实验二十还原糖和总糖含量的测定—35-二硝基水杨酸比色定糖法

实验二十还原糖和总糖含量的测定—3、5-二硝基水杨酸比色定糖
法
目的要求
1、掌握3，5-二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。

2、用3，5-二硝基水杨酸定糖法测定山芋粉中的总糖及还原糖。

3、熟悉721型光电比色计的原理及使用方法。

实验原理
3，5-二硝基水杨酸在强碱溶液中与还原糖在沸水浴中共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。

该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。

试剂和器材
1.试剂
（1）6mol/L盐酸溶液、10%氢氧化钠溶液、碘化钾-碘溶液（碘试剂）、酚酞指示剂、85%乙醇。

（2）3，5-二硝基水杨酸试剂（又称DNS试剂）：
甲液——溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10%氢氧化钠中，并稀释至69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。

乙液——称取255g酒石酸钾钠，加到300ml 10%氢氧化钠中，再加入880ml 1%的3，5-二硝基水杨酸溶液。

将甲液与乙液相混合即得到黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，在室温下，放置7～10d以后使用。

（3）0.2%葡萄糖标准液：准确称取200mg分析纯的葡萄糖（预先在70℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，冰箱保存备用。

2.器材
试管和试管架、碱滴定管（50ml）、铁架台、滴定管夹、移液管（1ml，2ml）、移液管架、容量瓶（100ml）、铜水浴锅、玻璃漏斗、烧杯、铁三脚架、量筒（10ml、100ml）、电热恒温水浴、煤气灯、玻璃棒、白瓷板、721型分光光度计。

操作方法
1.葡萄糖标准曲线的制定
取9支刻度试管（25ml）或血糖管，分别按下表顺序加入各种试剂：
DNS试剂
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
（ml）
加热均在沸水浴中加热5min
冷却立即用流动冷水冷却
蒸馏水（ml）21.5 21.5 21.521.521.521.521.521.5 21.5 将上述各管溶液混匀后，在721型分光光度计上进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值,以葡萄糖浓度为横座标，光密度值为纵座标绘制出标准曲线。

2.山芋粉中总糖和还原糖含量的测定
（1）样品中还原糖的提取：准确称取2g山芋粉，放入100ml烧杯内，加入85%乙醇50ml，混匀，在50℃恒温水浴中保温30min，过滤，滤渣再用85%乙醇提取二次，将滤液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水稀释到刻度，备用。

（2）样品中总糖的水解及提取：准确称取山芋粉1g，放入大试管中，加入10ml 6mol/L 盐酸和15ml蒸馏水，混匀，在沸水浴中加热0.5h后，用碘化钾-碘溶液检查水解程度。

若已水解完全，则不呈现蓝色。

冷却后加入酚酞指示剂1滴，以10%氢氧化钠中和至溶液呈微红色，过滤并定容至100ml，再精确吸取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶中，稀释到刻度。

备用。

（3）样品中含糖量的测定：取7支大试管，分别按下表加入各种试剂：
将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出山芋粉内还原糖与总糖的百分含量。

还原糖毫克数×样品稀释倍数
还原糖= ———————————————×100%
样品重量
水解后还原糖毫克数×样品稀释倍数
总糖%= ——————————————————×100%
样品重量
思考题
1.写出3，5-二硝基水杨酸的化学结构式。

2.比色测定的操作要点是什么？基本原理是什么？
3.721型光电比色计的原理及使用时的注意事项是什么？
4.比色测定时为什么要设计空白管？
5.总糖包括哪些化合物？。