(优选)菌种选育保藏与复壮
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
食用菌菌种关键技术创新与产业化应用
食用菌菌种关键技术创新与产业化应用
食用菌菌种关键技术创新与产业化应用是当前食用菌产业发展的重要方向。
以下是一些关键技术创新和产业化应用的例子：
1.菌种选育与改良：通过遗传学、分子生物学等现代生物技术手段，对食用菌菌种进
行选育和改良，提高菌种的生长速度、产量和品质。
例如，利用基因编辑技术，对食用菌菌种进行基因改造，使其具有更好的生长性能、抗逆性和营养品质。
2.菌种保藏与复壮：建立科学的菌种保藏和复壮技术体系，保证菌种的遗传稳定性和
生产性能。
例如，采用低温保藏、真空冷冻干燥保藏等方法，对菌种进行长期保存，并在需要时进行复壮，恢复其生产性能。
3.智能化栽培技术：利用物联网、大数据、人工智能等现代信息技术手段，实现食用
菌栽培的智能化管理。
例如，通过智能传感器监测温湿度、光照、CO2浓度等环境参数，自动调节温室环境，提高食用菌的生长速度和产量。
4.病虫害防治技术：研究和发展食用菌病虫害防治技术，减少化学农药的使用，保障
食用菌的安全性和品质。
例如，利用生物防治技术，引入天敌昆虫、微生物等自然控制因子，对食用菌病虫害进行生物防治。
在产业化应用方面，可以通过建立食用菌产业化基地、推广先进的栽培技术和管理模式、加强品牌建设等措施，推动食用菌产业的快速发展。
同时，还可以将食用菌产业与其他农业产业相结合，形成产业链和产业集群，提高整个农业产业的综合效益。
总之，食用菌菌种关键技术创新与产业化应用是推动食用菌产业发展的重要手段，可以提高食用菌的产量和品质，促进农业增效和农民增收，具有重要的现实意义和长远价值。
菌种的保藏与复壮
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
• (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的，如个别菌种在 脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达 99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时 死亡率大大减少。一般情况下，那些容 易保存的菌种对保护剂的要求不很严格， 而不易保存的菌种对保护剂的要求却很 苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干 燥保存菌种的关键因素。
(六)真空冷冻干燥法
• (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是 新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂， 用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养 基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种， 则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细 胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。 悬液中菌数要求达到10 8～10 10cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分 装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部， 装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六)真空冷冻干燥法
• (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-
30～40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水 乙醇冻5～10min。
• (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下， 并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加 速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。 干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂， 以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时 是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空 载时最高真空；样品温度与管外温度接近。 完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频 真空检测真空度。
微生物工程 - 03微生物育种及工业菌种退化复壮和保藏
微生物育种及工业菌种退化复壮和保藏方法一、代谢调控育种Metabolic Control Breeding１.营养缺陷型突变株（auxotroph mutant）•酶缺陷，结果造成中间产物积累；•解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；•渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末端产物少，中间产物积累。
2.抗反馈调节突变株（regulation defective mutant）突变株筛选•调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与不能结合或结合；•结合，但不发生作用；•结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；方法：末端产物结构类似物筛选；营养缺陷型回复突变株筛选．3.组成型突变株（constitutive mutant）筛选•突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。
•筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。
①加诱导酶合成抑制物②交替培养法③显色反应法４.抗（敏感）性突变株（resistant mutant）筛选•包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体①抗生素抗性突变：提高产量②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染③条件抗性突变：如温度，可提高产量④物敏突变：如氟乙酸敏感突变型，顺乌头酸酶活性极低，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。
