重组门冬酰胺酶II的表达及制备
重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法
重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法重组门冬酰胺酶ⅱ的表达纯化与分析【引言】左旋门冬酰胺酶(lasparaginase,lsp)就是淋巴系统恶性肿瘤化疗方案中的一个很主要的药物,应用领域日趋广为。
然而,lsp可以产生多种毒副作用,包含急性胰腺炎、药物性糖尿病、过敏反应、心肌功能障碍、肝功能侵害等,在一定程度上管制了lsp的临床应用领域,尤其对于曾发生上述不良反应的患儿的时程化疗还能够无法再用lsp,就沦为一个急需解决的问题。
目前国内所有化学治疗中应用领域的ecii主要就是倚赖进口,顺利完成抒发ecii的基因工程菌株构筑,并逐步展开ecii的工业化生产,对于国内all的临床化疗存有积极意义。
为此,我们克隆了ecii的基因,在大肠杆菌中赢得了高效率抒发,并深入探讨了其变异复性及时程提纯的方便快捷方法。
国内亦积极开展了相似的工作。
【目的要求】1．介绍基因工程菌蒸煮培育、排泄抒发酶蛋白及抒发酶蛋白提纯、分析鉴别的基本原理。
2．掌握以基因工程菌种e.coli/pans2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、sds-page电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。
【实验原理】用微生物，特别是大肠杆菌来生产l-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。
大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即l-门冬酰胺酶ⅰ和l-门冬酰胺酶ⅱ，分别由其染色体上基因ansa 和ansb编码。
只有l-门冬酰胺酶ⅱ才有抗肿瘤活性。
美、德、日均有l-门冬酰胺酶ⅱ商品出售。
我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。
国内目前用药全靠进口。
1995年，本院构建了高效分泌表达l-门冬酰胺酶ⅱ的基因工程菌，重组l-门冬酰胺酶ⅱ(rl-aspⅱ)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。
表达的rl-aspⅱ相对分子质量为138356da，pi为4.85，紫外最大吸收值在278nm处。
本实验以此工程菌为材料使用蔗糖溶液扩散振扰抽取法和酶数学分析单胺抽取周质中的rl-aspⅱ，再用硫酸铵分级结晶、deae-52阴离子纤维素互换层析等步骤抽取和提纯，获得较低纯度抒发产物rl-aspⅱ。
培门冬酶方案建议及相关文献
国际儿童ALL重要文献解读
国外儿童III期随机临床试验
临床试验 例数（例） 年龄（岁） 剂量IU/m2 结果 文献出处
-----疗效及安全性
DFCI91-01
377 0-18
2500×1/im 每2周；共15剂 L-ASP 25000U/m2/im 每周;共30剂
PEG组5年EFS 78% L-ASP组5年EFS 84% PEG组毒性低（25%vs36%) 接受ASP<25周5年EFS73% 接受ASP>26周5年EFS90%
2. Larson RA, et al. Blood. 1995;85(8):2025-2037. 4. Clavell LA, et al. N Engl J Med. 1986;315(11):657-663.
L-ASP在ALL的治疗中发挥了巨大作用
时间
70年代 80年代 VCP VPDL VDxIDL/VP DLC
培门冬酶与左旋门冬酰胺酶治疗ALL的随机对照研究----国际多中心
PEG-Asp：儿童ALL的临床研究
在不同治疗时期PEG-Asp组的抗体发生率更低， 降低过敏反应，增强疗效
Avramis VI, Sencer S, Periclou AP, et al. A Randomized comparison of native Ecoli asp and PEGasp for treatment of children with newly diagnosed standard-risk acute lymphoblastic leukemia: a CCG study. Blood，2002, 99:1986-1994.
85-100 nm
磷脂双分子层 Lipid Membrane
门冬酰胺酶
【成份】本品主要成份为门冬酰胺酶，来源于大肠杆菌中提取制备的具有酰胺基水解作用的酶。
辅料：甘露醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。
【性状】本品为白色冻干块状物或粉末。
【适应症】适用于治疗急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、霍奇金病及非霍奇金病淋巴瘤、黑色素瘤等。
本品对上述各种瘤细胞的增殖有抑制作用，其中对儿童急淋的诱导缓解期疗效最好，有时对部分常用化疗药物缓解后复发的患者也可能有效，但单独应用时缓解期较短，而且容易产生耐药性，故多与其他化疗药物组成联合方案应用，以提高疗效。
【规格】（1）5000单位（2）10000单位【用法用量】根据不同病种，不同的治疗方案，本品的用量有较大差异。
以急淋的诱导缓解方案为例：剂量可根据体表面积计，日剂量500单位／m2，或1000单位／m2，最高可达2000单位／m2；以10～20日为一疗程。
【不良反应】成人较儿童多见。
1、较常见的有过敏反应、肝损害、胰腺炎、食欲减退，凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ及纤维蛋白原减少等，过敏反应的主要表现为突然发作的呼吸困难、关节肿痛、皮疹、皮肤瘙痒、面部水肿，严重者可发生呼吸窘迫、休克甚至死亡。
在用肌注给药的晚期儿童白血病，虽其轻度过敏反应的发生率较高，但有报告认为其严重过敏反应的发生率较静注给药低。
过敏反应一般在多次反复注射者易发生，但曾有皮内敏感试验(简称皮试)阴性的患者发生。
另有某些过敏体质者，即使注射做皮试剂量的门冬酰胺酶时，偶然也会产生过敏反应。
肝脏损害通常在开始治疗的2周内发生，可能出现多种肝功能异常，包括血清丙氨酸氨基转移酶[ALT(SGPT)]、门冬氨酸氨基转移酶[AST(SGOT)]、胆红素等升高、血清白蛋白等降低，曾有经肝穿刺活检证实有脂肪肝病变的病例。
患者如感觉剧烈的上腹痛并伴有恶心、呕吐，应疑有急性胰腺炎，其中暴发型胰腺炎很危重，甚至可能致命。
其他尚有恶心、呕吐、腹泻等。
mTORC1
mTORC1/2双重抑制剂OSI -027抑制高氧诱导的肺成纤维细胞增殖和分化*吴黎虹， 唐坤， 党红星△， 符跃强， 刘成军， 李静， 许峰（重庆医科大学附属儿童医院重症医学科，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014）［摘要］ 目的：分析哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin ， mTOR ）复合物1/2（mTORcomplex 1/2， mTORC1/2）双重抑制剂OSI -027对高体积分数氧（高氧）所致人胚肺成纤维细胞增殖和分化的抑制作用。
方法：高氧（95% O 2）处理人胚肺成纤维细胞MRC -5建立增殖分化模型，分为对照组、高氧组、高氧+OSI -027组和高氧+雷帕霉素组。
Western blot 检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin ， α-SMA ）、I 型胶原蛋白（collagen type I ， Col I ）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ， PCNA ）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、RhoA 、Rho 相关含卷曲螺旋蛋白激酶1（Rho -associated coiled -coil -containing protein kinase 1， ROCK1）、蛋白激酶B （protein kinase B ， PKB/AKT ）、p -AKT 和mTOR 的表达； CCK -8实验检测细胞活力；流式细胞术检测细胞周期。
结果：与对照组相比，PCNA 、cyclin D1、Col I 和α-SMA 表达随高氧处理时间增加而增加（P <0.05）。
与高氧组相比，OSI -027及雷帕霉素干预后，细胞活力下降，细胞周期被抑制在G 1期（P <0.05）。
培门冬酶应用分享
16岁患者；
既往体健，无食物、药物过敏史；
年1月份因“头晕、乏力10余天。”在我科住 院，查体：贫血貌，胸骨压痛，颈部、腋 窝可触及多个肿大淋巴结，最大约2.5*3cm， 肝肋未触及，脾肋下3cm可触及肿大。
血常规：HGB 52g/L，PLT 36*10^9/L，红细 胞RBC 2.69*10^12/L，WBC 19.99*10^9/L， 幼稚细胞 72%。
其中1例患者使用培门冬酶注射液后凝血功 能如下：
另外1位患者使用培门冬酶后出凝血功能结 果如下：
予CVDLP方案诱导治疗，化疗期间使用门冬酰胺酶静滴治疗，使用约5分钟后出现颜面潮红，自觉呼吸困难，查体：颜面、颈部皮肤潮 红，未见皮疹，呼吸急促，25次/分，两肺未闻及干湿性质啰音，考虑过敏反应，停止使用门冬酰胺酶，使用地塞米松5mg抗过敏治疗 ，病情好转； 其中1例患者使用培门冬酶注射液后凝血功能如下： 85%），主要表现为纤维蛋白原降低及APTT延长，其中2例患者使用培门冬酶注射液后凝血功能结果如下： 结合我科情况，临床中使用培门冬酶及门冬酰胺酶对比，使用培门冬酶患者发生过敏反应有显著降低，其安全性更好。
FISH示未检测到BCR/ABL融合基因。 诊断：Ph-急性T淋巴细胞白血病（T淋巴母
细胞 高危组）
予CVDLP方案诱导治疗，化疗期间使用门冬 酰胺酶静滴治疗，使用约5分钟后出现颜面 潮红，自觉呼吸困难，查体：颜面、颈部 皮肤潮红，未见皮疹，呼吸急促，25次/分， 两肺未闻及干湿性质啰音，考虑过敏反应， 停止使用门冬酰胺酶，使用地塞米松5mg抗 过敏治疗，病情好转；
改用培门冬酶化疗，患者无不适，化疗结 束后复查骨髓提示CR。
诱导植。
曾有报道显示，接受L-Asp治疗的急性过敏 反应发生率可达24%，甚至出现过敏性休克 等危重情况，皮试阴性者也可以发生，特 别是发生在多次用药后。
