生物化学与分子生物学_第6章菌种的选育、保藏和复壮
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生产菌种的选育培养—菌种的扩大培养及保藏
2. 通过寄主体进行复壮 3. 淘汰已衰退的个体
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
生产中常用菌种的分离、选育和保藏
生产中常用菌种的分离、选育和保藏在生产中，分离、选育和保藏常用菌种是非常重要的步骤，这些菌种可以用于各种不同的应用，如发酵过程中的生物转化、抗生素的生产以及食品工业中的乳酸发酵等。
以下是常用菌种的分离、选育和保藏的基本步骤：1. 分离：分离菌种是指从自然环境中分离出纯种菌株的过程。
首先，需要选择合适的样品来源，如土壤、水样或食品样品等。
然后，将样品进行稀释、接种到固体培养基上，培养出菌落。
最后，从菌落中挑选单一菌株，并进行纯化培养，得到纯种菌株。
2. 选育：选育是指对已有菌种进行进一步培养和筛选，选出优良品系。
在选育过程中，可以根据所需特性进行筛选，如产量高、抗性强或代谢产物优良等。
通过连续传代培养和筛选，可以逐步培育出符合要求的优良品系。
3. 保藏：保藏是为了长期储存和保存已经分离和选育得到的菌种。
常用的保藏方法包括冷冻保存和冷冻干燥等。
冷冻保存是将菌种保存在低温 (-80℃或液氮温度下)，可以长期保存并保持菌株的生物学性状。
而冷冻干燥则是在低温下将菌种先冷冻，然后通过真空蒸发使其脱水，最后用密封容器保存。
冷冻干燥具有长期保存时间和较小的储存体积的优点。
在菌种的分离、选育和保藏过程中，需要注意的是严格遵守无菌操作规范，以防止杂菌污染。
另外，应该建立相应的菌种信息管理系统，记录并标注每个菌株的来源、特性以及保藏条件等重要信息，以便日后使用和查询。
菌种的分离、选育和保藏在生产中扮演着极其重要的角色。
下面将进一步探讨这些过程，并介绍一些常用的菌种及其应用领域。
在分离菌种的过程中，重要的是选择适当的样品来源。
不同的环境中存在着各种微生物，如土壤、水体、植物、动物及其制品等。
通过采集不同来源的样品，可以获得不同类型和特性的微生物，从而得到多样性的菌株资源。
在接种前，样品经过稀释，使微生物适当分散。
然后将稀释液均匀接种于固体培养基上，并进行孵育。
在培养过程中，微生物通过分裂繁殖形成菌落，而每个菌落代表一个菌株。
第二章-菌种选育、保藏与复壮
自 然 选 育
05年江南大学微生物(发酵)考研试题
资料显示，某些芽孢杆菌具有分解和利 用葡聚糖的能力，请设计方案从自然界中筛选 一产葡聚糖酶的菌株，并简要分析各主要步骤 的依据。
三、诱变育种
诱变育种：指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中， 使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的 突变株的过程。 提高了菌种发生突变的频率和变异幅度，提高获优机率。
由葡萄糖制造果糖
医药、食用 酵母菌体蛋白 食品工业 食用、医药
柑橘罐头脱除苦味
分解单宁、酶精制、酒精发酵工业 同枯草杆菌蛋白酶 葡萄糖制造、酒精厂糖化、医药 腐乳生产 蛋白除葡萄糖、脱氧、食品罐头贮存 淀粉和食品加工、饲料 食用、化工 葡萄糖制造、酒精厂糖化、调色剂
枯草芽孢杆菌
戊糖片球菌
植物乳杆菌
菌种种属的鉴定
• 鉴定工作的内容
（1）测定一系列必要的鉴定指标； （2）查找权威鉴定手册，确定菌种类型。
• 鉴定方法
（1）经典的分类鉴定方法：形态学特征；生理生化特征； 血清学试验与噬菌体分型；氨基酸顺序和蛋白质分析
（2）现代分类鉴定方法：微生物遗传型；细胞化学成分； 数值分类法
二、自然选育
自然选育的定义
（4）生长繁殖力强，速度快，较强产孢能力；
（5）原料广，价廉，易被微生物利用、转化；
（6）对添加的前体物质有耐受能力；
（7）菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强。
2019/6/19
4
二、现代发酵工业常见菌种
类别
细菌 酵母菌
霉菌
微生物名称 短杆菌 短杆菌 枯草杆菌 枯草杆菌 巨大芽孢杆
