IGFBP-3在子宫内膜癌组织中的表达

IGFBP-3在子宫内膜癌组织中的表达
郭明华;徐红;吕旻彦;何中慧
【摘要】目的:研究子宫内膜癌组织中胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的表达及意义.方法:采用免疫组织化学二步法染色技术及荧光PCR法,以35例子宫内膜癌患者癌组织标本为研究对象,29例正常子宫内膜组织为对照,检测其中IGFBP-3表达水平.结果:子宫内膜癌组织中,IGFBP-3阳性表达率为31.428%,过度阳性表达率为8.571%;对照组子宫内膜组织的IGFBP-3阳性表达率93.103%,过度阳性表达率55.172%,IGFBP-3在子宫内膜癌中的表达低于对照组(P<0.01).子宫内膜癌组织中IGFBP-3 mRNA表达水平(0.684±0.544)低于正常子宫内膜组织
(1.346±1.399)(P<0.05).结论:IGFBP-3在子宫内膜癌中的表达低于正常子宫内膜组织,子宫内膜癌的发生发展可能与IGFBP-3的表达水平降低有关.
【期刊名称】《广西医科大学学报》
【年(卷),期】2011(028)002
【总页数】3页(P259-261)
【关键词】子宫内膜癌;胰岛素样生长因子结合蛋白-3;免疫组织化学;荧光PCR 【作者】郭明华;徐红;吕旻彦;何中慧
【作者单位】广西医科大学研究生学院;广西医科大学第一附属医院妇科,南
宁,530021;广西医科大学研究生学院;广西医科大学第一附属医院妇科,南
宁,530021
【正文语种】中文
【中图分类】R737.33
子宫内膜癌的发病率近年来一直都有上升趋势[1],是妇科常见的恶性肿瘤之一,胰岛素抵抗以及高胰岛素血症是其高危因素。

近年来越来越多的研究表明胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)与恶性肿瘤的发生发展有密切的联系,并发现其完整的存在于子宫中,胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding Protein,IGFBP)就为此系统中的一部分,其中胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin-like growth factor binding Protein3,IGFBP-3)是血液中浓度最高的。

IGFBP-3与胃癌、肝癌等恶性肿瘤关系研究越来越多,但目前对于IGFBP-3与子宫内膜癌的关系鲜有报道。

本实验通过免疫组化法以及荧光PCR法检测子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中IGFBP-3表达水平,以及IGFBP-3mRNA的含量,探讨IGFBP-3与子宫内膜癌关系。

1 资料与方法
1.1 标本来源:子宫内膜癌组:收集 2009年 3月至2010年2月在广西医科大学第一附属医院妇科进行手术治疗,术后病理确诊的患者35例,年龄42～70岁,平均(51.65±5.11)岁。

对照组:同期的因子宫肌瘤在我科住院行全宫切患者29例,年龄39～52岁,平均(48.62±
2.89)岁,术后病理证实子宫内膜组织无异常。

所有患者术前均未接受过放、化疗及激素治疗。

手术切除子宫后15 min内取新鲜内膜组织,液氮速冻保存,留作荧光PCR实验用。

同时相应的组织送病理甲醛固定,石蜡包埋,制成5 μ m 切片。

1.2 检测IGFBP-3
1.2.1 免疫组化:所有标本经甲醛常规固定,石蜡包埋,每块切取4张5 μ m厚的切片,贴附于用生物胶处理的载玻片上,37℃烤24 h。

切片脱蜡至水,清洗 3次。

3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min,清洗3次。

切片微波抗原修复,冷却、清
洗。

加入一抗兔抗人IGFBP-3Ab(购自Bioworld公司),湿盒内4℃过夜。

清洗后,加二抗37℃,30 min。

清洗3次。

DAB显色,苏木精衬染,脱水,封片,光学显微镜观察。

以PBS代替一抗作为阴性对照,取已知阳性组织切片作为阳性对照。

1.2.2 荧光 PCR:TRIZOL试剂(购自Fermentas公司)提取组织的总 RNA,逆转录 3 μ g RNA为cDNA(试剂盒为 Fermentas RevertAidTM First strand cDNA Synthesis Kit)。

