亚热带不同林分土壤氨氧化菌群落特征_李永春

网络出版时间：2013-11-21 18:50
网络出版地址：/kcms/detail/21.1253.Q.20131121.1850.012.html
亚热带不同林分土壤氨氧化菌群落特征*
李永春1刘卜榕1,2郭帅1邬奇峰3秦华1吴家森1徐秋芳1**
(1浙江农林大学环境与资源学院浙江省森林生态系统碳循环与固碳减排重点实验室，浙江临安311300；2
江苏省射阳县农业委员会，江苏射阳224300；3 浙江省临安市农业技术推广中心，浙江临安 311300)
摘要为揭示亚热带不同森林类型对土壤氨氧化菌特征的影响，采用荧光定量PCR以及
PCR-DGGE技术研究了阔叶林、杉木林、马尾松林和毛竹林土壤氨氧化古菌和细菌丰度及
古菌群落结构特征。

结果表明：不同林分土壤中氨氧化古菌数量(1.62×106~1.88×107个·g-1
干土)高于相应土壤中的氨氧化细菌(2.41×105~4.36×105个·g-1干土)；毛竹林土壤氨氧化古
菌数量显著高于杉木林，而后者又显著高于阔叶林和马尾松林，但氨氧化细菌数量在不同
林分之间没有显著差异。

DGGE图谱分析表明，不同林分土壤中氨氧化古菌的物种有所差
异，且毛竹林和杉木林土壤古菌群落结构迥异。

氨氧化古菌在亚热带主要林分土壤中表现
出明显优势，且除植被类型外，土壤速效钾、pH和有机质是引起土壤氨氧化古菌群落结构
及多样性变异的主要因素。

关键词森林类型土壤氨氧化细菌氨氧化古菌丰度群落结构
中图分类号S154. 36
Characteristics of soil ammonia-oxidation microbial communities in different subtropical
forests, China. LI Yong-chun1, LIU Bu-rong1,2, GUO Shuai1, WU Qi-feng3, QIN Hua1, WU Jia-
sen1, XU Qiu-fang1(1Zhejiang Provincial Key Laboratory of Carbon Cycling in Forest
Ecosystems and Carbon Sequestration, School of Environmental and Resources, Zhejiang
Agriculture and Forestry University, Lin'an311300, Zhejiang, China; 2Sheyang Commission of
Agriculture, Sheyang 224300, Jiangsu, China; 3Lin'an Extending Station for Agricultural
Technique, Lin'an 311300, Zhejiang, China)
Abstract:To investigate the effects of different forest stands in subtropical China on the
communities of soil ammonia-oxidizing microorganisms, we characterized the abundance of
ammonia-oxidizing archaea (AOA) and bacteria (AOB), and the community structure of AOA in
soils under stands of broad-leaved (BF), Chinese fir (CF), Pinus massoniana(PF) and moso
bamboo (MB) forests using real-time quantitative PCR and denaturing gradient gel electrophoresis
(DGGE). The results showed that the AOA gene copy numbers (1.62×106-1.88×107 per gram of
dry soil) were significantly higher than those of AOB genes (2.41×105-4.36×105 per gram of dry
soil). Significantly higher soil AOA abundance was detected in the MB than that in the CF
(P<0.05), and the latter was significantly higher than that in the BF and PF soils (P<0.05). There
were no significant differences in the soil AOB abundance among the four forest stands. As
indicated by DGGE pattern, soil AOA species varied among the four forest stands. There was a
difference in the soil AOA communities between the CF and MB stands. The AOA demonstrated
a competitive advantage over the AOB in the soils under these major subtropical forests. Soil pH,
concentrations of soil available potassium and organic carbon as well as the forest type were the
main factors that influence the variation of AOA community structure and diversity.
Key words:forest type; soil; ammonia-oxidation bacteria (AOB); ammonia-oxidizing archaea
(AOA); abundance; community structure.
*国家自然科学基金项目(41271274)和浙江省自然科学基金项目(Y3100578)资助.
**通讯作者. E-mail: xuqiufang@
2013-05-13收稿, 2013-10-28接受.
氮素不仅是植物生长和发育所需的重要元素，也是植物从土壤中吸收最多的元素。