菌 酒精酵母 假丝酵母 脆壁酵母 黑曲霉
第二节 菌种选育
菌种的保藏与复壮
eg:生长因子产生菌的筛选：
通过观察分离菌能否促进营养缺陷型
（auxotroph）的生长，便可检出生长因子
产生菌。
eg:多糖生产菌的筛选：
从制糖工业的废水中可获得分离株，在适
当的培养基中生长，可从菌落的粘液状外
观识别这类产生菌。
第三节 高产菌种选育
• 菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生 物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产 品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良 菌种，从而促进生产发展。 • 目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方 法，带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。 随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、 转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为 定向的育种方法。
根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。
诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。 诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三大类。经 诱变处理后，微生物的遗传物质、 DNA和 RNA的化学结构发 生改变，从而引起微生物的遗传变异。
诱变育种的一般步骤
（1）出发菌株的选择 • 自然界直接分离到的野生型菌株 • 经历过生产条件考验的菌株 • 已经历多次育种处理的菌株
B：病毒(virus) 其特点如下： 1. 形体微小，体积比细菌小的多。
2. 没有细胞结构，主要由核酸和蛋白质构成。
3. 营寄生生活不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专 一性。
人类免疫缺陷病毒 （ human immunodeficiency virus ，HIV ）
获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome AIDS ）
eg:抗生素生产菌的筛选：
菌种选育、保藏与复壮2
食品发酵与酿造工艺学
第二章
六、基因工程技术
1、含目的基因DNA片断的制备。
2、选择合适的载体。 3、带有目的基因的DNA片断与载体连接。 4、将重组的DNA分子导入受体细胞， 在受体细胞内扩增。 5、筛选和鉴定出带有重组DNA的转化细胞。 6、表达、鉴定外源基因的表达产物。
食品发酵与酿造工艺学
第二章
第二章
步骤十
在营养平板上贴好标签，标示好
接种日期、操作者姓名、菌第二章
固体培养基的稀 释涂抹接种法
食品发酵与酿造工艺学
第二章
需要使用的仪器——震荡机
食品发酵与酿造工艺学
第二章
吸取准备好欲稀释的菌液
食品发酵与酿造工艺学
第二章
取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。 将菌液臵入，此时试管须做记号为第一次稀释。
第二章
食品发酵与酿造工艺学
第二章
（二）原生质体融合的主要骤
标记菌株的筛选 优良菌株的筛选
原生质体的制备
筛选稳定的融合子
原生质体再生试验
原生质体的融合
食品发酵与酿造工艺学
第二章
• 1、标记菌株的筛选 • 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株 • 为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一 般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺 陷型或抗药性、菌落特征、细胞形态等.