培门冬酶静默失活在儿童急性淋巴细胞白血病治疗中的新进展
-专题论坛•培门冬酶静默失活在儿童急性淋巴细胞白血病治疗中的新进展梁石明文飞球中国医科大学深圳市儿童医院518000通信作者：文飞球，E m a i l:f w e n62@126.c o m【摘要】门冬酰胺酶包括大肠杆菌和欧文菌来源的门冬酰胺酶，以及培门冬酶。
与前二者相比，由于培门冬酶具有体内半衰期更长、免疫原性更低的优势，目前已成为儿童急性淋巴细胞白血病(A L L)的首选治疗药物。
但是，临床应用培门冬酶治疗A L L患儿过程中，可发生培门冬酶静默失活，从而导致A L L患儿治疗无效，并且严重影响其预后。
培门冬酶静默失活虽然属于亚临床超敏反应，但是与超敏反应相比，其具有一定的隐蔽性，临床难以识别。
因此，笔者通过介绍在儿童A L L治疗中培门冬酶静默失活的定义、发生机制、流行病学特征、危害及处理措施等方面的最新研究进展，以期探寻培门冬酶静默失活的有效识别方法及处理措施。
【关键词】前体细胞淋巴母细胞白血病淋巴瘤；药物疗法；药物过敏；药物监测；培门冬酶；静默失活基金项目：深圳市科技创新委基础研究学科布局项目（JCYJ20170817170110940)D O I：10. 3760/cma. j. cn511693-20200703-00140Advance on silent inactivation of pegasparaginase in treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemiaLiang Shim i n g，Wen FeiqiuDepartment o f Hematologic O ncology»Shenzhen Children' s H o s p ita l»Shenzhen518000,Guangdong Province，ChinaCorresponding a u th o r：Wen Feiqiu •,Em ail：fw e n 62 @126. com【Abstract】Asparaginases include asparaginase derived from c’o/z. or ，andpegasparaginase. Compared with the former two, pegasparaginase has the advantages of longer half-life in vivo and lower immunogenicity, so it has become the first choice for the treatment of acutelymphoblastic leukemia ( ALL ) in children. However，during the clinical application ofpegasparaginase to treat children with ALL» silent inactivation of pegasparaginase may occur, whichleads to ineffective treatment of ALL children, and affects their prognosis seriously. Although thesilent inactivation of pegasparaginase is a subclinical hypersensitivity reaction，compared withhypersensitivity，it has a certain degree of concealment, which is hard to identify. This articleintroduces the latest research progress in the definition, mechanism，epidemiological characteristics,hazards and treatment measures of silent inactivation of pegasparaginase in the treatment of ALL inchildren, in order to find effective methods to identify and treat silent inactivation of pegasparaginase.【Key words】Precursor cell lymphoblastic leukemia-lymphoma ；Drug therapy；Drughypersensitivity；Drug monitoring；Pegasparaginase；Silent inactivationFund program：Basic Research Discipline Layout Project of Shenzhen Science and TechnologyInnovation Committee (JCYJ20170817170110940)DOI: 10. 3760/cma. j. cn511693-20200703-00140急性淋巴细胞白血病（a c u t e l y m p h o b l a s t i cl e u k e m i a，A L L)是儿童最常见的血液系统恶性肿瘤之一，其治疗药物包括糖皮质激素、长春新碱和门冬酰胺酶等[1]。
门冬酰胺酶的制备与分析
重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山1 原理本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。
L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL 的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。
目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。
针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。
本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose 离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。
2 实验材料实验仪器见表1.1。
型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。
表1.1 实验仪器或装置仪器名称型号生产厂家超净工作台PCR扩增仪恒温培养箱超低温冰箱台式离心机恒温摇床涡轮振荡器高压灭菌锅蛋白电泳仪核酸电泳仪凝胶成像仪紫外分光光度计高效液相色谱仪扫描型紫外分光光度计制冰机超声清洗机实验试剂和材料见表1.2。
材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。
表1.2 试剂和材料试剂或材料材质或规格来源E.coli 野生型菌株CPU21009 实验室储存pMD18-T 50ng/μl 宝生物工程有限公司pET-22b 50ng/μl 宝生物工程有限公司Nde Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司Xho Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司T4 DNA Ligase 350U/μl 宝生物工程有限公司DNA纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司CaCl260mmol/L 实验室储存PBS 50x 实验室储存NaCl 分析纯Taq 酶 Mix 分析纯(NH4)2S2O8分析纯C 2H6OS 分析纯CH4O 分析纯冰乙酸分析纯C 2H6O 分析纯氨基丁三醇分析纯考马斯亮蓝分析纯SDS 分析纯Nessler's 试剂Reagent,ACS 美国Spectrum公司酵母粉分析纯L-天冬酰胺分析纯英国OXOID公司蛋白胨分析纯甘氨酸分析纯琼脂糖分析纯葡萄糖食品级TEMED 优级纯溴酚蓝分析纯IPTG 优级纯丙三醇分析纯3 实验思路与步骤本实验设计从大肠杆菌野生型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR 扩增目的基因ansB，随后对PCR产物进行纯化。
实验一 重组表达门冬酰胺酶II工程菌的构建
实验一重组表达门冬酰胺酶II工程菌的构建【实验目的】1. 了解构建重组质粒的原理2. 掌握质粒提取方法、PCR技术、酶切、连接等基本技术方法【实验原理】门冬酰胺酶，别名L-门冬酰胺酶、天冬酰胺酶或天门冬酰胺酶。
L-天冬酰胺是细胞合成蛋白质的必需氨基酸。
肿瘤细胞中的天冬酰胺合成酶含量非常低，故自身不能合成L-天冬酰胺，需依赖外源L-天冬酰胺才能生存。
而L-天冬酰胺酶可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成，导致肿瘤细胞的死亡。
人体内正常细胞则因能自身合成L-天冬酰胺，所以受L-ASP的影响较小。
故L-ASP可用于急性淋巴细胞白血病的治疗。
目前临床上使用的L-ASP 泛指来源于大肠杆菌的E.coli L-ASP II。
目前，临床上使用的门冬酰胺酶主要来自于大肠杆菌。
从1974年天津生化制药厂开始生产L-ASP，到1995年吴梧桐教授等进行的E.coli天冬酰胺酶ansB 基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了高效表达L-ASP的基因工程菌pKA/ CPU210009，工程菌发酵单位比野生株高出100倍。
随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组L-ASP 的纯化路线，并对重组产品进行了鉴定。
L-ASP的制备纯化工艺越来越成熟，这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E. coli L-ASP开辟了新的道路。
聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，利用DNA变性和复性的特点，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
《中国药典》2010年版(二部)
283
158 23 1871
