第九章高效液相色谱法

A、对泵的要求：
输出压力高 流量范围大 流量恒定 无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右 耐腐蚀，密封性好。
B、分类：
高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流 泵两大类。
恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相 粘度和柱渗透无关。
恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力 变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵 就能提供恒定的流量。
容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。
5. 液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复 杂，价格昂贵。
三、高效液相色谱法的特点和应用 1. 特点
高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析 速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。
2. 应用
目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业 等科学领域获得广泛的应用。
一、高压输液系统
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度 洗脱装置和压力表 等组成。
1. 溶剂贮存器
溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成， 容量为1到2 ，用来贮存足够数量、符合要求的流 动相。
2. 高压输液泵
高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之 一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形 式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中 完成分离过程。由于液相色谱仪所用色谱柱径较 细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻 力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就 需要高压泵注入流动相。
1. 应用范围不同
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的 物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定 化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为 困难。致使其应用受到一定程度的限制，只有大约 20%的有机物能用气相色谱分析；
液相色谱不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非 常适合分子量较大、高沸点、热稳定性差的有机化 合物；离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占 有机物的70 ~ 80%。
另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两 种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程 序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。
梯度洗脱的实质
通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品 中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通 过色谱柱。
在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程 序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的 变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实 现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
2. 全多孔型固定相
由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固 定相由于颗粒很细（5~10m），孔仍然较浅，传 质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合 物分离及痕量分析。
第三节 高效液相色谱的固定相和流动相
一、固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚 性固体和硬胶两大类。
刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108~1.0109Pa的 高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧 化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，是目前最广泛 使用的固定相。
第二节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪由
高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统 等五大部分组成。
分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵， 冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用 微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带 入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测 器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集 器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分 浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下 来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱 效高低的依据。
3. 梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上 不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比 例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度 相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的 目的。
梯度洗脱装置分为两类：
一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相 在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅 需一台泵即可。
二、进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的 作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
三、分离系统
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2 ~ 6mm，柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充 满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。
硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与 二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定 相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相。
1. 表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖 一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换 剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚 度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦 高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗 时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多 孔层厚度薄，最大允许量受到限制。
四、检测器
1. 对检测器的要求
灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温 度和流量的变化不敏感等。
2. 检测器类型
一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学 特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测 器等
一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质 响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。
液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色 谱分离条件的选择。
3. 传质速率不同 由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，
溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特 别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽 略不计。
4. 液相色谱中制备样品简单 液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较
2.液相色谱能完成难度较高的分离工作
气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过 程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作 用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子， 为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种 或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。
液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等， 作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。