第二章
由第五步骤的第一区中划出第二 区，如右上图。
步骤八
食品发酵与酿造工艺学
第二章
重复第六以及第七步骤，由第七步骤的 第二区中划出第三区，如右上图。
步骤九
食品发酵与酿造工艺学
第二章
重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三 区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后 的营养平板，如右上图。
菌种选育保藏与复壮
噬 菌 体 感 染 试 验
植物病毒重建实验
HRV：车前草病毒；TMV：烟草花叶病毒
实验证明，遗传信息的流向与DNA的传递是一致的。
2.遗传物质的分子结构和化学组成 （1）遗传物质的化学 组成 （2）遗传物质的结构 （3）DNA的复制：半 保留、半不连续复制。
3.遗传物质在细胞中的存在形式
紫外线对DNA的损伤及其修复
UV
嘧啶
嘧啶二聚体
光复活作用
光解酶 嘧啶
嘧啶二聚体
四、微生物的杂交育种
（一）杂交育种的目的 （二）杂交育种的程序 1菌种准备 2.杂交育种使用的培养基 3.杂交育种的方法
五、原生质体融合
原生质体 原生质体融合 原生质体融合技术的特点 微生物原生质体融合育种方法 （标记菌株筛选、原生质体制备、原生质体再生试验、 原生质体融合、融合子的选择） 出现问题及解决方法
六、基因工程技术
DNA重组技术 DNA重组技术的基本程序 DNA重组的操作
第二节 菌种保藏与复壮
菌种保藏的目的和原则：
目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、 生产、交换之用。 基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种。 2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体 3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低 温）。 4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重 要的微生物菌株。
第二章 菌种选育、保藏与复壮
菌种选育 菌种保藏与复壮 国内外主要的菌种保藏机构
2013年12月
第一节 菌种选育
一、微生物菌种选育的理论基础 （一）微生物的遗传性和变异性 遗传 变异 微生物的遗传性和变异性的特点
（二）遗传变异的物质基础
1.研究的历史 （1）孟德尔 豌豆试 验
7-第六章(微生物菌种的选育与保藏)
• 诱变育种是选择合适的诱变因素及剂量，人为地对出发菌株进 行诱变处理，运用适合的筛选方法获得优良变异菌株的过程。
• 诱变育种是微生物菌种选育的主要方法，具有速度快、收效大、 操作简单等优点。
• 微生物诱变育种的一般流程： 出发菌株 → 细胞（孢子）悬浮液 → 诱变处理 → 涂布培养皿
→ 初筛 → 菌种保存 → 复筛 → 试验、应用生产
• 菌种选育同时也是科研工作的基础，通过选育菌种的一系列工 作可更好的了解菌种遗传背景、分析生物合成机制和提供遗传 学研究材料。
• 微生物广泛分布于自然环境中，而且它们常以各种形式混杂生 长繁殖在同一环境中，因此在特定的环境下筛选微生物，可以 得到人们所需要的菌种。
• 从自然环境中分离筛选菌种的步骤主要包括：采样、增殖培养、 纯种分离、初筛、复筛。
• 野生型：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始 菌株。
• 突变体：发生了突变的微生物细胞或菌株。
• 基因突变：基因组DNA分子发生的突然的、可稳定遗传的变异 现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基 对组成或排列顺序的改变。
• 基因突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时 期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期；同 时基因突变和DNA的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关 系。
第七章
微生物菌种的选育与保藏
• 了解微生物遗传变异的基础知识。 • 理解微生物菌种筛选的方法，微生物菌种选育的方法与
机制，微生物菌种衰退的原因与预防措施。 • 掌握微生物菌种保藏的原理与方法，微生物菌种复壮的
方法。 • 培养创新精神、创新思维，增强对党的创新理论的政治
认同、思想认同、情感认同。
• 遗传与变异 • 微生物菌种的选育 • 微生物菌种的保藏
菌种选育与保藏
3. 原生质体融合
4. 基因工程
二、菌种的保藏与复壮 1、菌种的退化
1）、菌种退化的原因
随着菌种保藏时间的延长或菌种的多 次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗 传性状可能得到延续，也可能发生变异。 变异有正变（自发突变）和负变两种。 菌种退化的主要原因是基因的负突变。
2）、菌种衰退的含义
菌种衰退（degeneration） 菌种衰退（degeneration）是指由于自 发突变的结果， 发突变的结果，而使某物种原有的一系列 生物学性状发生量变或质变的现象。 生物学性状发生量变或质变的现象。
种分离
通过纯种分离，可把退化菌种的细胞 群体中一部分仍保持原有典型性状的单细 胞分离出来，经过扩大培养，就可恢复原 菌株的典型性状。
2 ）. 通过宿主体内生长进行复壮 . 3）. 淘汰已衰退的个体
3、菌种的保藏
