猪繁殖与呼吸综合征病毒nadc30-like毒株的分离鉴定
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某养殖场提取PRRSV阳性病料，成功分离出1株 NADC30-like毒株，测定了该毒株的体外生长曲线， 并进一步对其ORF5基因和部分Nsp2序列进行了 遗传变异分析。
收稿日期：2019-03-04 基金项目：河南省农业科学院科研发展专项资金项目(2019CY01)；河南省生猪产业技术体系基金项目(S2012-06)
咳喘，病死率达15%左右。取发病猪的肺组织送河 南省农业科学院动物免疫学重点实验室进行疫病诊
断。 1.1.2 细胞原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveo lar macrophages,PAM)、Marc-145 细胞、PRRSV N 蛋白单抗由河南省农业科学院动物免疫学重点实验 室提供。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；分离鉴定；遗传进化分析
中图分类号：S852.659.6
文献标识码：A
文章编号:1007-5038(2020)03-0036-04
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合 征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染引起的猪传染病，主要造成妊娠母 猪流产、死胎.保育育肥猪的呼吸道疾病⑴。2006年， 我国江西省率先暴发了高致病性PRRSV(Highly pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)，并迅速蔓延到我国 的各个地区，临床以高发病率和高致死率为特征 ，对 我国养猪业造成了巨大经济损失⑷。2013年以来，美 国NADC30毒株传入我国，并与我国流行PRRSV毒 株发生了广泛的重组，衍生出许多NADC30-like毒 株,在我国20多个省份地区广泛传播.给我国PRRS 防控带来新的难题®勺。
摘要：对河南潔河地区某养殖场检出的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性病料进行处理，接种 到原代猪肺泡巨噬细胞中，经细胞盲传成功分离出1株PRRSV毒株，命名为HeNLH2017株，并测定了该 分离株在原代猪肺泡巨噬细胞上的生长曲线。为进一步分析该分离株的遗传进化特点，扩增测定了 ORF5 基因和部分Nsp2基因的核酸序列。核酸同源性分析显示，该分离毒株ORF5基因和Nsp2序列与NADC30 毒株同源性最高，分别为93.4%和93.8%。遗传进化树分析显示，该分离株与我国2013年以来流行的 NADC30-like(Lineagel)毒株处于同一进化分支。氨基酸序列比对分析显示,ORF5基因和Nsp2序列与 NADC30-like毒株具有相似的遗传变异特点，且Nsp2序列存在特征性的131个不连续的氨基酸缺失。成 功分离到1株NADC30-like毒株.有助于进一步认识NADC30-like毒株在河南地区的流行情况和临床致病 特点。
动物医学进展.2020,41(3):36-40 Progress in Veterinary Medicine
Байду номын сангаас
猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株的分离鉴定
阮海宇仏，郭振华2△，李 翔3,乔松林2,张改平2*
(1.河南农业大学牧医工程学院•河南郑州450002；2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002； 3.云南农业大学动物医学院，云南昆明650200)
猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病 毒，属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。基因组大小 约为15.4 kb,不分节段，含有至少11个开放阅读框 (ORF)。PRRSV的相邻ORF间有重叠现象， ORF1编码与病毒复制相关酶的基因，是基因组中 最大的一段，占全长的80%,包括ORFla和 ORFlb.分别编码ppla和pplab两种多聚蛋白， ppla经加工后可分解为9个非结构蛋白，分别为
1.1.3 主要试剂与仪器 Trizol为Invitrogen公司 产品；DMEM培养基.RPMI 1640培养基、胎牛血清 均为Solarbio公司产品；病毒核酸提取试剂盒为 Takara公司产品；胶回收试剂盒为美国Omega公 司产品；Q5超保真聚合酶为美国NEB公司产品； pEASY- Blunt平末端连接载体、TransTl感受态细 胞为北京全式金公司产品；Cy3标记羊抗鼠二抗为 Abbkine 公司产品。梯度 PCR 仪(Mastercycler)为 Eppendorf公司产品；核酸电泳仪(JY600C)为北京 六一公司产品；凝胶自动成像系统(GENE GENIUS)为GEN公司产品；高速冷冻离心机(3K-18)为
作者简介：阮海宇(1997-),男•河南信人.硕士研究生，主要从事诸病毒病诊斷技术及病原分子沆行病学研究。 △同等贡献作者。*通讯作者
阮海宇等：猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株的分离鉴定
37
1材料与方法
1.1材料 1.1.1病料来源2017年，河南潔河某猪场保育猪 群疑似发生PRRS疫情，发病猪群在14日龄左右免 疫了某厂家的TJM-F92弱毒疫苗，45日龄左右陆 续出现食欲减退，被毛粗糙，精神沉郁，扎堆.发烧，
Nspla、Nspl|3 以及 Nsp2 至 Nsp8 , pplab 可分解为 Nsp9到Nspl2⑷。根据其遗传背景的不同可以将 PRRSV分成美洲型和欧洲型2个基因型⑺。目前 在我国流行的主要为美洲型。
PRRSV复制过程中基因组具有很高的变异率， 其中ORF5基因最容易产生变异，其编码的糖基化 囊膜蛋白GP5能够诱导机体产生特异性中和抗体， 常用于研究PRRSV遗传变异情况™ ； Nsp2基因位 于ORFla区域，是PRRSV基因组中变异最大的部 分⑷，在不同毒株之间差异比较大，当前至少存在 22种以上的氨基酸插入和缺失模式，如在HPPRRSV中存在约30个氨基酸的缺失，在NADC30like毒株中存在131个不连续的氨基酸缺失，这是 NADC30-like区别于其他毒株的重要标识之 -[1°o近年来PRRSV疫苗仍然以HP-PRRSV 毒株为亲本的弱毒苗为主，其无法针对NADC30like毒株提供有效保护本研究从河南潔河地区
