滇重楼内生真菌分离与多样性研究

滇重楼内生真菌分离与多样性研究
通过研究滇重楼内生真菌菌群的多样性，为探讨内生真菌作为生物活性物质的价值提供科学依据。

该文通过对云南省嵩明县、鹤庆县、保山市野生滇重楼植株的采集，从其根、块茎、叶中分离内生真菌，并基于ITS序列分析和形态学方法进行分类鉴定。

试验分离得到内生真菌749株，分别归属于41个属，其中3个属仅在根部出现，12个属仅在块茎出现，8个属仅在叶部出现。

各个样地分离出的内生真菌表现出一定的差异，其中鹤庆样地块茎部位分离的内生真菌多样性最高，各样地间，各部位间的内生真菌组成相似性系数低。

研究认为，不同样地、不同部位的滇重楼内生真菌的差异性可能与生境以及各部位结构、成分等因素有关。

标签：滇重楼；内生真菌；分离；鉴定；多样性
[稿件编号]植物内生真菌（endophyte）是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织或器官内部，但宿主植物不表现出外在病害症状的微生物[7-8]。

植物内生真菌具有产生与宿主植物相同或相似药物活性成分的能力[9-10]，从传统药用植物内生真菌代谢产物中寻找活性物质，已经成为植物内生真菌研究的热点问题[11-12]。

已有的研究表明，滇重楼与其内生真菌关系密切，滇重楼中的一些内生真菌在体外培养的条件下可以产生甾体皂苷[13]，甾体皂苷是重楼属植物发挥抗肿瘤，抗菌消炎，止血，镇静、镇痛，免疫调节等药理作用的主要活性成分[14-15]。

目前对重楼属植物内生真菌的研究主要集中在筛选产甾体皂苷菌株方面[16-17]，而对其内生真菌的分离、鉴定以及多样性等方面的研究则鲜有报道。

鉴于此，本文通过野外采集云南省嵩明、大理和保山3个不同地理种群的滇重楼植株，室内分离不同种群滇重楼根、块茎和叶3个部位的内生真菌，并基于形态学和ITS序列分析对分离获得的内生真菌进行鉴定，探明不同地理种源滇重楼不同部位内生真菌的多样性及其差异性，试验研究不仅对于丰富滇重楼内生真菌菌株多样性与进一步筛选活性菌株具有重要意义，并对揭示该物种与内生真菌的互作关系、探讨其人工繁育等具有重要的理论和实践意义。

1 材料与方法
1.1 滇重楼样品采集
2011年4—5月，采集云南省昆明市嵩明县阿子营乡、大理州鹤庆县松桂镇、保山市隆阳区潞江镇的滇重楼（无病虫害），带土采集后带回温室栽培，留待后续实验。

各试验样地的生境条件见表1，试验分别取滇重楼的块茎、根和叶3个部位进行其内生真菌的分离。

表1 各样品采集地基本情况
Table 1 Habitat characteristics of samplings in this study
1.2 内生真菌的分离与纯化
参考黄芳等[18]的研究方法，采用PDA培养基（青霉素G钠和硫酸链霉素的质量浓度为120 μg·L-1）对滇重楼内生真菌进行分离与纯化，其中各部位表面消毒方案为：75%乙醇处理1 min，无菌水冲洗4次，叶片用2.5%次氯酸钠消毒4 min（块茎用0.1%升汞消毒5 min，根用2.5%次氯酸钠消毒15 min），之后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分待用。

接入分离培养基的各组织表面消毒后的处理方法为：叶片剪成0.5 cm×0.5 cm，块茎用解剖刀切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小的方块，根用解剖刀切成1 cm长小段。

菌种保藏采用PDA琼脂斜面培养基，28 ℃恒温箱倒置培养。

试验每皿接种5块，各个样地、各个部位各接种20皿。

1.3 内生真菌鉴定
1.3.1 形态鉴定对分离与纯化获得的内生真菌菌株进行其群体形态特点（包括菌落大小、颜色、表面特征、质地）和个体形态特点（包括菌丝子实体和孢子形态）鉴定，参考《真菌鉴定手册》[19]和《半知菌属图解》[20]对其进行基本的分类，将具有相同形态特征的菌株归并为同一形态类型。

1.3.2 分子鉴定采用CTBA法[21]提取真菌基因组DNA。

ITS扩增使用的引物为ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3′），两者为通用引物，由上海生工生物工程公司合成。

