实验方案

实验方案

繁殖障碍类病毒病(PR、PP、PRRS)弱毒疫苗的研制

1. 病毒的克隆

1.1 细胞制备原种细胞系（MARC－145，IBRS－2）复苏、传代

1.1.1复苏

（a）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即置37℃水浴中不断摇晃，待融化后，将细胞倒入25mL的克氏瓶中，加入含10％BCS的MEM生长液，37℃培养，5－6h后换液以倾去死亡细胞, 37℃培养。待长成单层后，进行传代培养。

（b）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即投入37－38℃水浴中，待融化后（约1min），室温下在5min内用25℃左右的血清营养液稀释至原体积的4倍，500r/min离心10min，弃上清，加新鲜营养液悬浮细胞，并将细胞转入25mL的克氏瓶中补足营养液，37℃培养。

1.1.2传代

取长满单层后的细胞（约72h），倾去原来的营养液，用Hank’s液冲洗一次，加入0.25%的胰酶(或是0.5%的胰酶和0.04%EDTA的等量混合液)，其加入量以能在细胞上形成1mm 厚的液层为宜。置室温或37℃温度中消化，当细胞层开始由瓶壁脱离时（眼观可见细胞面呈毛玻璃样，镜下观察可见细胞圆缩，间隙增大，即将脱落），将消化液倾出，加入少量营养液，轻晃冲洗细胞层后倾弃，再加入相同于原营养液量的新营养液，以大口径吸管充分吹打，直到细胞完全分散，再加同量营养液，吹打数次后即可分瓶。（为便于吹打和分散细胞，开始时可以少加一些营养液，吹打分散后再逐步追加营养液至需量。）其分种率为1：2或1：3，37℃培养。

1.2 病毒培养种毒（PRRSV[欧美株]、PRV、PPV）复壮、病毒增殖

1.2.1种毒复壮（PRRSV[欧美株]、PRV）

(1) 取刚长成单层的Marc-145细胞，倾弃营养液后，加入不含血清的维持液[1％Gln，2％NaHCO3(7.5%),1%双抗的MEM]，洗2－3遍，倾弃清洗营养液；

(2) 接毒冻干毒种（原装量为2mL，湿毒1mL，保护剂1mL），以无血清MEM恢复为原装量，每瓶（100mL瓶）接毒1mL；

(3) 吸附37℃吸附1h，其中每20min轻轻晃一次，以使接种毒液能与细胞层更好地接触以利病毒吸附。吸附1h后，倒出接种病毒液，再加入含3％BCS的维持液，置37℃培养。

(4) 收获每日观察细胞的CPE。接毒后24h、36h、48h各观察一次CPE，或根据CPE 的形成情况，适当缩短观察间隔时间，待细胞形成80％的CPE时，冻融三次后－20℃冻存。

1.2.2 病毒增殖

(1) 取刚长成单层的Marc-145细胞，倾弃营养液后，加入不含血清的维持液，洗2－3

遍，倾弃清洗维持液；

(2) 接毒冻融湿毒1mL以无血清MEM做10-100倍稀释，每瓶（100mL瓶）接毒1mL；

(3) 吸附37℃吸附1h，其间每20min轻轻晃动一次，以使接种液能与细胞层更好地接触以利病毒吸附。

(4) 补充维持液吸附1h后，补足维持液或倒出接毒液再加入足量的维持液，37℃培养。

(5)．收获每日观察细胞的CPE。接毒后24h、36h、48h各观察一次CPE，或根据CPE 的形成情况，适当缩短观察间隔时间，待细胞形成80％的CPE时，冻融三次后－20℃冻存。

1.3. 增殖病毒TCID50测定（Reed-Muench法）

(1) 细胞板的制备

取长成单层的细胞，倾弃营养液，冲洗2－3次，加入0.25%的胰酶消化，制备细胞板（96孔板）。制板时每孔加100u L，37℃培养。

(2) 接毒吸出细胞板中的营养液，取待测湿毒1ml在试管中用无血清维持液做10×连续稀释，每稀释度接种8孔，每孔接种100ul，接种7－8个稀释度，同时另用8孔,每孔只加入100ul维持液做对照。37℃培养。

(3) 结果判定37℃培养48h后开始观察CPE，至120h。记录每一稀释度出现明显CPE 的孔数，根据Reed-Muench公式计算TCID50值。

1.4. 病毒克隆PRRSV、PRV采用蚀斑克隆、PPV采用终点稀释法克隆

1.4.1 PRRSV、PRV蚀斑克隆

(1) 在细胞培养扁瓶或平皿中使细胞长成密集的单层，不能有空隙（细胞接种浓度不能低于1×106/ml）。

(2) 吸去生长液，用MEM维持液将细胞单层洗一次。

(3) 病毒检样用MEM液（pH7.2-7.4）作连续10倍稀释。要能检出孤立可数的空斑，病毒浓度最好在100-500 TCID50/ml，稀释时要注意。每一稀释度接种4个培养瓶（3瓶用于覆盖MEM营养琼脂，1瓶只加维持液用于对照）。接种剂量随容器大小而异。25mL的培养瓶接种量约为0.3ml,以此类推。同时设立不接毒的空白对照（1瓶覆盖MEM营养琼脂，1瓶只加MEM维持液）。