261 / 15
144 / 24 0 1448
92.2%
91.1% 0 77.4%
化学药中由于未找到样品而未修订的品种有306个，占保留上版品种21.8%
2010年版与2005年版药典主要项目收载情况比对表
增修订项目 红外光谱鉴别 有关物质 残留溶剂 渗透压摩尔浓度 溶出度或释放度 含量均匀度 无菌检查方法 细菌内毒素 含量测定 HPLC法 原料 制剂 HPLC方法 2005年版 530 2 142 24 4 315 165 107 216 359 2010年版 580 73 707 97 45 414 219 132 372 694
依法进行该项检查外，其他未在“残留溶剂”项下明确列出的有机溶
剂与未在正文中列有此项检查的品种，如生产过程中引入或产品中残 留有机溶剂，均应按本版药典附录“残留溶剂测定法”检查并应符合
相应溶剂的限度规定。
主要内容
1 3 2 3 4 5 3 二部特点及品种收载情况
凡例的增修订情况
各论的增修订情况 现代分析技术的应用
凡例的增修订情况
正 文
• 八、正文系根据药物自身的理化与生物学特性，按照批准的处方来源、生
产工艺、贮藏条件等所制定的、用以检测药品质量是否达到用药要求并衡 量其质量是否稳定均一的技术规定。
附 录
• 十、附录主要收载制剂通则、通用检测方法和指导原则。制剂通则系按照 药物剂型分类，针对剂型特点所规定的基本技术要求；通用检测方法系各 正文品种进行相同检查项目的检测时所应采用的统一的设备、程序、方法 及限度；指导原则系为执行药典、考察药品质量、起草与复核药品标准等 所制定的指导性规定。
规范并真正反映药品的组成和剂型特点，明确了剂型的亚类，与制剂 通则一致。 将胶丸统一修改为软胶囊 硫糖铝片改硫糖铝咀嚼片。 替硝唑注射液（均为大容量规格）改名为替硝唑氯化钠注射液 把甲硝唑注射液中大容量规格改名为甲硝唑氯化钠注射液
Oncaspar（pegaspargase、PEG+L-门冬酰胺酶）
Oncaspar(pegaspargase、PEG+L-门冬酰胺酶)培加帕加司<br>【英文名】 Pegaspargase（Oncaspar）<br>【结构式】本品是L-天门冬酰胺酶的修型（来自大肠杆菌）是由单甲氧基聚乙烯乙二醇（PEG）的共价结合单位产生的酶，分子量约5000。
<br>【作用特点】某些肿瘤细胞本身不能合成L-天门冬酰胺（它是合成蛋白质必需的氨基酸）。
本品可使进入肿瘤L-天门冬酰胺水解，肿瘤细胞得不到L-天门冬酰胺，而影响其蛋白质的合成，最终使肿瘤细胞的增长繁殖受到抑制。
正常组织细胞自身有合成L-天门冬酰胺的能力，不受本品的影响。
本品的抗原性比天然L-天门冬酰胺酶低。
血浆半衰期比天然型显著延长。
<br>【功能主治】本品适用于急性淋巴细胞白血病（ALL），这种病人治疗中需要L-天门冬酰胺酶，若已对天然L-天门冬酰胺酶产生过敏，可试用本品。
一般本品与其它化疗药物并用，如长春新碱、甲氨喋吟，阿糖胞苷，柔红霉素和阿霉素。
只有在确认多种化疗药物不适用时才可单用本品。
本品的疗效已证实与天然L-天门冬酰胺酶类似。
对天然L-天门冬酰胺酶十分严重过敏反应的病人，也能耐受本品。
本品也已在非何杰金淋巴瘤和急性骨髓性白血病被评价。
然而目前还不是指定的适应症。
<br>【用法用量】本品可肌内注射或静脉滴注。
以肌内注射的过敏性或其它不良反应发生率较低。
本品每14日1次，2500IU／m2。
儿童体表面积小于0.6m2，剂量按每14日82.5IU／kg。
本品的作用持续时间长，比用天然L-天门冬酰胺酶的剂量小，给药次数少。
本品肌注，单次给药容量应限于2ml，如果＞2ml，应使用多处部位注射。
静脉给药时，本品应以100ml生理盐水或5％葡萄糖液稀释后连续滴注l～2／小时。
<br>【注意事项】病人用药后必须严密观察1小时并做好过敏反应的急救准备。
左旋门冬酰胺酶治疗急性淋巴细胞性白血病的护理
左 旋 门冬 酰胺 酶 治疗 急性 淋 巴细胞 性 白血病 的护理
潘玉琴 刘远玲 ’
关键词 ： 左旋 门冬 酰胺 酶 ； 急性淋 巴细胞性 白血病 ； 护理
中图分 类号 ：４ ３ ３ Ｒ ７． ７
文 献标识 码 ： Ｂ
文章编 号 ：０ ６０ ７ （００ １— １８０ １０ — ９９ ２１ ）４ ０ ４— １
２ １ 年 ５ ５日收稿 ０， ０ ， （３ １ ８ — ５ ５ ］ ２ ６ ２１ ） ５ ４ １８ ． ０ ２ ：
忌 高脂 高蛋 白饮 食加 重 了胰腺 功能 负担 ， 易 左旋 门冬 酰胺 酶 （ — Ｓ ）为 治疗 急 性淋 巴细 胞 性 白血 病 少量多 餐 ， 暴饮 暴食 ， ＬＡ Ｐ （Ｌ） Ａ Ｌ 的基本 药物之 一 。它显 著 提 高了患 者无 病生 存率并 降 低髓 诱发急性胰腺炎。 本组 １ 例患者出现呕吐、 腹痛， 急查血淀粉酶正 外白血病的发生率。但 Ｌ Ａ Ｐ － Ｓ 存在一定的毒副作用， 的毒副 常 ， 痉处 理后缓 解 ， 患者 无 １ 常见 予解 本组 例发生 急性胰 腺炎 。 作 用 有 胃肠道 反应 、 髓抑 制 、 糖 异 常 、 骨 血 肝功 能 损 害 、 过敏 反 应 ２５ ．骨髓抑 制 的护理 ： 疗期 间 患者 表现 出不 同程 度 的骨髓受 抑 ， 化 — 等 。我 科 ２０ 年 ５ 一 ００ ５ 应 用 Ｌ Ａ Ｐ联 合化 疗 治疗 急 表 现 为 白细胞 、血小 板 、血 红蛋 白减少 ，最 低值 见 于用 药后 ７ ０８ 月 ２ １年 月 —Ｓ ４ 性 淋 巴细胞性 自血病 ３ 例 ， 对 （— Ｓ ） ｆ 的毒 副作 用 ， 取 １ ｄ。 ６ 针 ＬＡ Ｐ￣起 采 有 效 的护 理措施 ， 较为 满 意的效 果 ， 取得 现将 护理体 会报 道如 下 。 ２ ． ． １白细胞 减 少的 护理 ： 组 ３ 例 患者 出现 白细胞 不 同程度 减 ５ 本 ３ １ 临床 资料 少 ， 患 者适 当卧床 休 息 ， 强 口腔 、 阴部 及皮 肤 的护 理 ， 指导 加 会 予 ％ ４ ｄ １ 一般资料：０ ８ ５月至 ２ ｌ 年 １ ，我科应用 Ｌ Ａ Ｐ治 复方氯已定与 ２ 碳酸氢钠溶液交替漱 口， 次，，外 出检查时戴 ． １ ２０ 年 ０ ０ ５月 —Ｓ 疗 Ａ Ｌ３ 例 ， ２ 例 ， ７例； Ｌ ６ 男 ９ 女 年龄 ｌ～ ８ ３ 例 Ａ Ｌ ８４ 岁。 ６ Ｌ 患者经 口罩 ， 持病 房 及床 单 的 清 洁 ， 洗 内衣 ， 保 勤 限制探 视 ， 排单 间或 安 临床 、 、 血液 骨髓检查 确诊 ， 合 Ａ Ｌ 断标 准 ｆ 符 Ｌ诊 ｌ 】 。 双人 间 ， 严格 执行 无 菌 操作 原 则 ， 本组 ５ 白细胞 ＜ ｘ０ Ｌ 按 医 例 ｌ ｌ９ ， ／ １ 方 法 ： 多药 联合 方案 化 疗 ， 导期 给 予 Ｌ Ａ Ｐ隔天 １ ， ． ２ 按 诱 —Ｓ 次 共 嘱予 升高 白细胞 的药物 治 疗后 ， 期 复查 血 常规 ， 定 自细胞 逐渐 恢 ８ ｌ 次 ， 固期及 强化期 给 予 Ｌ Ａ Ｐ隔天 １ ， ４ ６ 。应 用 复。本组 患者 经 以上护 理措 施未 发生 严重感 染 。 一Ｏ 巩 —ｓ 次 共 ～次 Ｌ Ａ Ｐ前 必需 做皮 肤试 验 阴性 后 方可 用 药 ，剂 量为 ｌ０ ０ Ｕｒ ２ ． —Ｓ ０ ０Ｋ ，２ ．２贫血 的护 理 ：本 组 ２ 患者 在化 疗结 束 后 ８ １ 出现 血 ｎ ５ ８例 —０天 加人 生理 盐水 ２０ ｌ 脉 滴 注 ，静脉 滴 注 Ｌ Ａ Ｐ 给 予 生理 盐 红蛋白下降， ５ｍ 静 — Ｓ前 根据贫血的程度指导患者休息与活动 ， 进食高维生 水 １０ ｌ 昂丹 司琼 ８ ｇ 脉滴 注 。 ０ｍ 加 ｍ 静 素及 易 消化 的饮 食 ， 例 患者 血红 蛋 ￣＜ ０／， 医嘱用 滤除 自细 ３ ６ｇ 遵 Ｌ ２ 护 理 胞输 血 器输 注浓 缩红 细胞 ２ ３ ，输 血前 ３ 分 钟按 医嘱给 予 ５ —ｕ ０ ％ ０ｍ 加 ０ ０ｌ ｌ ２ 天后血红 ４ ２ 心理护理 ：患 者及 家属 对化 疗 药物 的作 用 及不 良反应 知晓甚 葡萄 糖 １０ ｌ １％葡萄 糖酸 钙 １ｍ 静脉 滴注 ， — ０ ． １ 少 ， 疗引起 的不适 感 到恐惧 、 虑 、 知所 措 等。 因此护 士应 蛋 白逐 渐恢 复 。 对化 焦 不 根 据 患者 的性格 特 征 、 心理 承 受能 力 及应 对 能 力 ， 绍 药 物 的作 ２ ． 介 ．３出血 的预 防及 护理 ：２ 患 者 出现血 小板 减少 ， 为患者 ５ ３例 表现 用疗 效 ， 能 出现 的不 良反 应 ， 心 解释 患 者及 家属 提 出的 问题 ， 全身皮肤可见散在皮下出血点及瘀斑， 可 耐 口腔、 鼻腔黏膜出血。 嘱患 关 心体 贴患 者 ， 励 患者 及 家 属树 立治 疗 信 心 ， 合 治 疗 及护 者卧床 休息 ， 软质 饮食 ， 密观 察 全身皮 肤 的 出血症状 ， 鼓 并配 进食 严 避免 肌 肉注 射 ；牙龈 、鼻腔 出血 时可 用 １ ％的麻 黄素棉 球 填塞压 迫止 理， 提高生 活质量 ， 生存期 。 延长 ２ ． ２胃肠道 反应 的护 理 ： 患 者 出现 食 欲 不振 、 心 、 吐 胃肠 血 。当血 小板 ＜０ ｌ９ ， 医嘱给予 机采 血小板 １ 本组 恶 呕 ２ ｘ ０Ｌ时 按 ／ 个治疗 量静 并给 予升 高血 小板 的药 物治疗 ， 每天 １ ， 期复查 血常 次 定 道反应 ｌ 例 。 导患 者化疗 期 间进食 半 流质 或软食 ， 量 多餐 脉 输注 。 ９ 指 以少 为原 则 ； 辛 辣 、 硬 、 炸 、 禁 坚 油 刺激 性 食 物 ； 免 在化 疗前 后 １ 规 ， 患者 大便 时勿 用力 排便 ， 以上 护理 措施 ， 未发 生严 避 ｈ内 指导 经 患者 进食 ， 食后 ３ｒｎ 半 卧位 或坐 位 ， 防止 食物 返 流引起 呕 吐 ； 重 出血 。 进 ０ｉ取 ａ 以 必要时遵医嘱给予止吐剂 ， 胃复安、 如 欧必停等 。按医嘱经予中 ２ 肝 功能 损害 ：本组 患者 ７ 出现转 氨酶 升高 ，经保 肝治疗 ｌ ． ６ 例 ４ 枢镇 吐 药 ，在应用 Ｌ Ａ Ｐ前 ３ －Ｓ Ｏ分钟 予生 理盐 水 ｌＯ ｌ 昂丹 司 天 ， 期监 测肝 功能 ， 当休息 ， 者肝功 能好 转 。 Ｏｍ 加 定 适 患 琼 ８ ｇ 脉滴 注 ， ｍ静 每天 ２次 ， 以上 护理 ， 经 停用 Ｌ Ａ Ｐ后 ３ ， —Ｓ 天 上 ２ 血 糖异 常 ： ， ７ 本组 中应 用 Ｌ Ａ Ｐ前 血糖 均正常 ， －Ｓ 用药后 有 ｌ 出 例 述症 状减 轻 ， 欲逐渐 恢复 。 食 现血糖升高。 发生可能与 Ｌ－Ｓ － Ｐ抑制蛋 白质合成 ， Ａ 毒性损伤胰岛细 ２３ 敏反应 ： 无 １ 过 敏反 应 ， Ｌ Ａ Ｐ为异 种 蛋 自 ， 入 胞 有关 。