雷公藤多甙对雄性小鼠生殖细胞毒性的研究

雷公藤多甙对雄性小鼠生殖细胞毒性的研究
杨建一;高宝珍;李莉;王文娟;郭红刚;边思成
【摘要】背景与目的:研究雷公藤多甙对雄性小鼠生殖细胞的遗传毒性作用,为临床将雷公多甙藤作为抗牛育剂和治疗药的安全使用提供理论基础和依据.材料与方法:昆明种雄性小鼠共3o只,随机分成阴性、阳性对照组,雷公藤多甙抗生育剂量组[10 mg (ks·d)]、中间剂量组[20 mg (kg·d)]和治疗剂量组[30 mg (ks·d)],共5组,每组6只.分别采用骨髓微核实验、精子畸形实验、染色体畸变实验和联会复合体技术,研究雷公藤多甙对雄性小鼠牛殖细胞的遗传毒性.结果:雷公藤多甙20和30 mg (kg·d)剂量组可产生体细胞遗传毒性,与阴性对照组比较差异具有统计学意义
(P<0.05).雷公藤多甙3个剂量组均可致精子畸形并对初级精母细胞产生损伤,以及具有生殖细胞联会复合体损伤,与阴性对照组比较差异均具存统计学意义(P均
<0.05).结论:雷公藤多甙具有遗传毒性和生殖细胞毒性,生殖细胞对雷公藤多甙的敏感性高于体细胞,作为治疗药物忌大剂量长时间使用.
【期刊名称】《癌变·畸变·突变》
【年(卷),期】2008(020)005
【总页数】5页(P393-397)
【关键词】雷公藤多甙;骨髓微核;精子畸形;染色体畸变;联会复合体
【作者】杨建一;高宝珍;李莉;王文娟;郭红刚;边思成
【作者单位】山西医科大学细胞生物与遗传学教研窒,山西太原,030001;山西医科大学细胞生物与遗传学教研窒,山西太原,030001;山西医科大学细胞生物与遗传学教研窒,山西太原,030001;山西医科大学细胞生物与遗传学教研窒,山西太
原,030001;山西医科大学细胞生物与遗传学教研窒,山西太原,030001;山西医科大
学细胞生物与遗传学教研窒,山西太原,030001
【正文语种】中文
【中图分类】R992
雷公藤（tripterygium wilfordii hook.f)系卫矛科雷公藤属的植物，其药用部分多采用去二层皮的根木质部，具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血等功效。

全根提取物为雷公藤片，雷公藤叶提取物为雷诺脂片，雷公藤根芯提取物为雷公藤多甙（glycosides of tripterygium wilfordii hook.f，GTW)。

三类提取物中，雷公藤片最早用于治疗类风湿性关节炎，毒性最大；雷诺脂片毒性最小［1］；雷公藤多甙的应用最广。

动物实验及临床研究已知雷公藤内脂醇、雷公藤内脂酮、雷公藤红素及雷公藤碱有较强的药理活性。

也有认为雷公藤多苷是主要药理活性成分［2］。

雷公藤具有抗炎、抗肿瘤、抗免疫及抗生育作用等，不良反应表现为对多种系统的损害，以及引起皮肤瘙痒、听力减退、色素沉着等，绝大多数不影响长期用药。

雷公藤临床剂量短期使用未见明显诱变作用，对抗生育剂量的雷公藤有效抗生育成分的研究［3-4］和对雷公藤地上部分的研究［5］也都表明雷公藤无明显诱变作用。

但是大量的资料显示［6-7］，雷公藤制剂长期使用有可能使毒性蓄积，服用GTW 10个月累积量＞135 mg/kg，可造成男性患儿青春期性腺发育障碍，严重
者导致不育，这可能是因长期应用时，性腺毒性作用加剧导致损伤难以修复。

另有文献［8］报道雷公藤可致睾丸萎缩。

因此，本文中我们采用临床上常用的毒性较小的雷公藤多甙，对雄性小鼠的骨髓细胞微核、附睾精子畸形、睾丸细胞联会复合体分析、初级精母细胞染色体畸变进行评价，旨在为临床上应用雷公藤多甙作为抗生育剂和治疗药的安全使用提供一定的理论基础和依据。