二、基因重组育种（gene recombination breeding）基因重组育种的定义：是指采用接合、转化、转导、原生质体融合、有性杂交及准性生殖等遗传学方法和技术，使微生物细胞内发生基因重组，以增加优良性状的组合或者导致多倍体的出现，从而获得优良菌株的一种育种方法。
（P24第2段）1.原核生物的基因重组育种（1）接合（conjugation）定义；大肠杆菌的4种不同接合型菌株：F+、F-、Hfr菌株和F’菌株（2）转导（transduction）转导、转导子（transductant）、转导噬菌体（3）转化（transformation）转化、转化子（transformant）、感受态（competence）2.真核微生物的基因重组育种主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。
食用菌菌种的提纯与复壮
食用菌菌种的提纯与复壮
一、提纯。
用各种方法分离得到的菌种，在培养基上萌发的新菌丝，有的活力强，有的弱，有的往往带有杂菌，为避免在生产中失败，应提纯后再使用。
其方法是：1、多孢杂交的，于无菌区内将健壮、生长快的菌丝体挑起移接到经灭菌过的母种培养基上。
2、各种方法分离的，于无菌区内将生长快而健壮的菌丝的尖端部位挑取黄豆大小的菌丝体移接到经灭菌过和母种培养基上。
经过提纯的菌丝长满以后，即可供作生产使用。
二、复壮。
食用菌种长期在同一培养基上培养和保藏时间过长，均会导致菌丝生活力降低，为夺取食用菌高产，必须经过复壮才能用于生产，其方法是：1、菌种在低温保藏期间应每隔2到3个月移接一次。
2、菌丝在各种营养成分有限的同一培养基上长期培养，因欠缺某种成分而丧失活力，以导致菌种老化，应适时变换培养基成分和比例，既可增强菌种活力，促进良种复壮，又可提高菌种成活率。
- 1 -。
生产菌种的选育培养—菌种的扩大培养及保藏
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
《发酵食品工艺学》复习提纲2020
第二章菌种选育、保藏与复壮（一）复习思考题1、什么是菌种选育？优良菌种选育的方法主要有哪些？3、微生物菌种保藏的目的（3个）、原理（2点）及常用的保藏方法（7种）。
4、造成菌种退化的原因是什么？生产中如何防止菌种的退化？（二）生产工艺流程第三章微生物的代谢调控理论及其在食品发酵中的应用（一）复习思考题1、什么是微生物代谢？微生物代谢过程的自我调节主要表现在哪些环节上？3、微生物代谢的反馈调节作用主要有哪些类型？在发酵生产中如何克服微生物代谢的反馈调节作用？（1）类型：反馈抑制和反馈阻遏（2）措施：1.改变微生物的遗传特性；2. 控制发酵的工艺条件；3.改变细胞膜的渗透性4、什么是代谢控制发酵？在发酵生产中改变微生物遗传特性来调控代谢的方法有哪些？5、通过控制细胞膜渗透性来提高发酵产物产量的原理是什么？（二）生产工艺流程第四章发酵工程学基础（一）复习思考题6、根据你所学的发酵工艺学知识，简述补料分批发酵的主要应用领域有哪些？7、发酵过程中引起发酵液温度变化的因素有哪些？对发酵过程有何影响？生产上发酵温度选择的依据是什么？（1）因素：生物热、搅拌热、辐射热、蒸发热（2）影响：温度影响细胞酶的活性、发酵液的性质、代谢产物的合成方向。
（3）依据：综合考虑微生物最适生长温度、发酵产物生成、通气条件等因素。
8、发酵液中溶解氧浓度对发酵过程有何影响？生产上如何控制发酵液溶解氧浓度？（1）影响：溶氧过高会引起能量过度消耗并对细胞产生危害、抑制代谢产物的合成、影响培养基的电位；溶氧过低影响微生物的呼吸，造成代谢异常。
（2）措施：配置搅拌叶和挡板，分散气体；改变通气量和搅拌速度，控制溶氧速率；控制发酵液黏度，改变传质阻力。
9、发酵过程中引起发酵液pH变化的因素有哪些？对发酵过程有何影响？生产上如何控制发酵液pH？（1）因素：①引起发酵液pH下降的因素—碳源过多、消泡油加多、生理酸性物质过多；②引起发酵液pH上升的因素—氮源过多、生理碱性物质过多、中间补料时，碱性物质添加过多。
菌种的衰退复壮和保藏
2、菌种保藏方法
1）斜面菌种低温保藏法---利用低温对微生 物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。 把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液 等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一 般不超过3个月,到时必须进行移接传代, 再放回冰箱。
2）砂土管保藏法---将干燥砂粒与细土混合 后灭菌制成砂土管,然后接种保藏 。若把 砂土管放在低温或抽气后密封,效果更佳。 此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。 保藏期1～10年 3）石蜡油封藏法---向培养好的菌种斜面上, 加入灭菌石蜡油,高出斜面1cm,然后蜡封 管口,放入冰箱。该法既可防止培养基水 分蒸发,又能使菌种与空气隔绝。保藏期 1～ 2年
美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏 方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。
2、衰退的防止
（1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法
二、菌种的复壮
1、复壮的定义：
狭义复壮：指的是在菌种已在发生衰退的情况下，通 过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标，从 已衰退的群体中筛迁出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有的性状的相应措施。 广义的复壮：是一项积极的措施，即在菌种的典型特 征或生产性状尚未衰退前，主经常有意识地采服纯 种分离和生产性状的测定工作，以期众中选择到自 发的正变个体。
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退及其防治 1、衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种 原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 如原有形态性状变得不典型了，生长速度变慢， 代谢产物生产能力下降，致病菌对宿主侵染力 的下降，对外界不良条件包括低温、高温或噬 菌体侵染等抵抗能力的下降等。
3、菌种保藏中心
我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种 保藏管理委员会(CCCCM),
菌种的衰退、复壮和保藏
第五节菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。
因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
一、斜面冰箱保藏法一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。