护理 上重 视患 者 的主 诉 、 ．过 本组 例 但 —Ｓ 进 症状 及体 征 ， 观察 有无 口渴 、 多 机体 可 以产 生抗 体 ， 续使 用多 次后 或 停 药 ２ 后第 ２次应用 时 饮 、 尿等异 常情况 。本组 １ 在应用 Ｌ Ａ Ｐ 天后 出现 口渴 、 连 周 多 例 － Ｓ８ 多 多 测 １ ｍｏＬ按 ／ －Ｓ ， 易发 生变 态反应 。应延 长 观察 皮 试时 间至 ４ ，ｈ ｈ４ 后应 用 Ｌ Ａ ， 饮 、 尿症状 ， 指尖血 糖为 ４ ｍ ｌ ， 医嘱停用 Ｌ Ａ Ｐ 予生理 －Ｓ Ｐ 如更换批号 ， 需重新做皮试， 阴性方可用药。 静脉滴注过程 中密切 盐水 ５ ｍ 加 中性胰岛素 ５ｕ 管微 量泵注入 ，，ｍ ｈ ０ｌ ０另 ２６ Ｆ ，在治疗 后 － 观察有 无变 态反应 的症状 ， 以便及 时 有效 处 理 。一旦 发现 过敏立 监测空腹血糖及三餐后 ２ 血糖 ， ｈ 控制饮食 ， ２天后血糖恢复正常。 即应用 激素 、 剂等 ， 停 用 Ｌ Ａ Ｐ 钙 并 —Ｓ。 参 考文 献 ２ ． ４饮食 护理 ：应用 Ｌ Ａ Ｐ期 间 特别 要 强 调低 脂 饮食 ，使 用 Ｌ ［］ 之 南． 液 病 诊 断 及 疗 效 标 准ｆ 】 －Ｓ — １ １张 血 Ｍ． ２版． 京 ： 学 出版社 ． 北 科 Ａ Ｐ前 ３ 致 停药 ３ ５ 予 低脂 饮食 ，可 显 著减 少胰 腺炎 的 发生 ， １ ９ １ ４—１ ４ Ｓ ｄ —ｄ ９ ９．８ ９ ． ｆ 李 小银 ， 素 铭 ， ２ １ 揭 李碧 辉． 护理 及健 康教 育在 多发 性 骨髓 瘤 心理 广西梧州 市工人 医院血液肿瘤 科（４０ １ ５ ３０ ）
细胞毒性药物配制方法及使用时注意事项
抗肿瘤药物的用药顺序及溶媒选择原则（1）药物相互作用原则有的化疗药物之间会发生相互作用，从而改变药物的体内过程，可能影响疗效或毒性。
如顺铂影响紫杉醇的清除率，先用紫杉醇再用顺铂。
（2）刺激性原则使用非顺序依赖性化疗药物时，应先用对组织刺激性较强的药物，后用刺激性小的药物。
由于治疗开始时静脉尚未损伤，结构稳定性好，药业渗出机会少，药物对静脉引起的不良反应较小如长春瑞滨和顺铂合用时，长春瑞滨刺激性强，宜先给药。
（3）细胞动力学原则生长较慢的实体瘤处于增殖期的细胞较少，G0期细胞较多，先用周期非特异性药物杀灭一部分肿瘤细胞，使肿瘤细胞进入增殖期再用周期特异性药物。
顺铂和依托泊苷合用时，先用顺铂后用VP-16。
生长快的肿瘤先用周期特异性药物大量杀灭处于增殖周期的细胞，减少肿瘤负荷，随后用周期非特异性药物杀灭残存的肿瘤细胞。
用药顺序1、联用顺铂化疗化疗方案联用药物用药顺序原因GP 吉西他滨先用GEM 顺铂会影响吉西他滨的体内过程，加重骨髓抑制。
TP 紫杉醇先用PTX 顺铂对细胞色素P450酶有调节作用，可使PTX清除率大约降低33%,产生更为严重的骨髓抑制FP 5-FU 先用DDP 小剂量DDP能够增加细胞内蛋氨酸, 使细胞内活性叶酸生成增加, 从而增加5-FU的抗肿瘤作用。
PP 培美曲塞先用Alimta，30min后用顺铂说明书2、联合长春新碱化疗化疗方案联用药物用药顺序原因CHOP 环磷酰胺先用VCR，6-8小时后在给CTX VCR具有同步化作用，使细胞停滞在M期，约6~8h后细胞同步进入G1期，再用CTX可增效VCM 甲氨蝶呤先用VCR VCR阻止甲氨蝶呤从细胞内渗出而提高细胞内浓度VDLP 门冬酰胺酶先用VCR 合用加重神经系统血液系统毒性，先于门冬12~24小时给药3、甲氨蝶呤化疗方案联用药物用药顺序原因CMF 5-FU 用MTX4～6h后用5-FU 序贯抑制 MTX----二氢叶酸还原酶抑制剂 5-FU-----胸腺嘧啶合成酶抑制剂VCM 甲氨蝶呤先用VCR 阻止甲氨蝶呤从细胞内渗出而提高细胞内浓度，先注射VCR门冬酰胺酶使用门冬酰胺酶10日后使用本品或者使用本品24小时后给予门冬酰胺酶门冬酰胺酶能抑制蛋白质的合成，使细胞停止于G 1 期，不能进入S期，从而降低其对MTX的敏感性。
《培门冬酶在成年人急性淋巴细胞白血病及结外NK
㊃共识解读㊃[收稿日期]2023-05-15[作者简介]新疆维吾尔自治区自然科学基金(2022D 01A 09);天津市卫生健康科技项目(Z C 20171);天津市医学重点学科(专科)建设项目(T J Y X Z D X K -009A )[作者简介]郑雅心(1997-),女,河北秦皇岛人,天津医科大学医学硕士研究生,从事血液肿瘤的诊治研究㊂*通信作者㊂E -m a i l :t i a n c h e n @t jm u c h .c o m ‘培门冬酶在成年人急性淋巴细胞白血病及结外N K /T 细胞淋巴瘤中应用的中国专家共识(2022年版)“解读郑雅心,邢丽静,王美懿,王亚非,田 晨*(天津医科大学肿瘤医院血液科,国家恶性肿瘤临床医学研究中心,天津市恶性肿瘤临床医学研究中心,天津市肿瘤防治重点实验室,天津300060) [摘要] 脂质体门冬酰胺酶由左旋门冬酰胺酶㊁聚乙二醇和磷脂双分子层连接而成,其半衰期长,免疫原性低㊂2009年国家药品监督管理局(N a t i o n a lM e d i c a lP r o d u c t sA d m i n i s t r a t i o n ,NM P A )批准培门冬酶上市,在成人及儿童急性淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤中广泛使用㊂本文对中华医学会血液学分会制定的‘培门冬酶在成年人急性淋巴细胞白血病及结外N K /T 细胞淋巴瘤中应用的中国专家共识(2022年版)“进行解读,旨在阐明其适用范围㊁剂量㊁不良反应以及其在成年急性淋巴细胞白血病与结外鼻型N K /T 细胞淋巴瘤患者中的合理使用㊂ [关键词] 白血病,淋巴样;天冬酰胺酶;淋巴瘤 d o i :10.3969/j .i s s n .1007-3205.2024.03.001 [中图分类号] R 733.7 [文献标志码] A [文章编号] 1007-3205(2024)03-0249-05培门冬酶是一种经聚乙二醇化学偶联修饰后的门冬酰胺酶制剂,较左旋门冬酰胺酶(s p a r a gi n a s e ,L -A s p)具有更长的半衰期及较低的免疫原性[1],目前是临床上治疗急性淋巴细胞白血病(a c u t el y m ph o b l a s t i c l e u k e m i a ,A L L )和结外鼻型N K /T 细胞淋巴瘤(e x t r a n o d a l N K /T -c e l ll y m p h o m a ,E N K T C L )的基础药物之一[2]㊂大肠杆菌来源的L -A s p在A L L 治疗中已应用多年,在成人及儿童A L L 诱导方案中增加L -A s p 能提高完全缓解(c o m pl e t e r e m i s s i o n ,C R )率㊂但大肠杆菌来源的L -A s p 属于异源蛋白,能够刺激机体抗体的产生并产生过敏反应,严重时甚至危及患者生命[3]㊂脂质体门冬酰胺酶(p e g a s p a r g a s e -a s p a r a gi n a s e ,P E G -A s p )是L -A s p 与门冬酰胺酶共价结合聚乙二醇(p o l y e t h y l e n e g l y c o l ,P E G )及磷脂双分子层连接而成一种长效型制剂,较L -A s p 半衰期明显延长,故能够延长给药间隔,减少使用频率;其免疫原性较低,过敏反应发生较少[4-5]㊂本文对‘培门冬酶在成年人急性淋巴细胞白血病及结外N K /T 细胞淋巴瘤中应用的中国专家共识(2022年版)“[6]进行解读,阐明其适用范围㊁剂量㊁不良反应以及其在成年A L L 及E N K T C L 患者中的合理使用㊂1 研究历史门冬酰胺酶是A L L 联合化疗方案中的一线用药,能改善A L L 患者的无病生存率以及缓解率㊂部分肿瘤细胞中缺少门冬酰胺合成酶,无法将外周血中的门冬氨酸和氨合成门冬酰胺,仅依靠血浆中的门冬酰胺完成蛋白质合成,门冬酰胺酶则消耗血浆中的门冬酰胺,抑制肿瘤细胞蛋白质合成,致其凋亡[7-8]㊂目前获美国食品药品管理局(F o o da n dD r u gA d m i n i s t r a t i o n ,F D A )批准使用的门冬酰胺酶是源自大肠杆菌的P E G 化合物㊁聚乙二醇化天冬酰胺酶㊁源于革兰阴性菌的门冬酰胺酶以及重组欧文菌天冬酰胺酶[9]㊂2006年F D A 批准P E G -A s p 作为AL L 的一线治疗用药,其既保持了抗肿瘤活性,又降低了外源性细菌蛋白质的免疫原性㊂2009年培门冬酶经国家药品监督管理局(N a t i o n a l M e d i c a l P r o d u c t sA d m i n i s t r a t i o n ,NM P A )批准上市㊂研究证明其治疗淋巴肿瘤的临床疗效显著,且不良反应发生情况较少且可控,具有良好的应用前景[10]㊂㊃942㊃第45卷第3期2024年3月河北医科大学学报J O U R N A L O F H E B E I M E D I C A L U N I V E R S I T YV o l .45 N o .3M a r . 