真菌对临床抗真菌药物的耐药机制

真菌对临床抗真菌药物的耐药机制
崔宇慧;唐建国
【摘要】真菌感染,尤其是深部真菌感染的发病率近年来呈上升趋势,抗真菌药物的大量使用引起了真菌耐药曰益严重,严重影响了抗真菌药物治疗的效果,也增加了危重患者的病死率,因此对真菌耐药机制的研究十分必要.本文依据常用抗真菌药物的药物种类,分别总结论述了近年来真菌耐药机制研究的新进展.%In recent years, the morbidity of fungal infections especially invasive fungal infections increase continuously, as a result, plenty use of antifungal agents induce the worse condition of antifungal drug resistance, the effect of antifungal drug therapy is badly damaged, and the mortality of the severe patients is also increased. So it is necessary to discuss the mechanisms of drug resistance. In this review, the new progresses of researches in antifungal drug resistance will be related according to the drug classes respectively.【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2011(036)010
【总页数】5页(P733-737)
【关键词】真菌;耐药机制;抗真菌药物
【作者】崔宇慧;唐建国
【作者单位】复旦大学附属上海市第五人民医院重症医学科,上海200240;复旦大学附属上海市第五人民医院重症医学科,上海200240
【正文语种】中文
【中图分类】R379
近20年来，随着艾滋病、肿瘤、糖尿病、血液病和老年疾病等发病率的不断上升，以及器官和骨髓移植技术、导管技术等检查治疗手段的开展，真菌感染尤其是深部真菌感染日益增多。

同时，真菌的耐药现象越来越普遍，除了最常见的白念珠菌、烟曲霉、热带念珠菌和新生隐球菌，对现有抗真菌药物敏感性极低的某些真菌，如镰孢属、赛多孢属、接合菌也从只有极少数病例报告到逐渐成为血液恶性肿瘤中有较高风险的机会性致病真菌[1]。

在一项2007年6月至2009年2月1060例深部真菌感染流行病学调查显示，研究人员在1060份标本中共分离出135株深部真菌，药敏试验显示135株真菌对两性霉素B敏感性为94.8%，制霉菌素为95.6%，氟胞嘧啶为85.9%，伊曲康唑和氟康唑相对较低，分别为77.8%和66.7%，值得
注意的是135株真菌对氟康唑的耐药性高达31.1%[2]。

另外，近年来双相型真菌感染的耐药报道逐渐增多，双相型真菌是指菌体形态随温度改变而发生变化的真菌，主要包括申克孢子丝菌、马内菲青霉、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌及皮炎芽生菌，这些真菌对抗真菌药物非常敏感，较少出现耐药现象，但是近年由于本类感染治疗期长，氟康唑的广泛应用及自身免疫性缺陷疾病患者增多等原因，耐药性也逐年增强[3]。

真菌对抗真菌药物耐药性已成为临床真菌治疗失败的
主要原因。

目前主要的抗真菌药物包括以下几类：作用于细胞壁的1,3-β-D-葡聚糖合成酶抑
制剂，以棘白菌素类和pneumocandin类为主要代表；嘧啶类抗真菌药物，主要的药物是5-氟胞嘧啶；多烯类抗真菌药，包括两性霉素B、制霉菌素、那他菌素等，其中两性霉素B是主要的一线抗真菌药物；唑类抗真菌药物，分为咪唑和三
唑，咪唑包括：咪康唑、酮康唑等，三唑包括：氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等。

以下将分别叙述真菌对这些药物耐药的机制：
1 真菌的耐药机制
1.1 棘白菌素类药物的耐药机制
棘白菌素是唯一通过非竞争抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶来作用于真菌细胞壁的抗
真菌药物，通过抑制细胞壁1,3-β-D-葡聚糖合成而发挥抗真菌作用。

已有从卡泊
芬净治疗失败的念珠菌患者体内分离出对卡泊芬净MIC升高的白念珠菌的报道[4]。

在白念珠菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克氏酵母菌感染的患者中有关于棘白菌素耐药的报道[4-8]。