同时在森林土壤中，氮素相对于其他化学元素更容易从土壤中淋失或挥发[1]。

一般认为，氮
的有效性往往影响森林生态系统的生产力[2]，不同森林生态系统中氮循环与生产力之间存
在着相关性[3]。

在森林生态系统中，植物从土壤中吸收氮的主要形式为铵态氮和硝态氮，
由于许多植物表现出对硝态氮的偏好，导致森林土壤中硝化作用较为明显[4]。

以微生物为
媒介的氨氧化作用是硝化作用的初始步骤，也是生态系统氮循环中的中心环节和限速步骤
[5]。

自100多年前细菌氨氧化作用首次被发现以来[6]，人们对氮循环的微生物过程已有不少认识。

以往认为土壤硝化作用由氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)完成，近年来的研究表明，广泛分布在海洋、湖泊和土壤等多种生态系统中的氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)也参与了氨氧化过程[7-8]。

对氨氧化细菌和古菌生态特征的充分认识，将为环境质量变化提供预测、预警并为生态系统中氮元素的有效管理提供重要依据[5]。

在森林生态系统中，土壤的理化性质受凋落物、根活性和相关微气象因子的影响，其中树种组成起着决定性作用[9]。

不同林型的土壤生物学特性与其林木种植结构之间密切相关，这是因为林木生长代谢过程中所产生的凋落物对于森林生态系统的自肥作用起着关键作用[10]，林分凋落物成分直接影响土壤微生物区系和酶活性[11]。

由于针阔混交林和阔叶林的凋落物通常多于针叶林[12]，故这两种类型森林生态系统的自肥作用相对较强，碳氮含量明显高于针叶林土壤，其较丰富的生物多样性以及能量和营养环境有利于微生物的生存和繁殖；而杉木类针叶林的枯枝落叶含水量低、叶厚、酯溶性物质多、C/N值较大，不利于微生物利用[13]。

研究表明，土壤环境因子如铵浓度、温度[14]、施肥处理、pH[15-16]以及植被等对不同的氨氧化细菌及古菌种群均具有特异选择性，因此，氨氧化微生物作为潜在的土壤质量生物学指标受到广泛关注[5,17]。

我国亚热带森林面积达到250万km2，在全球森林生态系统中具有独特的植被类型及结构特征[18]。

前期研究证实，亚热带典型森林植被类型对土壤细菌群落结构有一定的影响[19]，但较少关注调控土壤N循环过程的氨氧化微生物特征。

研究亚热带不同森林类型土壤氨氧化菌，将有助于我们认识亚热带森林生态系统中氮循环过程，了解自然森林土壤的硝化作用。

因此，本文以亚热带地区典型的阔叶林、杉木林、马尾松林和毛竹林为研究对象，采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)及荧光定量PCR 方法，研究4种主要林分土壤氨氧化菌群落特征，以揭示不同植被类型对氨氧化菌群落结构及丰度的影响，探讨植物类型、土壤氨氧化菌群落结构及多样性与土壤氮素供应之间的相关关系，以期为造林树种合理搭配、构建健康稳定的生态系统提供理论依据。

1研究区域与研究方法
1.1 研究地概况
研究地位于浙江省临安市玲珑山(30°14′N，119°42′E)，海拔353 m。

年平均气温15.8 ℃，年均降水量1424 mm，无霜期236 d。

该区属中亚热带季风气候，温暖湿润，光照充足，雨量充沛，四季分明。

土壤为发育于凝灰岩的黄红壤。

1.2土壤样品采集与处理
为研究亚热带4种主要植被类型土壤氨氧化菌的群落特征，在母岩一致(钙质泥岩)但植被类型不同的林区，选择典型的阔叶林、杉木林、马尾松林和毛竹林4种林分，分别在每种林分的下坡位、中坡位、上坡位确定采样区，在采样区10 m×20 m范围内按X型确定8个样点，采集0~20 cm的土壤样品后按采样区混合均匀，4种林分共得到12个(4×3)混合土样。