反应体系:总RNA 3 μ g,Oligo(dt)18 primer 1μL,5 XRT Buffter 4μ L,M-M LV 1μ L,10 mol dNTPmix 2μ L,reverse Transcrptase 1μL,加入DEPC 水至20μL,摇匀42 ℃孵化1 h,70℃5 min逆转录。

PCR反应(试剂为 TIANGENRealmasterMix-SYBR Green):20μ L体系。

反应条件:95℃2 min预变性,95℃20 s,56℃30 s,68℃1 min,40个循环。

得出IGFBP-
3△CT值,Applied biosysterm 7500机器分析保存PCR反应结果,最后进行PCR 产物溶解曲线分析,采用 2-△△CT法处理数据进行相对定量。

1.3 免疫组化结果判断:采取盲法读片。

阳性染色为黄色或者棕黄色颗粒位于细胞质中。

综合染色强度及分布范围进行评分:染色强度阴性为0分、染色弱但强于阴性对照为1分、染色清晰为 2分、染色强为 3分。

分布范围评分标准:阳性细胞数＜10%为0分、10%～30%为1分、31%～60%为 2分、＞60%为 3分。

上述2种评分相加:0～1分为(-)、2分为(+)、3～4分为(++)、5～6分为(+++)。

(+)(++)(+++)为阳性表达,(++)(+++)为过度阳性表达[2]。

1.4 统计学处理:采用SPSS16.0统计软件进行处理。

采用卡方检验,成组设计t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 IGFBP-3阳性表达镜下观呈黄色或棕黄色颗粒,见于腺细胞和(或)间质细胞的细胞质中。

IGFBP-3在子宫内膜癌组织中多为阴性(-)或者弱阳性表达(+)、(++),阳性表达率为31.428%,过度阳性表达率为8.571%;而在正常内膜组织中多为阳性表达
(+)(++)(+++)或者强阳性表达(++)(+++),阳性表达率 93.103%,过度阳性表达率55.172%。

子宫内膜癌组中IGFBP-3的阳性表达较对照组弱(P＜0.05),见表1。

表1 两组IGFBP-3的表达比较组别 n IGFBP-3表达阳性表-++++++达率(%)χ2P过度阳性表达率(%)χ2P子宫内膜癌组正常子宫内膜组35292428331.42811150193.103 25.010 0.001 8.57155.172 16.499 0.000
2.2 子宫内膜癌组及正常子宫内膜组IGFBP-3 mRNA表达水平的比较:子宫内膜癌组织中IGFBP-3 mRNA表达水平低于正常子宫内膜组(P＜0.05),见表2。

表2 两组IGFBP-3mRNA表达的比较()注:★与正常子宫内膜组比较,t=-2.584,P＜
0.05组别 IGFBP-3 mRNA子宫内膜癌组0.684±0.544★正常子宫内膜组
1.346±1.399
3 讨论
近年来,对于胰岛素样生长因子系统与恶性肿瘤的关系的研究越来越多。

胰岛素样
生长因子系统由IGF及其受体、IGF结合蛋白及IGFBP的水解酶组成。

IGF通过
自分泌或旁分泌的方式发挥作用,具有促进肿瘤细胞增殖、分化、抗凋亡等多种生
物效应。

Petridou等[3]研究发现IGF-1,IGF-2在子宫内膜癌组织中呈高水平表达。

IGFs与子宫内膜腺癌的发生密切相关。

而IGFBPs与绝大多数的IGF结合,它们的
结合形式在血浆及体液中存在。

IGFBPs的主要作用是在血循环中作为IGFs的载体,形成一个IGFs缓慢释放组织和IGFs循环池,这是IGFs生物利用的主要决定因素,对IGFs的浓度起着重要的调节作用,IGFs与IGFBPs结合可使游离的IGFs不与其受体结合而失去生物学效应。