β-葡聚糖合成酶的编码基因为CaFks1，CaFks1等位
基因之一的保守区发生突变与棘白菌素类药物敏感性降低明显相关[9]。

涉及的编
码β-葡聚糖合成酶复合物亚基的基因改变至少通过Fksp(催化亚基)亚基形成。

Fksp是棘白菌素的靶点，并且是酶复合物的主要亚基[10]。

在临床菌株中对棘白
菌素的耐药主要与Fksp的两个热点区域的氨基酸替换有关。

在白念珠菌中，热点
1的区域包括Phe641到Pro648之间的氨基酸序列，热点2的区域包括
Asp1357到Leu1364之间的部分[9,11]。

主要的Fks1改变把葡聚糖合成酶对药
物的敏感度降低了一千倍或更多，带有这些改变的菌株可能要求伴随的药物增加，以减低动物感染模型中真菌的器官负担。

Fks1介导的耐药机制在广泛变化的假丝
酵母菌中存在，并且能说明特定种属的固有敏感度减低[12]。

临床治疗失败和棘白菌素类药物MIC值升高之间存在一种不确定的关联。

真菌展现出多种适应性的生
理学机制，这些机制导致了MIC值的增高。

产生MIC值大幅度升高的基因层面的改变使所有的棘白菌素类药物的交叉耐药[12]。

尽管近平滑酵母菌的升高的MIC
值并没有表现出导致重要的临床失败，但是有学者认为这种菌株可能有像更高水平耐药发展的倾向[13-14]。

棘白菌素是多重药物外排转运体的弱作用物，Niimi等发现高度表达ABS和主要
易化家族转运体的白念珠菌和啤酒酵母菌种对棘白菌素的MIC值没有改变或只有
很弱的改变[15]。

与唑类密切相关的白念珠菌主动外排基因CDR1、CDR2及多药耐药基因MDR1基因在白念珠菌对棘白菌素敏感性降低中无明显作用[9]。

曲霉菌中，AfFKS1基因的断裂意味着对卡泊芬净低水平的耐药，但是，通过细胞壁的溶解而自发产生的对这类药物的耐药也与FKS基因无关[16]。

Rocha等描述
包含Fks1p中S678P氨基酸改变的一种曲霉菌实验室改变株对所有棘白菌素有交叉耐药[17]。

1.2 氟胞嘧啶的耐药机制
氟胞嘧啶通过真菌细胞的酶系统进入细胞内，转换为氟脲嘧啶，替代尿嘧啶进入真菌的脱氧核糖核酸中，阻断核酸的合成。

有许多真菌对该药固有性耐药或经治疗后出现获得性耐药。

单用5-FC抗真菌治疗过程中有10%～15%真菌可出现耐药。

真菌对氟胞嘧啶耐药主要原因有原发性耐药机制(胞嘧啶通透酶改变而减少摄取药物)和继发性耐药机制(真菌能阻止氟胞嘧啶代谢成毒性物质)。

单药治疗时，念珠
菌和新型隐球菌会快速获得对氟胞嘧啶的耐药性。

已知对氟胞嘧啶的耐药源自：(1)酶嘌呤-胞核嘧啶透酶(由FCy2基因编码)的改变，负责细胞摄取药物的摄入率；(2)胞核嘧啶脱氨酶(有FCy1基因编码)的改变，负责5-氟尿嘧啶的转变；(3)核酸核糖转移酶的改变，负责5-氟尿嘧啶向5-氟尿苷一磷酸盐的转换(由FUR1基因编码)。

大多数这些机制都特异性的与白念珠菌的耐药有关[18]。

其中，大多数的白念珠菌5-FC高度耐药株FUR1基因中，C301T突变发生在尿嘧啶核酸核糖转移酶的保守区域，在5-FC高度耐受株为纯合突变，在中度耐药株为杂合突变。

功能缺失或缺陷的尿嘧啶核酸核糖转移酶不能有效地把5-FC
转化成毒性的FUMP，故出现耐药。

胞嘧啶透酶，胞嘧啶脱氨酶功能缺陷或胸腺
酸酶活性改变也可能导致对5-FC的耐药[19]。

FCY1和FUR1基因对交叉耐药的贡献作用最近被解释。

葡萄牙假丝酵母中FCY1、
FCY2、FUR1这3个基因的激活产生了对氟胞嘧啶两种类型的耐药，FUR1的突
变体对5-氟脲嘧啶耐药，而FCY1和FCY2的突变体对氟康唑耐药[20]。