收稿日期：2019-03-04 基金项目：河南省农业科学院科研发展专项资金项目(2019CY01)；河南省生猪产业技术体系基金项目(S2012-06)
咳喘，病死率达15%左右。取发病猪的肺组织送河 南省农业科学院动物免疫学重点实验室进行疫病诊
断。 1.1.2 细胞原代猪肺泡巨噬细胞(porcine alveo lar macrophages,PAM)、Marc-145 细胞、PRRSV N 蛋白单抗由河南省农业科学院动物免疫学重点实验 室提供。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；分离鉴定；遗传进化分析
中图分类号：S852.659.6
文献标识码：A
文章编号:1007-5038(2020)03-0036-04
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合 征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染引起的猪传染病，主要造成妊娠母 猪流产、死胎.保育育肥猪的呼吸道疾病⑴。2006年， 我国江西省率先暴发了高致病性PRRSV(Highly pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)，并迅速蔓延到我国 的各个地区，临床以高发病率和高致死率为特征 ，对 我国养猪业造成了巨大经济损失⑷。2013年以来，美 国NADC30毒株传入我国，并与我国流行PRRSV毒 株发生了广泛的重组，衍生出许多NADC30-like毒 株,在我国20多个省份地区广泛传播.给我国PRRS 防控带来新的难题®勺。
摘要：对河南潔河地区某养殖场检出的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性病料进行处理，接种 到原代猪肺泡巨噬细胞中，经细胞盲传成功分离出1株PRRSV毒株，命名为HeNLH2017株，并测定了该 分离株在原代猪肺泡巨噬细胞上的生长曲线。为进一步分析该分离株的遗传进化特点，扩增测定了 ORF5 基因和部分Nsp2基因的核酸序列。核酸同源性分析显示，该分离毒株ORF5基因和Nsp2序列与NADC30 毒株同源性最高，分别为93.4%和93.8%。遗传进化树分析显示，该分离株与我国2013年以来流行的 NADC30-like(Lineagel)毒株处于同一进化分支。氨基酸序列比对分析显示,ORF5基因和Nsp2序列与 NADC30-like毒株具有相似的遗传变异特点，且Nsp2序列存在特征性的131个不连续的氨基酸缺失。成 功分离到1株NADC30-like毒株.有助于进一步认识NADC30-like毒株在河南地区的流行情况和临床致病 特点。
动物医学进展.2020,41(3):36-40 Progress in Veterinary Medicine
Байду номын сангаас
猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株的分离鉴定
阮海宇仏，郭振华2△，李 翔3,乔松林2,张改平2*
(1.河南农业大学牧医工程学院•河南郑州450002；2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002； 3.云南农业大学动物医学院，云南昆明650200)
猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病 毒，属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。基因组大小 约为15.4 kb,不分节段，含有至少11个开放阅读框 (ORF)。PRRSV的相邻ORF间有重叠现象， ORF1编码与病毒复制相关酶的基因，是基因组中 最大的一段，占全长的80%,包括ORFla和 ORFlb.分别编码ppla和pplab两种多聚蛋白， ppla经加工后可分解为9个非结构蛋白，分别为
1.1.3 主要试剂与仪器 Trizol为Invitrogen公司 产品；DMEM培养基.RPMI 1640培养基、胎牛血清 均为Solarbio公司产品；病毒核酸提取试剂盒为 Takara公司产品；胶回收试剂盒为美国Omega公 司产品；Q5超保真聚合酶为美国NEB公司产品； pEASY- Blunt平末端连接载体、TransTl感受态细 胞为北京全式金公司产品；Cy3标记羊抗鼠二抗为 Abbkine 公司产品。梯度 PCR 仪(Mastercycler)为 Eppendorf公司产品；核酸电泳仪(JY600C)为北京 六一公司产品；凝胶自动成像系统(GENE GENIUS)为GEN公司产品；高速冷冻离心机(3K-18)为
作者简介：阮海宇(1997-),男•河南信人.硕士研究生，主要从事诸病毒病诊斷技术及病原分子沆行病学研究。 △同等贡献作者。*通讯作者
阮海宇等：猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株的分离鉴定
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1材料与方法
1.1材料 1.1.1病料来源2017年，河南潔河某猪场保育猪 群疑似发生PRRS疫情，发病猪群在14日龄左右免 疫了某厂家的TJM-F92弱毒疫苗，45日龄左右陆 续出现食欲减退，被毛粗糙，精神沉郁，扎堆.发烧，
Nspla、Nspl|3 以及 Nsp2 至 Nsp8 , pplab 可分解为 Nsp9到Nspl2⑷。根据其遗传背景的不同可以将 PRRSV分成美洲型和欧洲型2个基因型⑺。目前 在我国流行的主要为美洲型。
PRRSV复制过程中基因组具有很高的变异率， 其中ORF5基因最容易产生变异，其编码的糖基化 囊膜蛋白GP5能够诱导机体产生特异性中和抗体， 常用于研究PRRSV遗传变异情况™ ； Nsp2基因位 于ORFla区域，是PRRSV基因组中变异最大的部 分⑷，在不同毒株之间差异比较大，当前至少存在 22种以上的氨基酸插入和缺失模式，如在HPPRRSV中存在约30个氨基酸的缺失，在NADC30like毒株中存在131个不连续的氨基酸缺失，这是 NADC30-like区别于其他毒株的重要标识之 -[1°o近年来PRRSV疫苗仍然以HP-PRRSV 毒株为亲本的弱毒苗为主，其无法针对NADC30like毒株提供有效保护本研究从河南潔河地区