50 μL PCR反应体系为：10 μL 10×PCR Buffer，0.25 μL dNTPs（10 mmol·L-1），1 μL ITS4，1 μL ITS5，0.3 μL Taq酶，1 μL DNA模板，用ddH2O 补足50 μL。

扩增程序：94 ℃ 4 min，94 ℃1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，33个循环，72 ℃3 min，4 ℃保存。

扩增产物送往上海生工生物工程公司测序。

测序结果通过Chromas软件校对，以每个形态型菌株的ITS序列作为靶序列，在NCBI的GenBank数据库中通过Blast搜索，将相似度最高的序列作为参考序列，并用于系统发育分析和鉴定。

1.4 数据分析
采用BioXM2.2，ClustalX1.83对序列进行处理和分析，并用MEGA5构建系统发育树，选择参比序列，以Kimura-2参数模型计算进化距离，用邻接法通过1 000步重估获得的自展检验数值标记在分支上，使用Treeview 1.66输出树形图。

采用分离率（isolate rate）分析滇重楼内生真菌在不同样地和不同部位的分布情况，即分离率=分离到的内生真菌菌株总数/供试植物组织块数总数。

采用Berger-parker优势度指数（D/Di=Ni/N）分析1个种（属）在群落中的地位与作用，其中N为群落内各属（或种）级真菌菌株的数量之和，Ni为群落中属（或种）级真菌i的数量。

采用Shannon-Wiener多样性指数（H′）分析滇重楼内生真菌的丰富程度和在不同样地、部位间分布的均匀度，多样性指数H′=-ΣPiln（Pi），其中Pi=Ni/N。

采用相似性系数（J）分析滇重楼各部位间、各样地间相似性程度。

根据Jaccard公式进行计算：J=j/（a+b-j），其中j为2个部位共有的内生真菌种类数；a，b是2个部位各自的内生真菌种类数。

根据Jaccard相似性系数原理，当J为0.00～0.25时为极不相似；J为0.25～0.50时为中等不相似；J为0.50～0.75时为中等程度相似；J为0.75～1.00时为极为相似。

2 结果与分析
2.1 滇重楼内生真菌的种群组成
试验从3个样地滇重楼的根、块茎及叶部位的900块组织中共分离得到内生真菌749株，经形态学和分子生物学方法将其鉴定为41属，见表2，其中457株鉴定到种，占总菌株数的61%。

根部分离得到内生真菌133株，分别属于16个属，其中曲霉属、裂褶菌属、Thozetella属等3个属仅在根部分离得到；块茎分离得到内生真菌385株，分别属于26个属，其中犁头霉属、Aporospora属、赤霉菌属、腐质霉属、锤舌菌属、被孢霉属、Myceliophora属、Myrmecridium 属、茎点霉属、丝核菌属、刺座霉属、炭角菌属等12个属仅在块茎分离得到；叶部分离得到内生真菌231株，分别属于19个属，其中链格孢属、尾孢属、毛壳菌属、支孢属、棒囊壳属、小囊菌属、光黑壳属、粪壳菌属等8个属仅在叶部分离得到。

分离到的内生真菌中以镰刀菌属和刺盘孢属为优势种群，分别占总菌株数的11.62%，8.95%。

表2 云南3个地点滇重楼内生真菌的种类组成
Table 2 The species composition of endophytic fungi from Paris polyphylla var.yunnanensis in three sites of Yunnan province
2.2 滇重楼内生真菌的分布特征
分离率度量在一个特定的植物组织样品中内生真菌的丰富程度以及植物组织样品中多重侵染的频率。

滇重楼内生真菌的分离率在不同样地、不同部位之间表现出明显的差异性，其中根部的分离率以鹤庆的最高，块茎的分离率以嵩明的最高，叶部的分离率以保山的最高。

同一样地的不同部位中，除保山样地外，以块茎的分离率最高，见表3。

而从分离的各属内生真菌种类来看，以镰刀菌属的分离率最高，为0.87，见表2。

表3 不同样地滇重楼不同部位内生真菌的分离率
Table 3 The isolation rate of Paris polyphylla var.yunnanensis endophytic fungus from leaves，root and tuber in different sample sites
2.3 滇重楼内生真菌的多样性分析
通过对不同样地滇重楼不同部位的内生真菌的Shannon-Wiener多样性指数分析表明，不同样地、不同部位分离的内生真菌，以鹤庆样地块茎部位的多样性最高；而对滇重楼整株的内生真菌多样性指数而言，鹤庆样地分离的内生真菌多样性指数亦最高，为3.02；不同样地分离的内生真菌在各个部位的多样性分布则以块茎部位分离的内生真菌多样性指数最高，为2.86，见表4。

