

第一天

病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。

加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。

注意：也可用其它型号培养板转导。这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。

第二天

准备完全培养基和Polybrene® (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 µg/ml。

移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。

注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 µg/ml）。过长时间暴露于Polybrene（> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。

在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。

培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。

轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。

注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。

注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。

注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。

第三天

移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。

孵育细胞过夜。

第四天

欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。

第五－六天及以后

用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。

Puromycin 筛选法：用足够剂量的Puromycin 杀死非转导的细胞。Puromycin 浓度范围为2 到10 µg/ml 是常用计量，但对于新的细胞株建议先做Puromycin 滴度。

每3－4 天更换含有新鲜Puromycin 的培养基，直到耐药克隆可以被确认。选择几个克隆，扩增并进行稳定shRNA 表达鉴定。

注意：因为慢病毒结构整合到细胞基因的数量不同，使Puromycin 耐药克隆可能出现不同水平shRNA 表达。

注意：用蛋白免疫印迹法（Western Blot）对shRNA 进行表达分析时，细胞裂解液准备方法如下：

用PBS 漂洗细胞一次。

细胞置于100 µl 的2x 电泳上样缓冲液（sc-24945）和PIPA 裂解液（sc-24948）的1:1 混合液并轻轻振动12 孔板或用加样器冲打以裂解细胞。

必要时冰上超声裂解。

注意：如果用RT-PCR 对shRNA 进行表达分析，请参考P. Chomczynski and N. Sacchi (1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159) 描述的RNA 分离方法或使用商品化RNA 分离试剂盒。

生物安全性

慢病毒颗粒可用于标准二级生物安全组织培养设施(并且需要按照同级别的其它传染性物质的要求进行处理）。慢病毒颗粒是没有自我复制功能的，并且设计为当shRNA转导并且整合到宿主DNA后，丧失其活性。