1.1 主要药品及试剂
雷公藤多甙片，上海复旦复华药业有限公司生产（批号：050104)；环磷酰胺（CP)，上海华联制药有限公司；秋水仙素粉剂，Serva公司出品；羧甲基纤维素钠、多聚甲醛，天津市科密欧化学试剂开发中心产品；硝酸银（分析纯)，北京化
工厂产品。

1.2 动物处理和实验方法
1.2.1 动物分组及染毒健康昆明种雄性小鼠30只，体重30～35 g，山西医科大学动物中心提供［由军事医学科学院引入，SCXK（军)2002-001］。

随机分为5组，每组6只，将雷公藤多甙片研成粉末，溶于1%的羧甲基纤维素钠溶液中配制成浓度为2、4、8 mg/ml的黄褐色GTW混悬液。

阴性对照组，灌服等量1%羧甲基纤维素钠；抗生育剂量组，灌服GTW混悬液10 mg/（kg·d)；中间剂量组，灌服GTW混悬液20 mg/（kg·d)；治疗剂量组，灌
服GTW混悬液30 mg/（kg·d)。

每日灌服，持续3周。

每周按体重调整一次剂量。

停药后24 h处死。

阳性对照组，腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg，注射2 d，第3 d处死。

实验组给药参照临床常用剂量和文献［9-10］，临床常用治疗剂量1 mg/（kg·d)，按人用药量为1，小鼠为30的比例换算［11］，小鼠治疗剂量为30 mg/（kg·d)，抗生育剂量参照雷公藤多甙常用抗生育实验小鼠用剂量，并设定中间剂量，给药体积按5μl/g。

1.2.2 骨髓微核试验颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取后肢股骨，小牛血清冲洗骨髓腔，推片。

甲醇固定15 min，Giemsa染色10～15 min，风干。

油镜下每只小鼠计
数1 000个嗜多染红细胞中含微核的嗜多染红细胞，计算微核千分率。

1.2.3 精子畸形试验除阳性对照组（腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，连续染毒5 d，第12～14 d处死)外，动物分组及染毒方法同1.2.1。

参照改良的小鼠精子畸形实
验方法［12］进行。

每只动物观察300个精子，记录畸变发生率。

1.2.4 联会复合体分析参照文献［13-15］，并根据本实验室条件加以改进。

每只
动物分析50个第一次减数分裂前期细胞的联会复合体，对联会复合体配对和结构异常进行分类计数。

分析指标包括联会复合体畸变百分率和联会复合体畸变总数。

畸变的类型包括断裂、缺失或重复环、多价体、倒位环、银染桥、联会紊乱、自身回折配对、多轴结构等。

1.2.5 初级精母细胞染色体畸变试验参照改进的小鼠初级精母细胞染色体畸变实验方法［16］进行。

对每只动物选取着色良好，轮廓清晰的50个初级精母细胞观察，记录断片、缺失、双着丝粒、环状染色体、易位（链状或环状多价体)、常染色体
单价体以及性染色体单价体等。

1.3 统计学方法
数据采用SPSS11.5统计软件建立数据库。

采用方差分析、χ2检验，组间比较采
用LSD法。

2.1 一般情况
在实验过程中阴性对照组小鼠均活泼好动，毛色光亮；而实验组和阳性对照组小鼠有不同程度精神差、活动减少、毛色晦暗、发育迟缓、食欲差。

2.2 骨髓细胞微核试验结果
小鼠骨髓细胞微核实验结果见表1。

微核发生率随着染毒剂量的增加而逐渐增加。

除抗生育剂量组［10 mg/（kg·d)］与阴性对照组和中间剂量组［20 mg/（kg·d)］比较差异无统计学意义外，其它组间差异均有统计学意义（P＜0.05)。

2.3 小鼠精子畸形统计结果
小鼠精子畸形统计结果见表1。

精子畸形率随着染毒剂量的增加逐渐降低，抗生育剂量组接近阳性对照组，3个实验组与阴性对照组间差异均有统计学意义（P＜
0.05)，实验组相邻两组间差异无统计学意义（P＞0.05)。