但是，已经发现葡萄牙假丝酵母菌FCY2基因的灭活导致氟胞嘧啶和氟康唑的交叉耐药[21]。

1.3 多烯类类的耐药机制
目前只分离到几种对多烯类固有性耐药的酵母菌，多数是较少见的菌种，如葡萄牙念珠菌、白吉利毛孢子菌[22](Trichosporon beigelii)、波氏假阿利什菌(Pseudallescheria boydii)。

两性霉素B经数十年临床应用，对其继发性耐药还比较罕见，而且局限于不太常见的念珠菌，如葡萄牙念珠菌、光滑念珠菌和季也蒙念珠菌。

以下假说解释了两性霉素的耐药性[23]：(1)穿过真菌细胞壁是两性霉素B
到达细胞膜的第一道屏障，可能耐药菌中这一通路发生改变；(2)细胞膜中脂类的
数量和质量发生变化，特别是麦角固醇含量减少，降低了两性霉素B与细胞膜结
合的机率；(3)真菌细胞对两性霉素B引起的氧化现象敏感性降低。

目前，人们对真菌对两性霉素B耐药的机制了解甚少，真菌细胞膜中麦角固醇含
量的减少或缺失已经被与耐药关联起来，但不影响感染细胞的能力。

这些缺陷可能是编码某些参与合成麦角固醇的酶的基因突变的结果。

已有报道称ERG3基因的
缺陷导致其他固醇而不是麦角固醇的累积。

在多烯类耐药的假丝酵母菌和隐球菌中，发现麦角固醇的含量比敏感株的低[18]。

Vandeputte等论述道CgERG6基因的
改变是平滑假丝酵母菌株多烯类敏感度不高的原因，也造成了假菌丝的生长，这些作者描述了CgERG6基因的改变可能是这两个表现型的原因[24]。

在高水平两性
霉素B耐药和平滑假丝酵母菌生物膜中ERG1、ERG25、SKN1和KRE1基因的调节之间可能的联系已经被发现[25]。

对氟康唑耐药的新生隐球菌进行固醇分析，结果显示耐药菌株可能存在ERG2或ERG3缺陷，这些菌株表现出对两性霉素B交
叉耐药[26]。

1.4 唑类药物耐药机制
通过抑制细胞色素P450依赖性的羊毛甾醇14-α-去甲基化酶，影响羊毛甾醇14-α-甲基的羟基化反应，从而造成麦角甾醇合成减少以及一些甾醇前体化合物的增多，导致细胞膜的结构和功能发生改变，产生抗真菌作用。

唑类抗真菌药的耐药主要由以下机制引起：
1.4.1 耐药菌细胞膜上外排泵基因的过度表达
该机制是最重要的对唑类药物的耐药机制之一。

负责药物外排转运的蛋白质通常被称为药物外排泵，包括ABC(ATP-binding cassette)超家族和异化扩散载体超家族。

白念珠菌中ABC超家族的耐药相关基因包括CDR1，CDR2，异化扩散载体
超家族的耐药基因包括MDR1等[27]。

秦晓峰等[28]通过采用实时定量PCR技术，检测临床分离的非配对白念珠菌氟康唑耐药株和敏感株CDR1、CDR2、MDR1基因的表达情况。

结果显示，两组白念珠菌CDR1、MDR1基因在mRNA表达水平上差异无统计学意义：CDR2基因在mRNA表达水平上存在差异，耐药株的表达量要高于敏感株。

表明多药耐药蛋白基因的高表达可能导致白念珠菌耐药性的形成，但并不是所有白念珠菌耐药株都会同时出现上述基因的高表达。

光滑假丝酵母菌对唑类的交叉耐药与CgCDR1、CgCDR2 [29]及最近发现的CgSNQ2[30]基因的表达增高有关。

众所周知PDR1编码多种药物转运体的转录调节子，在2006年有报道称CgPDR1在光滑假丝酵母菌临床菌株和小变异菌株(线粒体机能失调)对唑类
的耐药中发挥作用[31]；在啤酒酵母菌中观察到是PDR3而不是PDR1对获得性
高频耐药来说是关键。

Vandeputte等[32]论述在热带假丝酵母菌菌株中对唑类药物的耐药，该菌株是从用咪康唑治疗的患者身上取得的，这种耐药是由于
CtERG11基因的过度表达(错义突变或酪氨酸替换)。