保存期3月到6月。
二、沙土管保藏法适合于产孢子或芽孢的微生物。
首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。
一般沙80目，土80一100目。
其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。
或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。
保存期1年左右。
三、菌丝速冻法不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。
该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。
甘油最终浓度为25％。
操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。
四、石蜡油封存法向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。
此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。
保存期约1年五、真空冷冻干燥保藏法是目前国内外较理想的常用方法。
其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。
在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。
菌种可保存5年左右。
菌种复壮的方法
菌种复壮的方法菌种复壮是一种通过增强细菌的代谢活性和生长速度来增加其工业价值的方法。
这种方法可以为生物工艺学和生物技术工业提供更高效的微生物工具。
在工业中，微生物的发酵生产是一种重要的生物技术，因为微生物可以用来生产食品、药品、化学品等。
菌种复壮是一种有效的方法来提高微生物的生产效率和质量。
以下是一些菌种复壮的方法：1. 培养基优化培养基是微生物生长的基础。
优化培养基可以提高微生物的生长速度和代谢活性。
例如，调整pH值、添加营养物质、控制培养温度等都可以改善培养基的质量。
2. 培养条件调节微生物对环境的适应性很强，因此，调整培养条件也可以提高微生物的生长速度和代谢活性。
例如，调节氧气、碳源、氮源等可以改善微生物的生长条件。
3. 基因改造基因改造是一种改变微生物遗传信息的方法。
通过改变微生物的基因组，可以增加其代谢活性和生长速度。
例如，引入外源基因、删除负面基因等都可以改善微生物的性能。
4. 低温保藏低温保藏是一种延长微生物寿命的方法。
通过将微生物保存在低温环境中，可以延长其存活时间，同时保持其生物活性。
5. 免疫反应调节免疫反应调节是一种通过影响微生物免疫反应来提高其生产效率的方法。
例如，使用抗生素可以抑制微生物的免疫反应，从而提高其生产效率。
6. 适应性培养适应性培养是一种通过让微生物逐渐适应新环境来提高其适应性的方法。
例如，将微生物逐渐暴露在新的培养条件下，可以让其逐渐适应新环境，从而提高其生产效率。
以上就是一些常见的菌种复壮方法。
这些方法可以单独或联合使用，以提高微生物的生产效率和质量。
在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的方法，以达到最佳效果。
菌种的衰退、复壮及保藏
一、菌种的衰退与复壮
1. 衰退 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些 原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象。 衰退的原因：①基因突变 ②菌种不纯 ③ 培养条件不当 常见的衰退现象：
菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 代谢产物生产能力下降；
2. 原理： 选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞
等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难 以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、 缺营养 以及添加保护剂等）
3. 国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务 广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达 到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
菌种的复壮措施
①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑 取法等）。 ②通过寄主体内生长进行复壮（如杀螟杆菌的复壮）； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理 ，以杀死生命力较差的已衰退个体）。 ④联合复壮，用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍 联合处理
二、菌种保藏
1. 目的： ①存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种
2、 菌种的复壮
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分 离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的 个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经 常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产 性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从 生产中选种。
菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）
第六章 菌种复壮衰退及保藏(与“菌种”相关文档)共44张PPT
（5）采用有效的菌种保藏方法
菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。
（二）菌种的复壮（rejuvenation）
1. 定义
狭义的复壮：
是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型
性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出 少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施。
（3）淘汰已衰退的个体
S. microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢 子，采用－10～－30℃的低温处理5～7天，退 化的个体死亡，留下的10％～20％个体是未退 化的。
二、菌种的保藏
菌种（culture，stock culture）
是一种极其重要和珍贵的生物资源。
菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）
纯种分离的方法
粗放
“菌落纯”水平（pure culture in colony lever）
“菌株纯”水平（pure culture in strain lever）
精细
（2）通过宿主体复壮
针对病原菌
衰退的病原菌 接种
活的 “选择性培养基
”
相应的昆虫或动、植物宿主体内
多次选择
从典型的病灶部分分离到恢复原始独立的复壮菌株
（1）定期移植保藏法
操作方法：
将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生 长完全后，置普通冰箱4℃保藏，湿度50％～70％ 以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。
（国一立） 典国型内菌种收藏馆（NCTC）
抗东生京素 大菌学种应保用藏微管生理物中研心究所（TAM）
创微造生一 物个菌适落合形原态种或的个生体长形条态件的，变就化可；在一定程度上防止菌种衰退 ；
第二章菌种选育、保藏与复壮
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
❖ 控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 ❖ 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。 ❖ 选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状 ❖ 良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基） ❖ 采用不同类型的细胞进行接种
产孢子霉菌 细菌
二、菌种的复壮
❖ 自然选育的定义
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
发酵工程第2章2 菌种的选育与保藏
2.3传代保藏
将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的 生长温度下生长和保存的传代保藏方法。
可用于实验室中若干菌种的保藏。 此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。 但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。
2.3 传代培养法
实验原理：保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于 厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期 进行传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体 石蜡来进一步延长保存期。
冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常 用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等。
大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久 而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻 保藏，便于运输。
培养物的冻干过程
冷冻真空干燥操作流程
配制保护剂 灭菌
菌种 培养 制备菌悬液
分装安培瓶 预冻
真空干燥 测定水分
操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，
用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置 4C˚冰箱中包藏。
保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保 存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月， 假单胞菌两周传代一次。
此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易 被污染。
加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的 稳定性。
在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检 测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。
成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括：在 保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单 位)、细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征 应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中 试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极 为重要。
菌种保存方法和菌种的衰退复壮
菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
菌种复壮的原理及方法
菌种复壮的原理及方法从衰退的群体中寻找尚未衰退的个体，进行分离培养，达到恢复菌种优良性状的过程，称为菌种复壮。
在实际生产中，一般在菌种尚未退化之前进行菌种复壮。
1.菌种复壮的原理：自然界生物以遗传变异为基础通过自然选择得以进化。
变异提供了选择的基础，选择保存适应环境的个体，这些个体使优良特性得以遗传。
如此再变异、再选择、再遗传，循环往复，使生物得以不断进化。
2.菌种复壮方法：（1）菌丝尖端分离：挑取健壮菌丝体的顶端部分，进行纯化培养，使菌种恢复原有的生活力和优良种性，达到复壮的目的。
（2）适当更换培养基：长期使用同一培养基继代培养菌种，可能会使菌种生活力逐渐下降。
在菌种继代培养中，要经常改变培养基成分，在培养基中适当添加酵母膏、维生素等物质，以刺激菌丝生长，提高菌种活力。
（3）进行分离复壮：从栽培的群体中，找出尚未衰退表现的个体，通过组织分离获得菌种，进行提纯复壮。
采用菌丝体进行菌种复壮时，用无菌水将斜面上的菌丝稀释，再将菌丝体放入装有无菌蒸馏水的三角瓶中摇匀，然后转接到平板培养基上，使菌丝分布均匀，适宜条件培养至萌发成菌落。
从中挑选生长健壮的菌丝转接后作为母种。
需要进行栽培试验，如果复壮菌种与原来菌种性状一致，表明菌种得到复壮。