20242培门冬酶的应用2.1诱导治疗的目标指南认为成年人A L L的诱导治疗,可选择儿童特点方案或以V D P方案(长春新碱㊁柔红霉素和泼尼松)为基础联合环磷酰胺和门冬酰胺酶(L-A s p/P E G-A s p)㊂并可以使用培门冬酶替代L-A s p㊂2.2理化性质㊁作用机制及给药方式指南阐明培门冬酶与L-A s p相比,具有半衰期长㊁低免疫原性的特点㊂培门冬酶是一种天冬氨酸酶,其特点是能够降低血液中的天冬氨酸水平,从而抑制癌细胞的生长和分裂㊂与其他天冬氨酸酶不同的是,培门冬酶被修饰为聚乙二醇化合物,这使得它在体内的半衰期延长,故而药物在到达肿瘤细胞前能够以脂质体的形态存在,避免被蛋白酶分解,因此可以更长时间地发挥作用㊂培门冬酶的另一个特点是免疫原性相对L-A s p 更低,过敏反应明显减少㊂因为它是一种外源性蛋白质,不同于人体自身产生的蛋白质,并且被修饰为聚乙二醇化合物,可降低其被免疫系统识别和攻击的可能性㊂由此可见培门冬酶相比L-A s p,具有更强的抗肿瘤能力和更低的致不良反应发生率㊂部分肿瘤细胞(如E N K T C L)中缺少门冬酰胺合成酶,无法合成门冬酰胺,而门冬酰胺酶则通过消耗血浆中的门冬酰胺,抑制肿瘤细胞的蛋白质合成㊂人体正常细胞内门冬酰胺合成酶活性正常,可自行合成门冬酰胺以维持自身生理需求,故培门冬酶能选择性杀伤A L L和E N K T C L细胞㊂对于给药方式,指南推荐肌内注射㊂药代动力学研究也表明,单次肌内注射后,其活性在第5天达到峰值[11]㊂2.3在成年人费城染色体阴性(P h-)A L L中的应用指南认为,培门冬酶可用于成年人A L L治疗的不同阶段,包括诱导治疗㊁巩固治疗和早期强化治疗㊂并且主要用于年龄<65岁且无严重并发症的患者㊂其推荐给药剂量为2000U/m2或2500U/m2;给药频率2周1次㊂2.4在青少年和年轻成年人(y o u n g a d u l t s,A Y A)A L L中的应用美国国立综合癌症网络(N a t i o n a l C o m p r e h e n s i v eC a n c e rN e t w o r k,N C C N)指南和中国成人A L L指南均推荐对A Y A(A d o l e s c e n ta n d Y o u n g A d u l t)患者采用儿童样化疗方案㊂指南指出,培门冬酶是儿童样化疗方案的重要组成部分,能够维持微小残留病(m i n i m a lr e s i d u a ld i s e a s e, M R D)的治疗反应,改善A Y A A L L患者的无事件生存期(e v e n tf r e es u r v i v a l,E F S)和总生存期(o v e r a l l s u r v i v a l,O S)㊂多项临床研究表明,在青少年及年轻成年患者中应用儿童样方案能获得E F S㊁O S以及无病生存期(d i s e a s e f r e e s u r v i v a l,D F S)的获益[12-14]㊂指南中对于诱导后C R(特别是MR D阴性)的成年P h-A L L患者或无移植机会的患者,优先推荐儿童样方案,从诱导至延迟强化阶段使用培门冬酶㊂C A L G B10403试验证明了使用强化儿科方案治疗40岁以下的A Y A s是可行的,其治疗相关病死率低,结果显著改善㊂使用该治疗方案的患者3年生存率为73%,与早期C A L G B研究中该年龄组3年生存率为55%相比,生存率显著提高㊂这些结果表明更广泛地使用糖皮质激素㊁新碱和培门冬酶并强化和延长中枢神经系统预防可使A Y A sA L L 患者的生存获益[15]㊂2.5在特殊成年A L L患者中的应用对于老年患者,指南推荐在使用门冬酰胺酶时谨慎评估,包括是否合并心脑血管疾病㊁糖尿病和血栓相关事件风险等,并适当调整治疗强度㊂对于肥胖患者,有研究表明,使用培门冬酶治疗过程中,血糖波动㊁肝功能损伤和胰腺炎发生的风险增加[16-17]㊂对于特殊人群,如老年㊁伴有多种合并疾病㊁肥胖或伴有脂肪肝等情况,指南推荐延长给药间隔,降低给药剂量为ɤ2000U/m2㊂2.6在P h+/B C R-A B L+成年人A L L中的应用对于是否在成年人P h+A L L中使用含培门冬酶的化疗方案,结果仍具有争议㊂E WA L L的一项研究中,老年P h+A L L患者采用达沙替尼联合低剂量化疗,在诱导缓解后的巩固治疗阶段加入门冬酰胺酶, 5年O S率可达36%[18]㊂也有研究表明,尽管P E G-A S P能延长天冬酰胺酶活性,但对P h+A L L 患者具有极大的毒性[19]㊂但也有研究证明成年人A L L的Ⅳ期研究初步结果,采用B M F方案为基础的诱导化疗,包括最多8个周期P E G-A s p,122例P h+A L L患者可评估疗效,C R率为95%,3年O S 率为74%[20]㊂指南认为在成年P h+A L L患者,门冬酰胺酶或培门冬酶可用于诱导治疗和巩固治疗,耐受性良好,可提高疗效㊂2.7在复发难治成年人A L L中的应用本指南推荐在复发难治P h-A L L成年患者中使用含培门冬酶的治疗方案,尤其是初次诱导化疗方案㊂成年复发难治A L L患者的标准挽救治疗仍未达成共识,指南认为距首次缓解超过2年的复发A L L患者,可应用含培门冬酶的原诱导方案再诱㊃052㊃河北医科大学学报第45卷第3期导;对于距首次缓解不足2年的复发A L L患者,可换用诱导化疗方案进行再诱导,也可借鉴儿童A L L 的挽救治疗方案㊂一项Ⅱ期A S P-304试验表明,单药或联合其他化疗药物治疗复发性A L L儿童患者C R为47%,P R为11%[21]㊂2.8在E N K T C L中的应用对于E N K T C L患者的治疗方案包括放化疗㊁造血干细胞移植以及靶向治疗㊂与单纯放疗相比,联合模式疗法(c o m b i n e d-m o d a l i t y t h e r a p y,C MT)显著改善了中危/高危患者的O S和无进展存活率(p r o g r e s s i o n-f r e e s u r v i v a l,P F S),但对低危患者没有改善㊂对于这些诱导化疗后C R的患者,在化疗方案3个周期内或之后开始放疗的结果相似㊂对于化疗后无C R的患者,在3个周期内早期开始放疗的P F S明显优于晚期放疗㊂放疗是早期E N K T C L一线C MT的关键组成部分㊂同步放化疗的应用及以门冬酰胺酶为基础的化疗显著改善了E N K T C L患者的生存[22]㊂S M I L E方案(甲氨蝶呤㊁地塞米松㊁异环磷酰胺㊁L-天冬酰胺酶㊁依托泊苷)首次突破传统治疗有效率,但易引起中性粒细胞减少㊂A s p aM e tD e x方案(左旋门冬酰胺酶㊁甲氨蝶呤㊁地塞米松)治疗复发难治E N K T C L,可适用于不耐受S M I L E方案的患者㊂基于L-A s p的方案(如S M I L E和A s p a M e t D e x)治疗E N K T C L的有效率有所提高,但是不良反应比较明显,此外L-A s p需多次给药,临床应用便利性不高㊂因此中国专家提出P-G D P 方案(吉西他滨㊁顺铂㊁地塞米松和培门冬酶)㊁P-G e m o x(培门冬酶㊁吉西他滨㊁奥沙利铂)及D D G P (培门冬酶㊁顺铂㊁吉西他滨㊁地塞米松)方案均认为是治疗预后模型评分较高E N K T C L患者的一线方案㊂也有研究表明,M E D A(甲氨蝶呤㊁依托泊苷㊁地塞米松和培门冬酶)方案治疗晚期和复发/难治性E N K T C L有效,且不良反应可耐受[23]㊂另一项多中心研究证实,使用G E L O X D(吉西他滨㊁奥沙利铂㊁左旋门冬酰胺酶㊁地塞米松)或P-G E MO X D(培门冬酶㊁吉西他滨㊁奥沙利铂㊁左旋门冬酰胺酶㊁地塞米松)方案治疗的新诊断E N K T C L患者,其C R率可达84%,其中3/4级白细胞减少患者43例(23. 4%),主要的非血液学毒性包括恶心(n=117,63. 6%)和呕吐(n=66,35.9%)[24]㊂但目前其在E N K T C L患者中使用的文献较少,应进一步跟进探究其临床应用价值㊂2.9饮食管理建议应用培门冬酶可能引起胰腺炎,用药期间应进行饮食管理㊂指南推荐用药当天至第3天行戒脂饮食:严格控制脂肪摄入;在第4~ 10天采用低脂低胆固醇饮食㊂指南认为第11天可恢复正常饮食,但仍应清淡饮食㊂2.10禁忌证指南指出,有严重过敏史㊁既往使用L-A s p出现胰腺炎以及出现严重出血事件或严重血栓的患者应禁用㊂既往A s p治疗过程中出现过A s p治疗相关不良反应(如过敏㊁胰腺炎㊁出血㊁血栓)且分级1~2级,停用超过4周后,可换用培门冬酶并观察;如再次出现治疗相关不良反应则永久停用㊂3培门冬酶用药安全性管理3.1不良反应发生情况培门冬酶的总体耐受性较好,最常见的不良反应为肝脏不良反应㊁活化部分凝血活酶时间(a c t i v a t e d p a r t i a lt h r o m b o p l a s t i n t i m e,A P T T)延长㊁高三酰甘油血症㊁高血糖和粒细胞缺乏并发热㊂常见的ȡ3级不良反应为肝脏不良反应㊁粒细胞缺乏并发热㊁高三酰甘油血症㊁高血糖㊁胰腺炎㊁凝血功能异常㊁血栓形成和过敏反应[6,11]㊂在一项成年A L L患者的回顾性分析中,培门冬酶组在诱导期的超敏反应㊁3级或4级肝毒性㊁肾功能损害㊁胰腺病变和出血事件的发生率与大肠杆菌L-天冬酰胺酶组差异无统计学意义[25]㊂在整个治疗期间,应监测患者的肝功能㊁血清葡萄糖㊁淀粉酶㊁脂肪酶水平和患者的凝血功能等[11]㊂3.2过敏反应指南认为,培门冬酶使用前可不进行过敏反应预处理,但应将其用在皮质激素或前置化疗后2~3d㊂若使用过程中发生过敏反应,应停药或换药㊂在过敏反应发生后应进行门冬酰胺监测㊂当轻度过敏反应经处理恢复后可再次使用㊂P E G-A s p致的过敏反应一般发生在早期(第2次或第3次给药)[26]㊂表现为速发型过敏反应,症状包括局部肿胀㊁全身皮疹㊁喉头水肿㊁支气管痉挛㊁过敏性休克等㊂发生后应第一时间肌内注射肾上腺素,并予抗组胺药物㊁类固醇类等,密切观察3d以上㊂3.3胰腺炎指南指出A L L患者使用培门冬酶后发生1~2级胰腺炎,经治达C R后可继续应用,但需减量㊂并且为预防胰腺炎的发生,在开始使用时即应控制饮食㊂培门冬酶相关性胰腺炎(a s p a r a g i n a s e-a s s o c i a t e d p a n c r e a t i t i s,A A P)发生率5.7%~7.5%,病死率高,应引起重视[27-28]㊂指南指出,A A P确诊后,在病情许可下应停用,并依据急性胰腺炎指南进行诊治[29]㊂无症状患者可尝试继续使用㊂复用时,㊃152㊃河北医科大学学报第45卷第3期需降低给药剂量(1000U/m2)并至少住院观察2周以密切监测胰腺炎的复发,并可预防性使用奥曲肽㊂3.4出血与血栓指南建议根据出血部位和严重程度采取相应措施㊂若发生中枢神经系统(c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m,C N S)血栓或出血,立即暂停使用;若发生4级不良反应时永久停用㊂非C N S出血或血栓则在对症治疗的同时暂停给药直至症状缓解ɤ1级,再根据患者情况考虑是否继续使用㊂如发生血栓则应用低分子肝素,儿童患者可预防性使用低分子肝素[30],但成年患者是否预防性使用仍有争议㊂3.5肝功能异常肝功能异常是成年A L L患者应用培门冬酶的常见不良反应,多见于接受儿童方案治疗时,表现为胆红素升高与氨基转移酶升高,通常可逆㊂指南建议在诱导期发生培门冬酶相关肝功能异常的患者,在后续治疗中参照C T C A E分级标准进行管理㊂有研究表明,肥胖㊁糖尿病或代谢异常的患者使用时发生肝脏脂肪变性的风险更大[31],因此应密切监测肝功能㊂4总结培门冬酶注射液是我国自主仿制的脂质体门冬酰胺酶,具有半衰期长㊁低免疫原性的特点㊂培门冬酶与L-A s p疗效接近,且不良反应可控㊂培门冬酶在成年人A L L治疗中广泛应用,指南认为在治疗初诊或复发难治成年人A L L中可以替代L-A s p㊂应用时需预防过敏㊁胰腺炎㊁出血及血栓形成等不良反应㊂目前临床上纳入成年复发难治A L L患者使用培门冬酶的研究较少,此类患者的标准挽救治疗仍未达成共识,仍应鼓励开展临床对照实验,以明确其应用潜力㊂[参考文献][1] N u n e s J C F,C r i s t vãoR O,F r e i r eMG,e t a l.R e c e n t s t r a t e g i e sa n d a p p l i c a t i o n s f o r I-a s p a r a g i n a s e c o n f i n e m e n t[J].M o l e c u l e s,2020,25(24):5827.