1）. 菌种保藏原理
菌种保藏的方法很多，原理也大 同小异。首先要挑选典型菌种的优良 纯种。最好采用它们的休眠体(如分生 孢子、芽孢等)；其次，还要创造一个 最有利休眠的环境条件，诸如干燥、 低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添 加保护剂或酸度中和剂等。
2）. 菌种保藏的方法
斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法
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3）. 影响菌种存活及长期保藏的 主要因素
（1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） 培养条件和菌龄 菌种悬液的浓度 保护剂 冻结速度 干燥程度 保藏条件 恢复培养
第七节 菌种的选育与保藏
一、菌种的选育
1. 微生物菌种的筛选
要想使微生物产生大量的代谢产物， 可以通过选育突变株来实现。 包括营养缺陷型突变株；抗阻遏抗 反馈突变型和抗性突变型。
菌种的选育与保藏共88页文档
菌种的选育与保藏
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
谢谢！
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
谢谢！
菌种的选育与保藏
微生物菌种选育与保藏本章知识概要第一节菌种分离与筛选第二节菌种选育第三节菌种保藏第一节菌种分离与筛选1、采样原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。
可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。
土壤、水、空气、动植物体都含有微生物。
土壤由于具备了微生物所需要的营养、水分、空气。
是微生物最集中的地方从土壤中几乎可以分离所需要任何菌株。
细菌（108）＞放线菌（107）＞霉菌（106）＞酵母菌（105）＞藻类（104）＞原生动物（103）②采样方法：选择适当地点和场所、用无菌器皿取样十克，装入袋中，记录采样地点、时间、环境等等。
2、富集培养：在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下，迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
A：控制营养条件----纤维素酶产生菌B：控制培养条件----施加压力、pH、温度、氧气、根据特殊生理特征、C：添加特殊抑制剂---抗生素3、纯种分离：富集培养而得到微生物，并不能达到纯化标准，杂菌并没有死亡、还需要进一步纯化----纯培养粗放型：菌落纯精细型：菌种纯划线分离法A：粗放型涂布分离法稀释分离法平板划线分离法：接种针挑取含有微生物样品，在固体培养基表面上划线，适当条件培养后，挑取单菌落。
稀释分离法用1ml无菌吸管精确地吸取1ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，使其混合均匀。
另取一支吸管自10-1试管吸1ml放入10-2试管中……其余依次类推。
涂布分离法用涂棒蘸取培养液，在固体培养基表面均匀涂平，获得单菌落。
精细型：毛细管分离法：利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。
也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。
流式细胞仪：流式细胞仪（Flow CytoMeter, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析和检测、筛选技术。
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书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 商丘师范学院·生物学教学论实验室
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
物理诱变因子 1.菌种的选育
紫外线是用得最广的诱变剂，在与其他诱变剂相近的致死
量下即可引起变异。
紫外线照射后DNA单链相邻的胸腺嘧啶之间或双链DNA上相 应的胸腺嘧啶之间都能形成二聚体。二聚体影响DNA的复制
践证明，用空间技术育种的最大 优势在于，其能在较短
的时间里创造出目前其他诱 变育种方法难以获得的罕见 突变基因资源。
物理因子的优缺点：
优点：设备简单，操作方便，诱变效果好 缺点：正突变率较低，筛选工作量大
书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 商丘师范学院·生物学教学论实验室
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
其基本原理是，通过对人们所希望的离子进行加速。
从而对细胞进行刻蚀加工。注入细胞内部的离子可对部分 基因进行修饰、加工、引导外源基因尤其是大分子基因组
转入受体细胞，实现在新遗传背景下的诱变育种及遗传转
化。 离子束诱变的一般操作方法( 以利福霉素生产菌的离
子注入诱变育种为例)为：取菌悬液0.2ml放入无菌平皿中。
等缺点，具有广阔的应用前景，是项值得深入研究的工作。
书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 商丘师范学院·生物学教学论实验室