2.4 生殖细胞联会复合体（SC)分析结果
小鼠生殖细胞SC见图1～6，分析结果见表2。

3个剂量组与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05)；抗生育剂量组和治疗剂量组与阳性对照组相比差异也有统计学意义（P＜0.05)；3个剂量组间差异均有统计学意义（P＜0.05)。

2.5 初级精母细胞染色体畸变试验结果
雄性小鼠初级精母细胞染色体畸变结果见表2。

3个试验组与阴性对照组相比较差异均有统计学意义（P＜0.05)，3个剂量组间有统计学意义（P＜0.05)，而只有抗生育剂量组与阳性对照组间有统计学意义（P＜0.05)。

3.1 雷公藤多甙的体细胞遗传毒性
微核率可以反映致畸因素对细胞的损伤程度和染色体的稳定性。

本研究通过小鼠骨髓微核实验，表明GTW抗生育剂量组无诱变作用，与刘启兰等［3］的研究结果一致，但中间剂量组［20 mg/（kg·d)］和治疗剂量组［30 mg/（kg·d)］有不同程度的诱变效应。

因此，对于临床上大量和长时间的使用雷公藤多甙，应该考虑其毒副作用的远期影响或在采取一定的应对措施的情况下应用。

3.2 雷公藤多甙的生殖细胞毒性
雷公藤制剂作为一种作用广泛的中药，其应用范围和剂量有扩大和增长的趋势［17］。

雷公藤的生殖毒性是由于长期蓄积所致，在类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等治疗中，连续服用雷公藤多甙3个月左右，其疗效达到顶峰，此后疗效难以进一步提高而进入平台期，连续服用4个月以上疗效有减退趋势。

文献资料显示［18-19］，雷公藤多甙在治疗各种疑难杂症中发挥着越来越强的作用，并且有应用双倍剂量的GTW进行治疗的趋势［20-21］，其治疗时间一般要持续3个月左右。

将雷公藤多甙作为抗生育药物，近年来进行了大量的研究。

抗生育药物理想的抗生育作用应该针对精子的生成和成熟，尤其是精子在附睾的成熟过程中，雷公藤多甙
较强的抗生育能力表现在既作用于大鼠睾丸曲细精管中各级生精细胞，又作用于附睾中的精子。

Qian等［22］曾在动物实验中证实其抗生育剂量对生殖系统的损害是可逆的。

雄性大鼠胃内给GTW［10 mg/（kg·d)］，生育力于用药4周后开始下降，8周后
完全不育；停药5周后，生育力恢复正常，同时也表明其无明显诱变作用［1］。

一些学者［23-25］证实雷公藤的提取物——雷公藤甲素作用于哺乳动物可使精子活力迅速下降，通过影响精子发生而影响其生育力，睾丸曲细精管在雷公藤甲素作用70～80 d后显著减少，发生不可逆的不育。

故一些专家对于雷公藤多甙作为抗生育药和治疗药物在遗传学方面的影响，持质疑态度［2，26］。

3.2.1 雷公藤多甙导致精子畸形本文中3个剂量组的精子畸形率均高于阴性对照组，说明雷公藤多甙可以透过血-睾屏障而对生殖细胞——精子的发育造成影响，干扰精子正常形成与成熟，具有生殖毒性。

实验中观察到有大量头部异常和头尾分离的精子，与杜位良［27］和叶惟三等［28］的报道一致，抗生育剂量组发生了较严
重的畸变。

本研究中采用的抗生育剂量（10 mg/kg连续灌服3周)产生了诱变作用，此结果与张建伟［4］和刘启兰等［29］的结论不同，张建伟等［4］分别采
用GTW临床剂量3倍（3 mg/kg)和100倍（100 mg/kg)灌服大鼠7 d，张健伟等［4］用雷公藤单体T4每日80μg/kg、单体T7每日317μg/kg灌服大鼠10
周测得抗生育剂量没有发生诱变作用，单体T4和T7是从雷公藤中分离出来的抗
生育有效成分的2个单体，属环氧二萜类，而本研究使用的是雷公藤多甙，显示
出雷公藤多甙中含其它有效成分。