[2]S a l z e r W,S e i b e l N,S m i t h M.E r w i n i a a s p a r a g i n a s e i np e d i a t r i c a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a[J].E x p e r tO p i nB i o lT h e r,2012,12(10):1407-1414.[3] P i e t e r sR,H u n g e r S P,B o o s J,e t a l.L-a s p a r a g i n a s e t r e a t m e n ti n a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a:a f o c u s o n E r w i n i aa s p a r a g i n a s e[J].C a n c e r,2011,117(2):238-249.[4]王长爽.培门冬酶与左旋门冬酰胺酶治疗儿童急性淋巴细胞白血病的疗效及安全性观察[J].中国药物与临床,2021,21(23):3871-3873.[5] D i n n d o r fP A,G o o t e n b e r g J,C o h e n MH,e ta l.F D A d r u ga p p r o v a l s u mm a r y:p e g a s p a r g a s e(o n c a s p a r)f o r t h e f i r s t-l i n et r e a t m e n t o f c h i l d r e n w i t h a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a(A L L)[J].O n c o l o g i s t,2007,12(8):991-998.[6]中华医学会血液学分会.培门冬酶在成年人急性淋巴细胞白血病及结外N K/T细胞淋巴瘤中应用的中国专家共识(2022年版)[J].白血病㊃淋巴瘤,2023,32(3):129-137. [7] G u o J,C o k e rA R,W o o dS P,e ta l.S t r u c t u r ea n df u n c t i o no ft h e t h e r m o s t a b l e L-a s p a r a g i n a s e f r o m t h e r m o c o c c u sk o d a k a r e n s i s[J].A c t aC r y s t a l l o g rDS t r u c tB i o l,2017,73(P t11):889-895.[8] A v r a m i s V I,T i w a r iP N.A s p a r a g i n a s e(n a t i v e A S N a s e o rp e g y l a t e dA S N a s e)i nt h et r e a t m e n to fa c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a[J].I n t JN a n o m e d i c i n e,2006,1(3):241-254.[9] B r o w nP A,S h a h B,A d v a n i A,e ta l.A c u t el y m p h o b l a s t i cl e u k e m i a,v e r s i o n2.2021,N C C Nc l i n i c a l p r a c t i c e g u i d e l i n e s i no n c o l o g y[J].JN a t lC o m p rC a n cN e t w,2021,19(9):1079-1109.[10]周容,刘伟.培门冬酶治疗淋巴系统肿瘤的安全性分析及处理措施[J].中国处方药,2021,19(8):90-91.[11] H e oY A,S y e dY Y,K e a mS J.P e g a s p a r g a s e:a r e v i e wi na c u t el y m p h o b l a s t i c l e u k a e m i a[J].D r u g s,2019,79(7):767-777.[12] V r o o m a nL M,B l o n q u i s tTM,S t e v e n s o n K E,e ta l.E f f i c a c ya n d t o x i c i t y o f p e g a s p a r g a s e a n d c a l a s p a r g a s e p e g o l i nc h i ld h o o d a c u te l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a:r e s u l t so fD F C I11-001[J].JC l i nO n c o l,2021,39(31):3496-3505.[13] D o u e rD,A l d o s sI,L u n n i n g MA,e ta l.P h a r m a c o k i n e t i c s-b a s e d i n t e g r a t i o n o f m u l t i p l e d o s e s o f i n t r a v e n o u sp e g a s p a r g a s e i na p e d i a t r i cr e g i m e nf o ra d u l t s w i t h n e w l yd i a g n o se da c u t el y m p h o b l a s t i cl e u k e m i a[J].J C l i n O n c o l,2014,32(9):905-911.[14] R y t t i n g M E,J a b b o u r E J,J o r g e n s e n J L,e t a l.F i n a l r e s u l t s o f as i n g l e i n s t i t u t i o ne x p e r i e n c ew i t ha p e d i a t r i c-b a s e dr e g i m e n, t h ea u g m e n t e dB e r l i n-F r a n k f u r t-Mün s t e r,i na d o l e s c e n t sa n dy o u n g a d u l t s w i t h a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a,a n dc o m p a r i s o n t o t h eh y p e r-C V A Dr e g i m e n[J].A mJH e m a t o l,2016,91(8):819-823.[15]S t o c k W,L u g e r S M,A d v a n i A S,e t a l.A p e d i a t r i c r e g i m e n f o ro l d e r a d o l e s c e n t sa n d y o u n g a d u l t sw i t ha c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a:r e s u l t s o f C A L G B10403[J].B l o o d,2019,133(14): 1548-1559.[16] P o l l o c kN I,F l a m a n d Y,Z h uJ,e ta l.H y p e r g l y c e m i ad u r i n gi n d u c t i o n t h e r a p y f o r a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a i st e m p o r a l l y l i n k e d t o p e g a s p a r g a s e a d m i n i s t r a t i o n[J].P e d i a t rB l o o dC a n c e r,2022,69(7):e29505.[17] D e n t o nC C,R a w l i n s Y A,O b e r l e y M J,e ta l.P r e d i c t o r so fh e p a t o t o x i c i t y a n d p a n c r e a t i t i si n c h i l d r e n a n d a d o l e s c e n t sw i t h a c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a t r e a t e d a c c o r d i n g t oc o n t e m p o r a r y r e g i m e n s[J].P ed i a t rB l o o d C a n ce r,2018,65(3):10.