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育
空间诱变育种 空间环境包括太空环境和高空环境。太空环境主要 指大气层以上的宇宙空间。太空环境的显著特点是高真空、 微重力和高能核粒子辐射。微生物通过返地式科学探测卫 星和航天飞机，进行环地球飞行。在宇宙射线、微重力作 用下诱发细胞变异。高空环境主要是指对流层以上大气层， 如平流层、电离层等。海拔高度约为30-80kin厚的大气层。 高空环境的主要特点是宇宙射线、等离子辐射和强烈的紫 外线。高空诱变就是利用高空探测气球搭载微生物。经过 大气的平流层或电离层的电离辐射而诱发细胞变异。
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.自然选育 1.菌种的选育
主要应用：
有用微生物的筛选；生产用菌种的筛选；极 端环境微生物的筛选等。
具体案例：
炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）活菌 苗的培育；卡介苗
书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 商丘师范学院·生物学教学论实验室
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
班 院 日
级：09级生化与分子 系: 生工学院 期: 2009.09.14
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.自然选育 1.菌种的选育
概念：利用微生物的自发突变，并采用特定的选择
条件，通过对微生物群体不断移植以选育出
较优良菌株的古老方法。 微生物一般发生自然突变的频率并不高，但也有
书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 商丘师范学院·生物学教学论实验室
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育 离子束注入诱变育种：
国外白20世纪60年代中、后期相继把离子注入技术应
用于生物学领域的研究。我国在1986年，由中国科学院等
离子物理研究所余增亮等首先把离子注入这一高新技术应 用于农作物品种改良，并获得成。
1.菌种的选育 自然选育的一般步棸：
采 样 方法、地点、时间和周围环境记录
增 殖 培 养 纯 种 分 离
纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落： 1．稀释分离法 2．平板划线分离法 ⑴ 涂菌： ⑵ 划线分离：①分步划线法；②一次划线法： 3．组织分离法
纯
培
养
生产性能测 定
测定代谢产物或其它目的性状
书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 商丘师范学院·生物学教学论实验室
确定出发菌株 ↓ 菌种的纯化选优 ↓←出发菌株的性能鉴定 同步培养 ↓ 制备单细胞（或单孢子）悬液 ↓←活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 ↓ 诱变处理 ↓ 平板分离 ↓计形态变异的菌落数，计算突变率 挑取疑似突变菌落纯培养 ↓ 突变体的初步筛选 ↓←用简单快捷的方法 重复筛选 ↓←摇瓶发酵试验 选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处)
天然碱基贫乏时
在DNA复制时，需要吸收外源、 碱基以合成新的DNA分子时
书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 商丘师范学院·生物学教学论实验室
碱基类似物掺入 到DNA分子中
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育 使用化学诱变剂的优缺点：
大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射 更有效。 化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适 的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸 气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并 要注意安全性。 大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常 谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入 其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接 接触就会过敏，这就更要当心。
因某种原因突变频率较高的情况，如细胞中DNA复
制产生错误时和细胞染色体外的质粒带有外来基因 时等。
工业生产过程中，为了维持菌种稳定的生产能力，
必须经常进行自然选育，纯化菌种，通过分离、筛 选排除低产、退化的菌株，相应提高群体的生产水 平。
书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 商丘师范学院·生物学教学论实验室
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育