表4 滇重楼内生真菌群落的Shannon-Wiener多样性指数
Table 4 The Shannon-Wiener diversity index of endophytic fungi from Paris polyphylla var.yunnanensis
2.4 滇重楼内生真菌的相似性分析
相似性系数（J）可以反映不同样地间及不同部位间分离到的内生真菌的相似程度。

各部位间的相似性系数在0.25以下，为极不相似，各地区间的相似性系数在0.25～0.50，为中等不相似，说明各样地间，各部位间的内生真菌组成不相似，见表5。

表5 滇重楼内生真菌的相似性系数
Table 5 Endophytic fungi similarity coefficient of Paris polyphylla var.yunnanensis from different tissues and different sites
2.5 基于ITS序列的滇重楼内生真菌系统发育分析
以不同样地滇重楼药用部位块茎的内生真菌ITS发育树为代表，分析其内生真菌的系统发育情况，由这3个代表性的系统树可以看出，内生真菌中各个属的不同种往往聚在一支，块茎部位的部分特有属，如被孢霉属（保山），犁头霉属（鹤庆）以及丝核菌属（嵩明），往往单独聚成一支。

叶部特有属的柄孢壳菌属（嵩明），Codinaeopsis属（鹤庆）聚成单独一支，而根部特有属与其他属聚成一支。

各样地块茎部位分离出的内生真菌根据其鉴定归类，保山样地有5种鉴定到种，3种鉴定到属，见图1；鹤庆样地有15种鉴定到种，8种鉴定到属，见图2；嵩明样地8种鉴定到种，5种鉴定到属，见图3。

图1 保山样地滇重楼块茎内生真菌ITS序列与参考序列构建的N-J树
Fig.1 Phylogentic tree （N-J）of endophytic fungi based on ITS rDNA sequence of Paris polyphylla var.yunnanensis tuber in Baoshan
图2 鹤庆样地滇重楼块茎内生真菌ITS序列与参考序列构建的N-J树
Fig.2 Phylogentic tree （N-J）of endophytic fungi based on ITS rDNA sequence of Paris polyphylla var.yunnanensis tuber in Heqing
3 讨论
本研究分离得到41属内生真菌，分别属于子囊菌门、接合菌门和担子菌门。

试验分离出的内生真菌大部分作为植物内生真菌被广泛报道，其中镰刀菌属、青霉属、木霉属、曲霉属、交链孢属等9属是已报道的从滇重楼块茎部位分离出的内生真菌。

各部位中3属仅在根部分离到，12属仅在块茎中出现，8属仅在叶部出现，而不同样地之间则分别有7属、11属和4属仅在保山、鹤庆和嵩明出现，
表明滇重楼内生真菌在不同生境条件下以及植物体内不同部位定殖存在较明显的组织差异性和组织专一性[26]。

图3 嵩明样地滇重楼块茎内生真菌ITS序列与参考序列构建的N-J树
Fig.3 Phylogentic tree （N-J）of endophytic fungi based on ITS rDNA sequence of Paris polyphylla var.yunnanensis tuber in Songming
同一样地的不同部位中，除保山样地外，以块茎的分离率最高；同时，根、块茎和叶3个部位内生真菌在3个样地的多样性指数亦以块茎最高，分析其原因可能是滇重楼的块茎为其多年生部位，块茎部位与土壤的接触面积大，提高了真菌菌丝侵入的概率。

此外，块茎部位的体积较大，为内生真菌提供的生存空间也较大，其组织成分相对于叶和根也更适合内生真菌的生存。

滇重楼根、块茎和叶3个部位在不同样地样地间的J值均在0.5以下，为中等不相似或极不相似，表明各样地间3个部位的内生真菌组成不相似。

吴晓菡等研究亦发现天目山山胡椒Lindera glauca茎、树皮、叶之间内生真菌的相似性系数仅为0.18～0.27[22]。

Espinosa-Garcia 和Langenheim 研究认为植物的内生真菌组成不相似的原因可能是气候与具体的生境不同[23]。

在本研究中，滇重楼各样地分离出的菌株数与海拔表现出相同的变化趋势，但内生真菌的种类、多样性以及丰富度与样地的海拔、经纬度没有明显的相关性。

此外，根据鹤庆样地滇重楼不同部位分离出的内生真菌所构建的N-J树可以看出，各部位间的内生真菌有其共有的属，也有各部位特有的属，其反映滇重楼不同部位间内生真菌种类组成上的不相似。