[18] R o u s s e l o t P,C o u déMM,G o k b u g e t N,e t a l.E u r o p e a nW o r k i n g G r o u p o n A d u l tA L L(E WA L L)g r o u p.D a s a t i n i ba n d l o w-i n t e n s i t y c h e m o t h e r a p y i n e l d e r l y p a t i e n t s w i t hP h i l a d e l p h i a c h r o m o s o m e-p o s i t i v eA L L[J].B l o o d,2016,128㊃252㊃河北医科大学学报第45卷第3期(6):774-782.[19] P a t e l B,K i r k w o o d A A,D e y A,e ta l.P e g y l a t e d-a s p a r a g i n a s ed u r i n g i n d u c t i o n t he r a p yf o r a d u l t a c u t e l y m p h o b l a s t i cl e u k a e m i a:t o x i c i t y d a t a f r o m t h e U K A L L14t r i a l[J].L e u k e m i a,2017,31(1):58-64.[20] R a f fT,Gök b u g e tN,Lüs c h e nS,e ta l.M o l e c u l a rr e l a p s e i na d u l ts t a n d a r d-r i s k A L L p a t i e n t s d e t e c t e db y p r o s p ec t i v eM R D m o n i t o r i n g d u r i n g a n da f t e r m a i n t e n a n c et r e a t m e n t:d a t a f r o m t he GMA L L06/99a n d07/03t r i a l s[J].B l o o d,2007,109(3):910-915.[21] Q i S N,Y a n g Y,Z h a n g Y J,e t a l.R i s k-b a s e d,r e s p o n s e-a d a p t e dt h e r a p y f o r e a r l y-s t a g e e x t r a n o d a l n a s a l-t y p e N K/T-c e l ll y m p h o m a i n t h e m o d e r n c h e m o t h e r a p y e r a:A C h i n aL y m p h o m aC o l l a b o r a t i v eG r o u p s t u d y[J].A m J H e m a t o l,2020,95(9):1047-1056.[22] K u r t z b e r g J,A s s e l i n B,B e r n s t e i n M,e t a l.P o l y e t h y l e n eG l y c o l-c o n j u g a t e d L-a s p a r a g i n a s e v e r s u s n a t i v eL-a s p a r a g i n a s ei n c o m b i n a t i o n w i t h s t a n d a r d a g e n t s f o rc h i ld re n w i t ha c u t el y m p h o b l a s t i cl e u k e m i ai ns e c o n db o n em a r r o wr e l a p s e:a C h i l d r e n's O n c o l o g y G r o u p S t u d y(P O G8866)[J].JP e d i a t rH e m a t o lO n c o l,2011,33(8):610-616.[23] D i n g H,C h a n g J,L i u L G,e ta l.H i g h-d o s e m e t h o t r e x a t e,e t o p o s i d e,d e x a m e t h a s o n e a n d p e g a s p a r g a s e(M E D A)c o m b i n a t i o n c h e m o t h e r a p y i s e f f e c t i v e f o r ad v a n ce d a n dr e l a p s e d/r e f r a c t o r y e x t r a n o d a l n a t u r a l k i l l e r/T c e l ll y m p h o m a:a r e t r o s p e c t i v e s t u d y[J].I n t JH e m a t o l,2015,102(2):181-187.[24] L i J W,L i Y J,Z h o n g M Z,e ta l.E f f i c a c y a n dt o l e r a n c eo fG E L O X D/P-G E MO X D i n n e w l y d i a g n o s e d n a s a l-t y p ee x t r a n o d a lN K/T-c e l l l y m p h o m a:A m u l t i c e n t e r r e t r o s p e c t i v es t u d y[J].E u r JH a e m a t o l,2018,100(3):247-256.[25] L i a n g J,S h iP,G u o X,e ta l.Ar e t r o s p e c t i v ec o m p a r i s o no fE s c h e r i c h i a c o l i a n d p o l y e t h y l e n e g l y c o l-c o n j u g a t e da s p a r a g i n a s e f o r t h e t r e a t m e n t o f a d o l e s c e n t s a n d a d u l t sw i t hn e w l y d i a g n o s e d a c u t el y m p h o b l a s t i cl e u k e m i a[J].O n c o lL e t t,2018,15(1):75-82.[26] P l a c eA E,S t e v e n s o n K E,V r o o m a n L M,e ta l.I n t r a v e n o u sp e g y l a t e d a s p a r a g i n a s e v e r s u s i n t r a m u s c u l a r n a t i v eE s c h e r i c h i a c o l i L-a s p a r a g i n a s e i nn e w l y d i a g n o s e dc h i l d h o o da c u t e l y m p h ob l a s t ic l e u k a e m i a(D F C I05-001):a r a nd o m i se d,o p e n-l a b e l p h a s e3t r i a l[J].L a n c e t O n c o l,2015,16(16): 1677-1690.[27] L e e B J,D o h J,C h a n A,e t a l.I n c r e a s e d i n c i d e n c e o fP e g a s p a r g a s e-i n d u c e d h y p e r t r i g l y c e r i d e m i a a n d a s s o c i a t e dp a n c r e a t i t i s o b s e r v e d i n t h eH i s p a n i c a d u l t p a t i e n t p o p u l a t i o n[J].L e u kL y m p h o m a,2022,63(12):2992-2995.[28] R a j aR A,S c h m i e g e l o w K,A l b e r t s e nB K,e t a l.A s p a r a g i n a s e-a s s o c i a t e d p a n c r e a t i t i si nc h i l d r e n w i t ha c u t el y m p h ob l a s t i cl e u k a e m i ai n t h e N O P H O A L L2008p r o t o c o l[J].B r JH a e m a t o l,2014,165(1):126-133.[29]李非,曹锋.中国急性胰腺炎诊治指南(2021)[J].中国实用外科杂志,2021,41(7):739-746.[30] G e o r g e C,R a h m a n M,M o n a g l e P.C h a l l e n g e s a n do p p o r t u n i t i e si n t h e p h a r m a c o l o g i c a l t r e a t m e n t o f a c u t ev e n o u st h r o m b o e m b o l i s m i nc h i l d r e n[J].P a e d i a t r D r u g s, 2020,22(4):385-397.[31] M e u n i e r L,L a r r e y D.C h e m o t h e r a p y-a s s o c i a t e ds t e a t o h e p a t i t i s[J].A n nH e p a t o l,2020,19(6):597-601.(本文编辑:杜媛鲲)㊃352㊃郑雅心等‘培门冬酶在成年人急性淋巴细胞白血病及结外N K/T细胞淋巴瘤中应用的中国专家共识(2022年版)“解读。
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重组天冬酰胺酶II研究进展摘要L-天冬酰胺酶Ⅱ因能够水解L-天冬酰胺而具有抗肿瘤活性，在急性淋巴母细胞白血病的治疗方面应用甚广。