样品采集区阔叶林、杉木林和马尾松林下均有丛生灌木，有蕨类植物。

毛竹林下植被很少，仅有稀疏的草本植物。

新鲜土样充分混匀后，去除大的石块和植物残体，过 2 mm钢筛后分为两份，一份立即冷冻干燥，用于提取土壤微生物DNA，供氨氧化微生物群落结构及定量分析使用；另一份于室内自然风干，研磨过筛后用于土壤基本理化性质分析。

1.3主要试剂与引物
PowerSoil TM总DNA提取试剂盒购于美国Mo Bio 公司；Taq DNA 聚合酶、SYBR®Premix ExTaqTM、pMD 18-T 载体、凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒均购于宝生物工程公司(TakaRa，大连)；荧光染料SYBR greenⅠ购于美国Invitrogen 公司；引物由生工生物工程( 上海) 有限公司合成。

1.4分析方法
1.4.1土壤化学性质土壤化学性质分析参照文献[20]进行。

土壤pH值采用1:5土水比，复合电极测定；有机质含量重铬酸钾-硫酸外加热法测定；碱解氮采用碱解扩散法；速效磷采用Bray法，盐酸-氟化铵溶液浸提，钼锑抗比色法测定；速效钾采用醋酸铵提取，火焰光度计测定。

不同林分土壤化学性质分析结果见表1。

表1玲珑山不同林分土壤化学性质
Table 1 Chemical property of different forest soils in Linglong Mountain
林分Forest stand pH(H2O)
有机质
Organic matter
(g·kg-1)
碱解氮
Hydrolyzed N
(mg·kg-1)
速效磷
Available P
(mg·kg-1)
速效钾
Available K
(mg·kg-1)
阔叶林Broad-leaved forest 4.16±0.01a 71.61±33.85a 207.36±77.1a 5.16±6.12a 96.67±20.82ab
杉木林Chinese fir forest 4.11±0.03a 48.40±4.38a 148.11±29.2a 3.89±1.01a 93.33±5.77b
马尾松Pinus massoniana forest 4.14±0.07a 76.96±29.25a 167.5±42.2a 3.08±1.29a 110.0±17.3a
毛竹林Moso bamboo forest 4.07±0.06a 56.52±1.34a 165.9±19.6a 1.62±0.24a 143.33±40.4ab
同列不同字母表示差异显著(P<0.05) Different letters in the same column meant significant difference at 0.05 level. 下同The same below.
1.4.2土壤总DNA提取及纯化采用PowerSoil TM总DNA提取试剂盒提取土壤总DNA，称取0.25 g 于-20 ℃保存的土壤样品，按试剂盒说明书进行土壤DNA提取；用1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA片段大小，提取后的DNA样品保存于-20 ℃下。

1.4.3土壤氨氧化古菌的DGGE分析氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的引物对分别为Arch-amoAF /Arch-amoAR[7]和amoA-1F /amoAr-2R[21]，其中，Arch-amoAR 在5'端加一段GC 夹: cgc ccg ccg cgc ccc gcg ccc ggc ccg ccg ccc ccg ccc c[22]。

使用Bio-Rad公司的S-1000 PCR仪对土壤总DNA进行扩增。

反应体系为：10×PCR缓冲液
2.5 μL，MgCl2(25mmol·L-1)2.0 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)2.0 μL，引物(10 μmol·L-1)各0.25 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，模板DNA 1.0 μL，用无菌双蒸水补足至25 μL。

PCR反应扩增程序见文献[7]。

待PCR结束后，取3 μL反应产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，检测产物及其长度。

采用Dcode TM通用突变检测系统(Bio-Rad)的氨氧化古菌amoA基因的PCR产物，在30%~60%的6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。

电泳前对PCR产物进行定量、校正，使上样量一致。

在60 ℃80 V条件下电泳13 h后，SYBR green Ⅰ染色30 min，染色结果用Gel Doc TM EQ (Bio-Rad) 凝胶成像系统成像，使用Quantity One 4.4软件(Bio-Rad) 进行图像分析。

