Ca法转染-制备慢病毒和感染细胞protocol(完整版)

2×HBS (ul)配方：8g NaCl ，0.14g Na2HPO4•2H2O 或0.2g Na2HPO4•7H2O ，6.5g HEPS ，调节pH 值7.0， 最终溶于500ml 双蒸水中,4℃保存。

2MCacl 2配方：87.6g Cacl 2·6H 2O 溶于200ml 双蒸水中，用0.22μm 滤器过滤除

菌，4℃保存，不可冻牢凝固。

^^^Day 1

1、在转染前24小时，在10cm dish 中（面积约为78.5cm 2）中铺3.6 x106 293T 细胞，于9ml DMEM （hyclone 高糖）+10%FBS+PS ，待次日细胞汇合度达到70%。

^^^Day 2

2、早上10：00转染，此时转染前无需换液。

浓度过高，混合均匀。

4、将混合好的复合物RT 5min ，加入到细胞培养液中。

5、晚上5：00换液，将培养液换成新鲜的6ml DMEM+10%FBS+PS 。

^^^Day 3

6、观察24h 荧光。

^^^Day 4

7、早上10：00观察48h 荧光，此时可以收集病毒，也可以到下午3：00-4：00再收集病毒(高压离心管和EP 管)。

Ooo 感染细胞

^^^Day 1

1、感染细胞前，消化目的细胞，此时培养液用1640+10FBS+PS\DMEM +10%FBS+PS ，铺种在6孔板中，1 x105 cell/well ，使感染前细胞汇合到20-30%，37℃，5%CO2孵箱过夜。

在蛋白质测序中也有一定作用。具有可高温高压灭菌特性。用双蒸水配制，－20℃储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果)

3、将细胞放入37℃，5%CO2孵箱，4-5h后换液2Ml 1640\DMEM +10%FBS+PS。过夜。

^^^Day 3

4、早上换2ml新鲜的1640\DMEM +10%FBS+PS。

^^^Day 4

5、晚上观察48h荧光率。（由于慢病毒表达过程比较慢，到48h才能观察到荧光）开始药筛。

6、药筛：用嘌呤霉素（puro）

Puro:储存浓度：10mg\ml(－20度保存)，使用浓度：2ug\ml。

7、药筛48h后观察48h荧光率，之后可以用2ug\ml维持培养一周后改用1ug\ml puro的培养基培养。