作为胰岛素样生长因子结合蛋白的一份子,IGFBP-3占IGFBPs的绝大部分,是血液
中浓度最高的。

通过自分泌、旁分泌的方式对进入组织中游离的IGFs的浓度起着重要的调节作用:游离的IGFs与受体结合发挥生物学效应,IGFs与IGFBPs形成复
合体时,IGFs不与受体结合进而失去生物学效应,其中IGFBP-3与大部分IGF-I形成
复合物有效地延长了IGF-I的半衰期从而影响IGF-1的生物学效应。

Bermont等[4]发现IGF-1对子宫内膜癌细胞的增殖作用可被一定浓度的IGFBP-3减弱。

李艳辉等[5]用外源性IGFBP-3与子宫内膜癌Ishikawa细胞一起孵育后,通过细胞增殖实验发现IGFBP-3对Ishikawa细胞有浓度依赖性抑制作用,使亚G1期、G1期细胞比例升高,细胞受阻于G1期,表明IGFBP-3具有抗增殖,促凋亡作用。

IGFBP-3调节细胞生长、存活不仅有结合、调节 IGFs的途径,Firth等[6]研究发现它还有非IGF依赖性途径。

IGFBP-3在多种恶性肿瘤中的降低能抑制肿瘤细胞的增殖[7,8],这点在一些流行病学调查中已有显示;并且Kim等[7]通过转染不能结合IGFs的IGFBP-3突变体到乳腺癌MCP-3细胞后,发现IGFBP-3仍能抑制细胞中DNA的合成,并促进其乳腺癌MCP-3细胞的凋亡。

这也进一步证实了Firth等[6]的研究结果。

本研究通过免疫组化实验发现IGFBP-3在子宫内膜癌组织中多为不表达或弱阳性表达,而在正常子宫内膜组织中多为阳性表达或者强阳性表达,并且在正常子宫内膜组织中的过度表达率也明显高于在子宫内膜癌中。

同时,荧光PCR的结果也提示IGFBP-3 mRNA表达水平明显低于正常子宫内膜组织。

说明IGFBP-3在组织中表达量的减少,与子宫内膜癌的产生密切相关。

由此,我们推测IGFBP-3可能是一种抗肿瘤细胞增生因子,可以抑制肿瘤细胞增生,并诱导癌细胞凋亡,这与Hong等[9]研究结论相类似。

另外,Jenkins等[10]发现恶性肿瘤组织中的IGFBP-3过度表达可以直接或间接诱导癌细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞生长。

在我们的实验中发现IGFBP-3在正常子宫内膜组织中的过度表达率也明显高于在子宫内膜癌中,对此我们推测子宫内膜组织中IGFBP-3的过度表达对于子宫内膜癌的发生及发展可能有抑制作用,但这方面的研究鲜有报道,需要进一步的研究。

由此,我们推测IGFBP-3
在子宫内膜癌中抗肿瘤机制可能为:IGFBP-3和IGFs形成复合物,进而阻止它们激活IGF-1受体以及由此诱导的细胞增生。

子宫内膜癌患者IGFBP-3的表达水平降低,减少的IGFBP-3既不能足够地与IGFs结合而限制其促细胞增生增殖作用,少量
的IGFBP-3也无法起到独立抑制子宫内膜癌细胞增生的作用,因此使得游离的IGF 到达靶组织而发挥促肿瘤细胞增生的生物学功能,直接或间接的促进了子宫内膜癌的形成。

综上所述,IGFBP-3在抑制子宫内膜癌的发生发展中起着关键作用,这一结论对于进一步了解子宫内膜癌的发生及发展有重要意义,为IGFBP-3作为子宫内膜癌诊断及预后可能的生物学标记物提供了依据。

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