目前，利用重组DNA技术产生的重组菌表达产生的L-天冬酰胺酶Ⅱ是临床应用的一个重要来源，本文主要对这类重组菌的构建、表达研究及后续产物的分离纯化进行综述。
关键词L-天冬酰胺酶Ⅱ；大肠杆菌；基因工程；分离纯化Ⅰ引言L-天冬酰胺酶（Asparaginase，门冬酰胺酶或天冬酰胺酶；EC3.5.1.1）用于急性淋巴母细胞性白血病的治疗已有30年了[1]。
L-天冬酰胺酶可催化L-天冬酰胺（L-Asn）水解成L-天冬氨酸（L-Asp）和氨（NH3），此外它还能催化L-谷氨酰胺发生类似反应[2]。
由于某些肿瘤细胞缺乏L-天门冬酰胺合成酶（正常人体细胞含有该酶），而细胞存活需要外源天冬酰胺的补充，L-天冬酰胺酶对天冬酰胺的降解作用恰好切断了门冬酰胺的血源性供给，肿瘤细胞由于缺乏该氨基酸不能进行蛋白质合成而死亡[1,3]。
目前，L-天冬酰胺酶分为I型和II型，尤其是II型，因其具有肿瘤抑制活性而被广泛研究[2]（下文如无特别说明，天冬酰胺酶即指L-天冬酰胺酶II）。
天冬酰胺酶的谷氨酰胺水解活性给其临床应用带来了严重的副反应，因此筛选低谷氨酰胺酶活性的天冬酰胺酶是研究重点之一[2]。
本文主要就L-天冬酰胺酶II的表达与制备进展进行综述。
Ⅱ工程菌的构建，发酵和分离纯化研究1961年豚鼠血清中的抗肿瘤因子被证实为L-天冬酰胺酶[4]，随后科学家们又在大肠杆菌中发现了具有抗肿瘤活性的天冬酰胺酶，之后该酶又陆续在产气杆菌，芽孢杆菌，欧文氏菌，变形杆菌，链霉菌，曲霉，酵母等等微生物中被发现[5]。
目前，临床使用的L-天冬酰胺酶主要从大肠杆菌，菊欧文菌和胡萝卜软腐欧文菌菌株中分离得到，这些来源的天冬酰胺酶其肿瘤抑制作用机制相同，差别主要在于药代动力学性质[1]。
尽管有很多菌株能产生天冬酰胺酶，国内外也已经构建了多株天冬氨酸酶高效表达的基因工程菌[6]，但是其中以大肠杆菌的研究最为充分[7]，接下来本文主要围绕表达天冬酰胺酶的大肠杆菌的研究进行展开。
1．表达菌株的构建1995年，为了填补国内空白，刘景晶[8,9,10]等率先进行工程菌E.coli天冬酰胺酶ansB 基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了天冬酰胺酶高效表达的基因工程菌pKA/CPU210009；随后他们又在中试过程中优化了工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组天冬酰胺酶的提纯路线，并进行了产品鉴定。
以上研究结果表明，工程菌发酵单位比野生菌高出100倍以上[9]，产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质物理化学性质等方面均一致，两者具有同质性[8]。
下面，以此为例，简单叙述工程菌的构建及筛选过程[9]：首先从CPU210009菌株中提取DNA，并用PCR法扩增AnsB基因；随后将PCR扩增得到的AnsB基因DNA用Ncol和HindⅢ消化后，定向插入pKK233-2的多克隆位点而得到重组质粒；用重组质粒转化多个宿主菌，并用奈氏试剂筛选相应的阳性转化子CTA1～5，其中以CPU210009作为宿主菌的转化子（CTA5）的产酶能力显著高于其他转化子。
在宿主菌很多的情况下，如何快速准确的筛选阳性转化子对于提高实验效率很重要，本实验中采用的奈氏试剂即奈斯勒试剂显色法，此法快速、简单，可直接从培养培养皿中筛选出产天冬酰胺酶的菌株，并且可借助比色法进行定量测定，从而直接筛选出高表达菌株[11]。
其他工程菌的构建方法基本类似，主要差异在于天冬酰胺酶基因来源和表达载体的选择上。
如Priscila Lamb Wink[1]和Gustavo Roth[2]等将胡萝卜软腐欧文(氏)菌中的天冬酰胺酶基因和pET30a(+)表达载体构建成重组体，并用于转化多株大肠杆菌，结果表明[2]所有测试菌株的天冬酰胺酶表达的最适温度为37℃，此研究对于生物反应器的放大实验过程及天冬酰胺酶的大量生产有重要意义。
再如，张志红[6]等通过PCR反应扩增大肠杆菌JM109天冬酰胺酶基因(ansB)，将扩增片段与pMD18-T载体连接，构建成的重组质粒pMD18-T-asp再与与质粒pET-22b进行双酶切后，进行连接重组，之后转化感受态细胞，筛选重组表达载体pET-22b-asp。
利用重组表达载体pET-22b-asp转化BL21(DE3)大肠杆菌，并对其发酵条件以及分离、纯化工艺进行了初步研究，结果表明工程菌成功进行了天冬酰胺酶的胞外表达并大大简化了后续分离步骤。
另外，科研人员还进行了一些特殊的产天冬酰胺酶工程菌的构建，如抗胰蛋白酶的天冬酰胺酶的研究表明，通过采用多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体稳定天冬酰胺酶，利用抗体有效抑制蛋白酶对天冬酰胺酶的水解作用，使其在体内稳定性大大提高，这种以抗体稳定的天冬酰胺酶可以通过融合表达实现[12]。
2．发酵条件的研究由于研究菌株的不同，其发酵条件必然存在差异，故针对发酵条件的研究进展主要从多个方面分别举例对比说明。
潘红春[13,14]等在对大肠杆菌天冬酰胺酶的研究过程中，发现pH对酶的产生有较大影响，尤其是低pH会强烈抑制酶的合成。
之后他们[4]又以E.coli1.1096为菌株，添加无机盐的LB 培养基作为摇瓶培养基，细致地研究了摇瓶发酵过程中pH因素对天冬酰胺酶产生的影响，结果表明培养基组成、缓冲体系及碳源种类均会影响pH，从而影响酶的合成；他们还发现，控制发酵过程的适宜pH与通纯氧维持发酵过程的较高溶氧相结合，可明显防止菌体的过早自溶，延长菌体产酶期，大大促进天冬酰胺酶的合成。
除了pH对产酶量有影响之外，其他的影响因素还有很多，如氮源，接种量，通气量，发酵时间，搅拌器转速，摇床转数，发酵罐的高往比等等[7,15]。
上述因素对不同发酵菌株的影响是多样化的。
如陈丽媛[7]等以E.Coli A.S1.588为发酵用菌株，研究确定的最佳发酵培养基（%）：玉米浆10，牛肉膏l，NaC1 l，pH 6.5-7.0；并确定了最佳发酵工艺参数：接菌量1.5～2.0%，pH6.5～7.0，转数220rpm/min，温度37℃等。
而杭长标[15]等以常州生化千红制药有限公司产品开发部提供的大肠杆菌为发酵菌株，研究认为增加罐体高径比值，提高搅拌速度，提高发酵通气量及适当的初始pH值是提高天冬酰胺酶发酵的有效途径。
其他多数研究发酵影响因素的文章，也多是从这些方面进行阐述，所用菌种亦是多种多样。
从这些例子中我们能看出这些研究的局限性在于：研究结果只适用于特定菌株，有些仅从理论上加以阐述，缺乏具体可行的发酵方案，处于比较肤浅的水平。
总的说来，我认为，目前对产天冬酰胺酶的大肠杆菌的研究比较局限，多在一个或少数几个菌株中进行发酵条件的研究，没有对多个有研究意义的菌株进行横向对比，缺乏普适的参考价值；如果能够对多个菌株进行同等条件下的横向发酵研究，从众多研究数据中总结出具有参考意义的参数，这才是最重要的。
3．天冬酰胺酶的分离纯化天冬酰胺酶合成后主要分泌到周质[8,16]，当然张志红[6]等也成功构建了进行胞外表达天冬酰胺酶的工程菌。
对于分泌到周质的天冬酰胺酶，常用提取方法有冷丙酮干燥破壁（制成丙酮粉）、蔗糖溶液提取法和反复冻融法、超声破壁法[16]等。
如刘红[17]等采用冷丙酮破壁处理，经稀碱液抽提、羧甲基纤维素离子交换层析和Sepharose亲和层析进行纯化，最后可使L-天冬酰胺酶的纯度达94.4%，比活为520U/mg蛋白，总收率为65.7%。
陈建华[8]等在刘景晶等研究的基础上，经蔗糖破壁、(NH4)2S04分级沉淀、透析、DEAE-DE52、Q Sepharose Fast Flow等步骤纯化得到的天冬酰胺酶比活力高达382.9U/mg，SDS-PAGE检测时显示为一条带，RT-HPLC分析纯度达到99%，最终回收率为50.5%，适合大规模的工业化生产的要求。
传统的提取天冬酰胺酶的方法包括制备丙酮粉和缓冲液萃取，这种方法要使用大量丙酮，产生细胞碎片，释放胞内的许多内容物，给后续纯化步骤带来困难[18,19]。
鉴于此，赵凤生[20]等用非离子表面活性剂TritonX-100和磷酸盐结合使用释放大肠杆菌中的天冬酰胺酶，含2%TritonX-100和13%K2HPO4的水溶液可以从E.coli ATCC11303细胞中释放70%的天冬酰胺酶；这之前和之后他还进行了多次双水相系统[18,19]释放天冬酰胺酶的研究，包括聚乙二醇-葡聚糖系统，聚乙二醇-磷酸盐系统等，这使得酶的释放和酶的纯化耦合在一个步骤完成，简化了程序，提高了效率。
其他学者也构建了类似的双水相系统并用于其他胞内酶或周质酶的释放，并取得了相关成果[19]。
对于分泌到胞外的天冬酰胺酶，其分离纯化相比于前者相对简单，如张志红[6]等试验表明，重组酶只须镍琼脂糖凝胶亲和层析一步纯化，而周质空间表达纯化工艺要经过破壁、离心、盐析、有机溶剂沉淀、层析等多个步骤，因此胞外表达大大简化了下游分离步骤。
Khushoo[21]等采用融合技术也实现了酶的胞外表达，即将天冬酰胺酶基因与高效先导序列pelB融合使得酶在细胞外表达，并在酶的N末端添加了6个组氨酸序列标签，然后采用Ni-NTA 亲和层析法分离纯化得到天冬酰胺酶，最终回收率达到86%，每升发酵液中可以获得95mg酶。
尽管此法效率高，但是这种方法成本高，并不适合大规模的工业化生产[8]。
分离纯化之后还需对制得的天冬酰胺酶进行酶活力测定和相关鉴定，为进一步研究提供帮助。
韩俊[22]等采用流动注射方式，电喷雾离子化质谱法测定分子量；三氯乙酸变性，胰蛋白酶水解后，HPLC测定肽图谱；结合质谱源内碰撞诱导解离技术，解析酶解肽段的氨基酸顺序,从而实现了对酶一级结构的分析和鉴定。
酶活测定方面，常采用Nesseler试剂法[9,17]。
总的说来，目前天冬酰胺酶在大肠杆菌中的表达方式还以周质表达为主，胞外表达处于重点研究阶段，对于存在于周质的天冬酰胺酶，我认为双水相系统的应用前景很广泛，不仅因为它可以将酶的释放和纯化进行耦合从而简化程序，提高效率，还在于双水相提取条件温和，并有利于后续酶的纯化[19]。
Ⅲ问题及展望自L-天冬酰胺酶Ⅱ应用于临床以来，白血病患者，特别是急性淋巴母细胞性白血病患者的长期无病生存率得到了明显的提高[8]，L-天冬酰胺酶Ⅱ的抗癌机制还应用在了其他一些肿瘤癌症的治疗，相关研究已取得了一定的成果[12]。
同时，在L-天冬酰胺酶Ⅱ结构与功能上的研究也取得了很大的进展，但是目前仍然存在不少未能解决的问题，特别是L-天冬酰胺酶Ⅱ在临床应用过程中发生的不良反应是最值得关注的问题，如进行性免疫反应、全身性过敏反应、急性胰腺炎、高血压及血液系统异常等[8]。