微波辐射诱变育种 微波是一种频率在300MI-Iz到300GHz之间的电磁波，它 具有波动性、高频性、热特性和非热特性。它与生物组织的 相互作用主要表现为热效应和热效应。微波能够透射到生物
组织内部。使偶极分子和蛋白质的极性侧链以极高的频率振荡
增加分子的运动，导致热量的产生。微波还能够对氢键、疏水 键和范德华力产生作用，使其重新分配从而改变蛋白质 的构象与活性。 微波育种具有清洁、高效、操作简单、方法易行、世代 周期短等特点，克服了索外诱变易光修复，化学诱变毒性大
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
突变菌株的筛选： 1.菌种的选育
（2）抗药性菌株的筛选
抗性菌株有药物抗性突变株、抗噬菌体或细菌素的
突变株和抗物理因子突变株等。抗生素生产菌种选育时 常采用前体类似物或抗生素类似物。
微生物代谢产物对自身的生物合成具有调节作用。 因此抗生素抗性菌的自身抗性可有效地用来选育高产
1.菌种的选育 化学诱变因子
化学诱变剂中常用的是烷化剂，如氮芥、硫酸二乙酯等， 它们分别具有一个或多个活性烷基，能使DNA上的碱基烷 化或使烷化后的嘌呤失落、生成烷化磷酸基，也能使DNA 上的糖－磷酸间的链断裂或发生交联。 碱基类似物也是一类化学诱变剂，是一种分子结构与天 然碱基相类似的化合物，常用的有5－氟尿嘧啶（5FU)等。
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第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育
涂成菌液薄层，在超净台中风干。制成风干皿。然后把 风干皿置于离子注入机的小靶室中。N+离子束辐照处理， N注入剂量分别为3x1014／cm2N+。5xl0n／cm2N+，7x10 tS／cmN能量3okeV。 离子束辐照处理后稀释涂平板。 离子注入集化学诱变、物理诱变为一体，具有正突 变体的高效性、菌体细胞表面刻蚀性、菌体存活曲线呈“ 马鞍型”等特点。加之离子束介导转基因的可能性。使其 在微生物育种中更具有目的性和针对性。随着研究程度的 深入，研究范围的拓宽，离子注入法在抗生素产生菌育 种中能发挥巨大的作用。
导入基因后 激活本来 沉默的基因
例子：抗生素生产菌种的分子育种、
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第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育 突变菌株的筛选：
（1）营养缺陷型菌株的筛选
原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长 情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则 不生长，野生型都能生长，如抗生素法（细菌可以采 用青霉素，酵母采用制霉菌素）和菌丝过滤法。
质量沉积
电、能和质 的联合作用
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1.菌种的选育 诱变育种的注意点：
单细胞或单孢子悬液的制备：进行合适培养基的培养，
离心、洗涤和过滤。 需要中间培养过程：突变尚未表现出来之前，有一个表
现延 迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延
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1.菌种的选育
空间诱变育种 空间环境的主要特征是：长期微重力状态、空间辐
射、超真空和超洁净等。空间诱变是空间条件 处理微生
物诱变育种的有效方法。微生物的诱变育 种的直接应用 可以提高产量，改善菌种的有利性 状，创造新品种。实
诱变后的酵母菌细胞
含异烟肼的琼脂培养基
观察结果
结论：可能产生了能分解异烟肼酶的突变株，或者产生
了能合成更高浓度的吡哆醇，以克服异烟肼的竞争性抑 制的突变株。
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1.菌种的选育 突变菌株的筛选：
（3）产量突变株的筛选 案例：春日霉素生产菌的筛选
琼脂块培养法
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第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育 突变菌株的筛选：
（4）抗噬菌体菌株的筛选 对目的菌种进行诱变 接种孢子悬夜 加入噬菌体原液 稳定性试验 确认目的菌株
迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个 过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。 出发菌株的选择：挑选对诱变剂敏感性大、变异幅度广 和产量高的为出发菌株。
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第六章 菌种的选育、保藏和复壮
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物理诱变因子 1.菌种的选育
紫外线是用得最广的诱变剂，在与其他诱变剂相近的致死
量下即可引起变异。
紫外线照射后DNA单链相邻的胸腺嘧啶之间或双链DNA上相 应的胸腺嘧啶之间都能形成二聚体。二聚体影响DNA的复制
践证明，用空间技术育种的最大 优势在于，其能在较短
的时间里创造出目前其他诱 变育种方法难以获得的罕见 突变基因资源。