滇重楼根、块茎和叶3个不同部位间的内生真菌组成不相似可能是由于不同部位的结构、成分、生长年限以及与土壤、空气中的真菌接触机会大小不同造成的[24]。

目前，关于滇重楼内生真菌的研究主要集中在其块茎部位[13]，但是，对其他药用植物如石斛Dendrobium sp.[25]、山胡椒[22]、旱柳Salix matsudana[26]、黄花夹竹桃Thevetia peruviana[27]等内生真菌的研究发现，同种植物在不同生境和不同部位之间，其内生真菌存在明显的差异性，并反映不同内生真菌对宿主植物的组织差异性和专一性，其在资源的人工繁育、活性菌株筛选等方面具有重要意义。

在本研究中，滇重楼根和叶的内生真菌的种类虽然少于块茎，但2个部位均含有较丰富的特有属，研究结果不仅丰富了滇重楼内生真菌的多样性，并为探讨其功能性内生真菌的分布与筛选提供了科学依据。

此外，在本研究分离获得的内生真菌中，青霉属，木霉属，丝核菌属，交链孢属，小不整球壳属和柄孢壳属是已报道的滇重楼内生真菌，尖孢镰刀菌以及粘鞭霉属和曲霉属内生真菌亦是已报道能产甾体皂苷的活性菌株[21]，但本研究获得的茎点霉属，刺盘孢属，新赤壳属等32属的内生真菌是首次报道的滇重楼内生真菌，其中在块茎部位有18属为首次报道，丰富了滇重楼内生真菌资源。

但是，前期报道的部分滇重楼内生真菌在本研究中并未分离到，可能与滇重楼采集地的生态条件有关，这与洪群艳等[25]对石斛的研究结果相似。

本研究将传统形态学分类和分子生物学方法结合进行滇重楼内生真菌的分
离与鉴定，探明了不同地区滇重楼不同部位的内生真菌的种类及多样性，丰富了滇重楼内生真菌菌株多样性，并对进一步揭示该物种与内生真菌的互作关系、探讨其人工繁育等提供了科学依据。

但是，不同真菌适合生长的培养基不同，不少微生物不能人工培养，使得实际分离到的内生真菌的种类可能少于宿主组织中的实际内生真菌种类。

因此，建议后续研究中换用其他分离培养基，或通过非分离培养方式鉴定组织内生真菌[28]，并对不同部位和样地内生真菌差异性的形成机制及功能性状进行系统研究，促进滇重楼这一珍贵种质资源的可持续开发利用。

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Isolation and diversity analyses of endophytic fungi from
Paris polyphylla var. yunnanensis
WANG Qian，SHEN Shi-kang ZHANG Ai-li，WU Chun-yan，WU Fu-qin，ZHANG Xin-jun，WANG Yue-hua
（School of Life Sciences，Yunnan University，Kunming 650091，China）[Abstract] The paper is aimed at studying the diversity of endophytic fungi community from Paris polyphylla var.yunnanensis，and to provide a scientific basis for the utilization value of the endophytic fungi as bioactive material resources.In the present study，endophytic fungi were isolated from roots，rhizomes and leaves of wild P.polyphylla var.yunnanensis collected from Baoshan，Heqing county and Songming city of Yunnan province，and identified and classified by morphological methods together with its ITS sequence analysis.Seven and forty-nine strains of endophytic fungi were isolated from P.polyphylla var.yunnanensis.They were identified belonging to 41 genus.In these 41 genus，3 genus exist in root only，12 genus only exist in rhizome and 8 genus only exist in leaf.There was difference in endophytic fungi isolated from different sample sites.Endophytic fungi diversity from rhizomes of Heqing site was the highest.Endophytic fungi similarity coefficient was low among different sites and tissues.Based on these results，it is reasonable to propose that endophytic fungi of P.polyphylla var.yunnanensis from different tissue and different sample sites has a certain difference which is possibly relate to their different habitats，different structure and composition of each tissue.
[Key words] Paris polyphylla var.yunnanensis；endophytic fungi；isolation；identification；diversity
doi：10.4268/cjcmm20132209。