(4) 将培养瓶放在37℃吸附60min，使病毒吸附于细胞，每15min将培养瓶轻轻转动，使接种液分布均匀。

(5)加入适量维持液，37℃培养约12-24h。

(6) 将培养瓶放在水平桌面上。按照3所设计的方案加入融化后冷却到42-44℃的不含中性红的MEM营养琼脂覆盖层，厚度约3mm，约10mL。

如果用培养瓶，只需将瓶塞塞紧即可；如果是平皿，应将其放在CO2培养箱中培养，以保持适宜的CO2浓度和湿度

(7) 琼脂凝固后将培养瓶瓶或平皿翻转，在37℃继续培养24-48h。

(8) 加入融化后冷却到42-44℃的含0.1g/L中性红的MEM营养琼脂覆盖层,约5mL。37℃继续培养，观察CPE并天后计数空斑数形成单位（PFU）。空斑应为淡白色，背景呈淡红色。

(9) 为了分离病毒克隆株，在培养瓶内出现清晰的蚀斑时，即可进行挑斑。最好选择蚀斑数较少，各斑间的距离不小于10mm小而孤立的空斑(或挑选大、中、小不同斑径及不同形态的蚀斑（主要根据斑径选择）。先在选定的蚀斑部位的瓶壁上做好标志，随后应用带有橡皮乳头的弯头吸管或巴斯德吸管连同琼脂一块吸出选定的蚀斑。如系平皿内的蚀斑，则可直接用吸管吸取。

将吸取的蚀斑琼脂糖放入含有0.5～l ml营养液的Eppendorf管内，反复冻融三次，使病毒充分释放，3 000r/min离心10min，取上清,用于接种敏感细胞，待其充分增殖以后，挑选斑径、形态稳定，产斑数高，细胞病变明显的蚀斑克隆进行下一轮的蚀斑纯化。如此操作2~3次后，滴定克隆病毒的毒价（TCID50）并进行鉴定。

1.4.2 PPV终点稀释法克隆或是采用对带毒细胞进行终点稀释法细胞克隆

方案A：PPV终点稀释法克隆

(1) 制备96孔细胞板。

(2) 接毒吸出细胞板中的营养液，取湿毒1ml在试管中用无血清维持液做10×连续稀释，每稀释度接种8孔，每孔接种100ul，接种7－8个稀释度，同时另用8孔,每孔只加入100ul维持液做对照。37℃培养。（或者是从开始接种，每个稀释度接种至少48孔）

(3) 37℃培养48h后开始观察CPE，至120h。记录每一稀释度出现明显CPE的孔数，根据Reed-Muench公式计算TCID50值。

(4) 以TCID50值的稀释度或更高的倍数稀释病毒并接种96孔细胞板。培养至出现适当病变时，刮下（或用胰酶消化）有病变孔内的细胞，连同本孔内的营养液一起冻融3次，20℃冻存。或经适当增殖后再次进行克隆。

方案B：带毒细胞进行终点稀释法细胞克隆

(1)营养液的条件化取新培养而即将长成单层的IBRS-2细胞，倾弃原来的营养液，加入新鲜营养液（含20％的犊牛血清），37℃培养1天后，吸出营养液，经微孔滤膜或以3 000 r/min的速度离心30min，除去可能混悬其中的细胞，取上清液装瓶备用，应用时要加入1％葡萄糖，并将pH调到7.0-7.2，保存备用。

(2) 倾弃处于旺盛生长期的单层细胞（分瓶后刚刚贴壁的细胞瓶）生长液，用不含血清的维持液清洗一遍后，加入接种量（按TCID50的倍数稀释接种）的病毒吸附1h后，倾弃接种液，加入生长液于37℃培养12~24 h后（视试验情况而定），胰酶消化，用前述条件化了的营养液作高倍稀释（10－1－10－7左右），然后从10－5开始分别接种96孔,微量细胞培养板，每个稀释度至少接种50孔，最好是一板（96孔），从培养48~72h后开始，逐日在倒置显微镜下观察，取最高稀释度有细胞增殖的孔，胰酶消化并适当扩增培养后，冻融3次后，再盲传，观察是否有细胞病变。收获有病变的培养再次进行克隆二次后进行的TCID50测定。

1.5.克隆毒的增殖培养