雷公藤多甙作用于精子形成后进入附睾到成为成熟精子的每一阶段，是其导致不育的一个重要原因。

本研究中精子发生了较严重的畸变，可能发生于上述任何一个环节，研究所取精子来源于附睾，推断可能是由于附睾微环境的影响，但也不排除精子变形期发生的变化，对于已形成的形态正常的精子是否具备受精能力等问题，需
要进一步研究证实。

3.2.2 雷公藤多甙对初级精母细胞联会复合体的影响作为减数分裂前期Ⅰ联会的同源染色体之间沿纵轴方向存在的一种特殊结构，联会复合体（SC)形成标志着同源染色体联会和交换顺利实现。

SC分析用于检测生殖细胞的染色体损伤，已成为辐射遗传学及遗传毒理学的一项重要指标。

SC微铺展技术在人类生殖及一些染色体病病因和病理发生的研究中受到重视。

本研究首次采用SC微铺展技术对雷公藤导致的染色体畸变进行了分析，并综合现行的各种方法进行了一些改进，取得了较好的观察效果。

例如在制片过程的低渗时进行了适当的吹打，增强了其低渗的效果；在低渗结束时弃去大块组织，以减少杂质的影响，虽然可能减少一些细胞但不会影响结果；在进行铺展时，根据细胞的数量进行铺展，片子不宜过多或过少，过多可能使细胞堆积不易观察，过少导致阅片费时费力。

通过改进的试验方法获得的联会复合体标本片在光学显微镜下即可观察到较清晰的畸变类型。

SC畸变可能是产生不育的原因之一。

雷公藤多甙导致不育，可以从SC畸变的角度进行分析，同时也可以为不育的研究提供依据。

本研究中GTW各个剂量组均可导致联会复合体不同程度的畸变，随染毒剂量的增加逐渐增加，而阳性对照组的毒性程度仅相当于中间剂量组的水平，治疗剂量组的损伤高于环磷酰胺。

说明GTW 相比于环磷酰胺而言对联会复合体的损伤较强。

抗生育剂量组也产生了畸变，本研究的抗生育剂量（10 mg/kg连续作用21 d)产生了诱变作用。

说明雷公藤多甙作为抗生育药长时间使用也会对生殖细胞产生影响。

3.2.3 雷公藤多甙对初级精母细胞染色体畸变的影响本研究将睾丸生殖细胞染色体畸变检测与SC技术相结合验证遗传物质在减数分裂过程中期发生的畸变效应。

结果显示，GTW各个剂量组可导致不同程度的染色体畸变，随染毒剂量的增加畸变程度逐渐增强，而阳性对照组的毒性程度仅相当于GTW中间剂量组的水平，治疗
剂量组毒性高于阳性对照但差异无统计学意义。

抗生育剂量组也产生了畸变。

初级精母细胞染色体畸变分析与SC分析结果基本一致，表明长时间应用雷公藤多甙作为抗生育药也会对生殖细胞产生影响。

雷公藤多甙对于精子发生方面有较强的影响，显示抗生育剂量在连续21 d染毒后染色体产生显著的畸变。

从试验结果观察到的畸变类型看，两种方法有一致的方面，如断裂、圆环、缺失、多价体、易位等，但SC的畸变类型要多于染色体畸变，如多轴结构、联会紊乱、倒位，以及染色单体交换的银染桥。

综上所述，雷公藤多甙对于各剂量组的初级精母细胞产生了不同程度的损伤，尽管已证实抗生育作用在动物中应用有明显的效果［30］，但GTW抗生育剂量长时
间使用也会影响其初级精母细胞，可能发生不可逆的损伤，因此将其作为不育药或治疗药物广泛推广要慎重。

雷公藤多甙3个剂量组10、20和30 mg/（kg·d)对于初级精母细胞产生了不同
程度的损伤。

从联会期和分裂中期的研究结果看出，雷公藤多甙影响到减数分裂Ⅰ的全过程。

联会复合体技术和初级精母细胞染色体畸变分析属于一个发育过程中的不同阶段，因此可以从不同角度说明GTW对精母细胞的损伤效应。

当然，如果能够将这类试验与FISH技术或免疫细胞遗传技术相结合，则可能更加深入而全面地探讨GTW损伤效应的机制。

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