（4）定期进行菌种分离：对生产中应用的菌种，每1~2年分离1次，才能起到复壮的作用。
通常选择具本品种典型性状、生长健壮、无病虫害的子实体进行组织分离，重新获得生长旺盛、活力强的菌丝。
反复进行无性繁殖，也会造成菌种衰退。
可定期采集有性孢子通过单孢杂交或多孢杂交进行菌种复壮。
不管采用何种方法，得到的菌种只有经过出菇检验证明其性状优良后，才能在生产上应用。
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分解单宁、酶精制、酒精发酵工业 同枯草杆菌蛋白酶 葡萄糖制造、酒精厂糖化、医药 腐乳生产 蛋白除葡萄糖、脱氧、食品罐头贮存 淀粉和食品加工、饲料 食用、化工 葡萄糖制造、酒精厂糖化、调色剂
枯草芽孢杆菌
戊糖片球菌
植物乳杆菌
多粘类芽孢杆菌
酿酒酵母
粉状毕赤酵母
红葡萄浓缩汁中的酵母菌形态
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
（二）富集培养
❖ 生物诱变因子 噬菌体、转座子等
（二）诱变基本方法及影响因素
❖ 诱变剂的选择：作用机理；突变谱 ❖ 诱变剂量选择：最适剂量（致死率70-80%时） ❖ 增效（变）剂：氯化锂（0.5%） ❖ 外部环境条件：如温度、氧气、pH、水分 ❖ 出发菌株的选择：生产菌株、野生菌株 ❖ 出发菌株的生理状态：细菌--对数生长期；幼年孢子；营养体；湿态敏
（优选）菌种选育保藏与复壮
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第一节 食品发酵与酿造工业菌种
一、现代发酵工业对菌种的要求
（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；
（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；
（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；
（4）生长繁殖力强，速度快，较强产孢能力；
（5）原料广，价廉，易被微生物利用、转化；
① 富集培养的目的 利用人工环境，使样品中目标微生物成为优势菌。
② 富集培养的方法 控制培养基的营养成分 控制培养条件
③ 富集培养的方式 分批培养（Batch culture ） 连续培养（Continuous culture ） 分批补料培养（Fed-batch culture ）
（三）纯种分离
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溶磷细菌的平板筛选(5d)
高效溶磷的真菌菌株
青霉菌溶磷实验
（四）性能鉴定
❖ 生产性能测定
通常使用初筛和复筛的方法确定。直接从自然界分离
得到的菌株为野生型菌株。我们常将这些自然界中直
接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出
发菌株。 ❖ 毒性试验
若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。
感（真菌：106 cfu/mL孢子悬浮液；细菌：108 cfu/mL的菌液） ❖ 诱变效应的测定：直接法和浓缩法，培养后测定目的产物量 ❖ 诱变方法：单因子、复合诱变 ❖ 优良突变株的筛选方法：随机筛选或半理性化筛选
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
自 然 选 育
05年江南大学微生物(发酵)考研试题
资料显示，某些芽孢杆菌具有分解和利 用葡聚糖的能力，请设计方案从自然界中筛选 一产葡聚糖酶的菌株，并简要分析各主要步骤 的依据。
三、诱变育种
❖ 诱变育种：指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中， 使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的 突变株的过程。 提高了菌种发生突变的频率和变异幅度，提高获优机率。
❖ 突变：在自然状况下发生的突变—自然突变（10-6~10-9） ❖ 诱变：人为地利用物理或化学因素诱发的突变（10-4~10-5） ❖ 诱变剂：能够显著提高突变频率的物理或化学因素。
（一）常见诱变剂及作用基本原理
❖ 物理诱变因子 紫外线、X射线、快中子等
❖ 化学诱变因子 硫酸二乙酯（DES）、亚硝酸、 吖啶橙
菌种种属的鉴定
• 鉴定工作的内容
（1）测定一系列必要的鉴定指标； （2）查找权威鉴定手册，确定菌种类型。
• 鉴定方法
（1）经典的分类鉴定方法：形态学特征；生理生化特征； 血清学试验与噬菌体分型；氨基酸顺序和蛋白质分析
（2）现代分类鉴定方法：微生物遗传型；细胞化学成分； 数值分类法
二、自然选育
❖ 自然选育的定义
（1）平板划线分离法 （2）稀释分离法 （3）涂布分离法 （4）毛细管分离法 （5）小滴分离法
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初筛和复筛
（1）初筛（定性——粗放！） ① 平板筛选 （变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈 ） ② 摇瓶发酵筛选
（2）复筛（定量——精确！） 1个菌株重复3～5瓶，精确分析 如酶活力单位、耐酒精程度等。
产朊假丝酵母
黑曲霉
黑曲霉
青霉
米曲霉
蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等
根霉
绿色木霉
产生微晶纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
拟康氏木霉
产生纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
第二节 菌种选育
一、新菌种的分离与筛选
样品 采集
富集 培养
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
由葡萄糖制造果糖
医药、食用 酵母菌体蛋白 食品工业 食用、医药
（6）对添加的前体物质有耐受能力；
（7）菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强。
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二、现代发酵工业常见菌种
类别
细菌 酵母菌
霉菌
微生物名称 短杆菌 短杆菌 枯草杆菌 枯草杆菌 巨大芽孢杆
菌 酒精酵母 假丝酵母 脆壁酵母 黑曲霉
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌
样品来源越 广泛，获得 新菌种的可 能性越大。
利用人工环 境，使样品 中目标微生 物成为优势 菌。
纯种分离的 常用方法有 平板划线分 离法、稀释 分离法和涂 布分离法。
一般生产性 能的测定通 过初筛和复 筛的方法来 确定。
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。