只有热带假丝酵母菌MDR1 (CtMDR1)基因被与此类中唑类药物耐药联系起来。

1.4.2 唑类药物药物作用靶酶的变异
唑类药物作用的靶酶是由ERG11基因编码的14-α-去甲基酶，基因突变导致靶酶
对药物亲和力的降低、靶酶的过高表达均可导致真菌耐药。

ERGll基因突变和(或)基因表达增加均可导致靶酶对药物亲和力的下降，从而产生耐药。

首先，编码14-DM(羊毛甾醇14-α-去甲基化酶)的基因突变，引起该酶活性区氨基酸变化和酶三维结构发生改变，导致酶与唑类药物的亲和力及黏附度降低，使得真菌细胞内药物不能有效抑制C-14去甲基酶的催化活性而耐药；其次，编码14-DM的基因过度表达，则需要更高的细胞内药物浓度来抑制酶的活力，相当于减弱了药物的作用浓度，由此增加了耐药性。

对唑类耐药的白念珠菌菌株与敏感菌株进行ERG11基因的DNA测序，经比较可看出，在耐药菌中存在突变点(R467K)，是467位的精氨酸置换成赖氨酸。

进一步研究提示R467K突变可降低靶酶对氟康唑的亲和力而产生耐药性[33]。

在ERG11基因上存在另一个突变点T315A，将315位的苏氨酸置换成丙氨酸。

这种特殊的突变直接发生在酶的活性部位，即在血红素的辅助因子上。

周辉等[34]在2株唑类药物敏感的白念珠菌中，通过ERG11基因测序，未发现有义突变；6株耐唑类药物的白念珠菌中，ERG11基因存在E266D、Y257H、K259E、A114S、F487L突变，其中A114S、Y257H、K259E、F487L为新发现的突变位，认为白念珠菌对唑类药物耐药与ERG11基因的突变有关，通过ERG11基因突变，可引起ERG11P的蛋白结构发生改变，最终可导致唑类药物与
ERG11P亲和力下降而产生耐药。

1.4.3 生物被膜的形成
此种耐药机制的后果是使真菌对多种唑类药物呈现高度耐药性，敏感性下降几十倍甚至几百倍。

Mukherjee等[35]提取了生物被膜内细胞的总RNA，使用Northern blot检测cdr1、cdr2和mdr1的转录水平，发现cdr1和cdr2有持续高表达，mdr1有一过性的表达；同时对cdr1/cdr2/mdr1三联缺失突变株形成的生物被膜进行药敏试验，发现其在生物被膜形成的早期对药物的敏感性与野生株有明显差异；而在生物被膜形成的中、晚期时，两者无明显差异。

作者在实验中也观
察到，生物膜与浮游白念珠菌的麦角固醇水平在6h时相同，在生物膜的成熟期却减少了50%，而浮游细胞只在6～12h减少了18%，其他固醇水平在两者之间也
有明显差异。

这些结果表明生物膜固醇结合物在与唑类相关的生物膜耐药性的中晚期起重要作用。

Khot等[25]也发现白念珠菌在形成生物被膜时erg1和erg25等
高表达。

因此，甾醇的代谢异常可能是白念珠菌形成生物被膜后对多种抗真菌药物高度耐药的主要机制。

据报道PMT4基因对于新生隐球菌生物膜的耐药特性是至关重要的，其缺失可导
致新生隐球菌生物膜耐药性几乎完全丧失。

由于真菌的PMT4基因与哺乳动物的
类似基因差异很大，因此PMT4基因及其编码的酶有可能成为新的抗真菌药物的
作用靶点[36]。

2 结语
有研究显示真菌获得的耐药性可稳定遗传，而通过敏感菌株体外诱导产生的耐药子代菌株在无氟康唑存在情况下培养一段时间后，对氟康唑重新恢复一定程度敏感性，但没有回复到起始敏感值。

无论由于何种机制，菌株获得耐药性的稳定性限制了临床对耐药株出现后的治疗策略，即一定间歇后再使用同类药物可能不能达到治疗效果[37]。

这给临床治疗真菌感染带来了更大的困难，有研究表明[38]，胺碘酮与唑类药物联合应用能够显著增强唑类药物对白念珠菌耐药株的抗真菌作用，几乎不影响唑类药物对白念敏感株的抗真菌作用。

我们相信随着医疗工作者对真菌耐药问题认识的加深，真菌耐药研究会越来越多，不久的将来我们在抗真菌治疗上一定会取得新的进展。

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