物理因子的优缺点：
优点：设备简单，操作方便，诱变效果好 缺点：正突变率较低，筛选工作量大
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第六章 菌种的选育、保藏和复壮
其基本原理是，通过对人们所希望的离子进行加速。
从而对细胞进行刻蚀加工。注入细胞内部的离子可对部分 基因进行修饰、加工、引导外源基因尤其是大分子基因组
转入受体细胞，实现在新遗传背景下的诱变育种及遗传转
化。 离子束诱变的一般操作方法( 以利福霉素生产菌的离
子注入诱变育种为例)为：取菌悬液0.2ml放入无菌平皿中。
等缺点，具有广阔的应用前景，是项值得深入研究的工作。
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1.菌种的选育
空间诱变育种 空间环境包括太空环境和高空环境。太空环境主要 指大气层以上的宇宙空间。太空环境的显著特点是高真空、 微重力和高能核粒子辐射。微生物通过返地式科学探测卫 星和航天飞机，进行环地球飞行。在宇宙射线、微重力作 用下诱发细胞变异。高空环境主要是指对流层以上大气层， 如平流层、电离层等。海拔高度约为30-80kin厚的大气层。 高空环境的主要特点是宇宙射线、等离子辐射和强烈的紫 外线。高空诱变就是利用高空探测气球搭载微生物。经过 大气的平流层或电离层的电离辐射而诱发细胞变异。
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.自然选育 1.菌种的选育
主要应用：
有用微生物的筛选；生产用菌种的筛选；极 端环境微生物的筛选等。
具体案例：
炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）活菌 苗的培育；卡介苗
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第六章 菌种的选育、保藏和复壮
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
班 院 日
级：09级生化与分子 系: 生工学院 期: 2009.09.14
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.自然选育 1.菌种的选育
概念：利用微生物的自发突变，并采用特定的选择
条件，通过对微生物群体不断移植以选育出
较优良菌株的古老方法。 微生物一般发生自然突变的频率并不高，但也有
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1.菌种的选育 离子束注入诱变育种：
国外白20世纪60年代中、后期相继把离子注入技术应
用于生物学领域的研究。我国在1986年，由中国科学院等
离子物理研究所余增亮等首先把离子注入这一高新技术应 用于农作物品种改良，并获得成。
1.菌种的选育 自然选育的一般步棸：
采 样 方法、地点、时间和周围环境记录
增 殖 培 养 纯 种 分 离
纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落： 1．稀释分离法 2．平板划线分离法 ⑴ 涂菌： ⑵ 划线分离：①分步划线法；②一次划线法： 3．组织分离法
纯
培
养
生产性能测 定
测定代谢产物或其它目的性状
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确定出发菌株 ↓ 菌种的纯化选优 ↓←出发菌株的性能鉴定 同步培养 ↓ 制备单细胞（或单孢子）悬液 ↓←活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 ↓ 诱变处理 ↓ 平板分离 ↓计形态变异的菌落数，计算突变率 挑取疑似突变菌落纯培养 ↓ 突变体的初步筛选 ↓←用简单快捷的方法 重复筛选 ↓←摇瓶发酵试验 选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处)
天然碱基贫乏时
在DNA复制时，需要吸收外源、 碱基以合成新的DNA分子时
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碱基类似物掺入 到DNA分子中
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1.菌种的选育 使用化学诱变剂的优缺点：
大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射 更有效。 化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适 的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸 气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并 要注意安全性。 大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常 谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入 其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接 接触就会过敏，这就更要当心。
因某种原因突变频率较高的情况，如细胞中DNA复
制产生错误时和细胞染色体外的质粒带有外来基因 时等。
工业生产过程中，为了维持菌种稳定的生产能力，
