米曲霉的蛋白酶活力测定

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米曲霉的蛋白酶活力测定:
紫外分光光度法:
0.4mol/L三氯醋酸溶液:称取三氯醋酸65.4g,定容至1000ml。

pH7.2磷酸缓冲溶液:称取磷酸二氢钠31.2g,定容至1000ml,成0.2mol/L溶液(A 液)
称取磷酸氢二钠71.63g,定容至1000ml,成0.2mol/L溶液(B液)。

取A液28ml和B 液7.2ml,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol/LpH7.2的磷酸缓冲溶液。

2%酪蛋白溶液:称取酪蛋白2g,加入0.1mol/L氢氧化钠20ml,在水浴中加热溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸缓冲液定容至1000ml即成。

配置后应及时使用或放冰箱保存。

蛋白酶活力测定:取试管两只,编号1,2,3,每只试管加入样品稀释液1ml,置于40度水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白5ml,精确保温10min。

时间到后,各管立即加入0.4mol/L三氯醋酸5ml,以终止反应。

继续水浴中保温20min,使残余蛋白质沉淀后离心分离或过滤。

取滤液用751分光光度计在275nm处测定其吸收度。

空白实验也是取试管3支,编号,测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L 三氯醋酸5ml,使酶失活,在加酪蛋白。

为了清楚起见,参看下表:
计算:在40度下每1min水解酪蛋白产生1Ug酪氨酸,定义为一个蛋白酶活力单位。

蛋白酶活力单位=A/10×11×N。

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