必须经常进行自然选育，纯化菌种，通过分离、筛 选排除低产、退化的菌株，相应提高群体的生产水 平。
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1.菌种的选育
微波辐射诱变育种 微波是一种频率在300MI-Iz到300GHz之间的电磁波，它 具有波动性、高频性、热特性和非热特性。它与生物组织的 相互作用主要表现为热效应和热效应。微波能够透射到生物
组织内部。使偶极分子和蛋白质的极性侧链以极高的频率振荡
增加分子的运动，导致热量的产生。微波还能够对氢键、疏水 键和范德华力产生作用，使其重新分配从而改变蛋白质 的构象与活性。 微波育种具有清洁、高效、操作简单、方法易行、世代 周期短等特点，克服了索外诱变易光修复，化学诱变毒性大
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
突变菌株的筛选： 1.菌种的选育
（2）抗药性菌株的筛选
抗性菌株有药物抗性突变株、抗噬菌体或细菌素的
突变株和抗物理因子突变株等。抗生素生产菌种选育时 常采用前体类似物或抗生素类似物。
微生物代谢产物对自身的生物合成具有调节作用。 因此抗生素抗性菌的自身抗性可有效地用来选育高产
1.菌种的选育 化学诱变因子
化学诱变剂中常用的是烷化剂，如氮芥、硫酸二乙酯等， 它们分别具有一个或多个活性烷基，能使DNA上的碱基烷 化或使烷化后的嘌呤失落、生成烷化磷酸基，也能使DNA 上的糖－磷酸间的链断裂或发生交联。 碱基类似物也是一类化学诱变剂，是一种分子结构与天 然碱基相类似的化合物，常用的有5－氟尿嘧啶（5FU)等。
书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 商丘师范学院·生物学教学论实验室
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育
涂成菌液薄层，在超净台中风干。制成风干皿。然后把 风干皿置于离子注入机的小靶室中。N+离子束辐照处理， N注入剂量分别为3x1014／cm2N+。5xl0n／cm2N+，7x10 tS／cmN能量3okeV。 离子束辐照处理后稀释涂平板。 离子注入集化学诱变、物理诱变为一体，具有正突 变体的高效性、菌体细胞表面刻蚀性、菌体存活曲线呈“ 马鞍型”等特点。加之离子束介导转基因的可能性。使其 在微生物育种中更具有目的性和针对性。随着研究程度的 深入，研究范围的拓宽，离子注入法在抗生素产生菌育 种中能发挥巨大的作用。
导入基因后 激活本来 沉默的基因
例子：抗生素生产菌种的分子育种、
书山有路勤为径，学海无涯苦作舟 商丘师范学院·生物学教学论实验室
第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育 突变菌株的筛选：
（1）营养缺陷型菌株的筛选
原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长 情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则 不生长，野生型都能生长，如抗生素法（细菌可以采 用青霉素，酵母采用制霉菌素）和菌丝过滤法。
质量沉积
电、能和质 的联合作用
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第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育 诱变育种的注意点：
单细胞或单孢子悬液的制备：进行合适培养基的培养，
离心、洗涤和过滤。 需要中间培养过程：突变尚未表现出来之前，有一个表
现延 迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延
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第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育
空间诱变育种 空间环境的主要特征是：长期微重力状态、空间辐
射、超真空和超洁净等。空间诱变是空间条件 处理微生
物诱变育种的有效方法。微生物的诱变育 种的直接应用 可以提高产量，改善菌种的有利性 状，创造新品种。实
诱变后的酵母菌细胞
含异烟肼的琼脂培养基
观察结果
结论：可能产生了能分解异烟肼酶的突变株，或者产生
了能合成更高浓度的吡哆醇，以克服异烟肼的竞争性抑 制的突变株。
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第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育 突变菌株的筛选：
（3）产量突变株的筛选 案例：春日霉素生产菌的筛选
琼脂块培养法
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第六章 菌种的选育、保藏和复壮
1.菌种的选育 突变菌株的筛选：
（4）抗噬菌体菌株的筛选 对目的菌种进行诱变 接种孢子悬夜 加入噬菌体原液 稳定性试验 确认目的菌株
迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个 过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。 出发菌株的选择：挑选对诱变剂敏感性大、变异幅度广 和产量高的为出发菌株。
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