1.4.4DNA的定量PCR 采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒，使用Bio-Rad CFX96 C1000TM Thermal Cycler仪器对土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌amoA基因进行荧光定量PCR扩增，每个样品3次重复。

荧光定量PCR反应体系25 μL，SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，引物(50 μmol·L-1)各0.2 μL，模板1.0 μL，无菌双蒸水补足至25 μL。

amoA基因荧光定量PCR条件：95 ℃预变性3 min；接着 95 ℃30 s；55 ℃30 s；72 ℃30 s。

氨氧化古菌amoA基因扩增时采用35个循环，氨氧化细菌则采用38个循环。

参照He等[15]的方法，以混合土样总DNA为模板进行氨氧化古菌和细菌的amoA基因PCR扩增。

qPCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，与pMD 18-T载体连接并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素平板上进行蓝白班筛选阳性克隆。

取部分阳性转化菌液送上海生工进行测序，作为氨氧化古菌和细菌荧光定量PCR分析的标准DNA。

质粒DNA浓度使用Nanodrop® ND-1000测定，amoA的基因拷贝数通过质粒的浓度进行计算。

以10倍梯度对重组质粒进行梯度稀释(10-3~10-9)，每个稀释度3次重复，荧光定量PCR扩增获得氨氧化古菌和细菌的amoA基因标准曲线。

扩增效率＞85%，溶解曲线为单一峰，细菌和古菌amoA基因的qPCR相关系数分别为0.997和0.994。

1.5数据处理与统计分析
采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理，使用LSD法多重比较检验差异显著性。

利用Quantity One 4.4软件进行DGGE图谱分析，并采用未加权算术平均对群法(unweighted pair-group method using arithmetic averages, UPGMA) 法对DGGE图谱进行聚类分析，运用Dice Coefficient法根据电泳图谱对样品进行相似性分析。

使用Shannon多样性指数(H)、Margalef丰富度指数(D)以及Pielou均匀度指数(E)对氨氧化古菌微生物群落多样性进行分析[23]，其计算公式为：
H= -∑(n i/N)lg(n i/N)
D=(S-1)/ln N
E=H/ln S
式中：n i为每条电泳条带光密度峰值；N是同一泳道中所有条带光密度峰值总和。

电泳条带光密度的峰值通过分析软件Quantity one 进行读取。

S为每一泳道总的条带数。

使用CANOCO 4.5.1软件(Microcomputer Power, Ithaca, USA)对DGGE结果揭示的氨氧化古菌群落结构进行主成分分析(PCA)，并结合环境参数进行冗余分析(RDA)。

2结果与分析
2.1 不同林分土壤氨氧化菌amo A基因丰度
采用荧光定量PCR检测4种林分土壤氨氧化古菌和细菌的数量变化，根据标准曲线计算出土壤中氨氧化古菌和氨氧化细菌的拷贝数量。

由图1可以看出，4种林分土壤氨氧化古菌amoA基因拷贝数在1.62×106~1.88×107copies·g-1干土，氨氧化细菌amoA基因拷贝数则处于2.41×105~4.36×105copies·g-1干土。

土壤氨氧化古菌amoA基因的拷贝数在4种林分之间差异明显，毛竹林显著高于其他3种林分(P<0.05)，同时杉木林又显著高于阔叶林和马尾松林(P<0.05)。

而4种林分土壤氨氧化细菌amoA基因的拷贝数之间并没有显著差异，其中毛竹林土壤氨氧化细菌数量相对较高。

玲珑山4种林分土壤均具有较高的氨氧化古菌
图
林
2.2
2a)，但氨氧化细菌则经反复试验后仍未得到清晰的扩增条带。

统计结果表明，玲珑山不同林分土壤中氨氧化古菌种群相对丰富，阔叶林土壤样品平均有20条条带，杉木林有20条，马尾松林为21条，毛竹林最少，为18条。

4种林分共出现36条不同位置的条带，比较各不同林分之间的条带，发现4种林分共有3条共性条带(条带1、6和15)，另外条带2、11和27也是多数样品的共性条带，说明不同森林植被下土壤氨氧化古菌物种的差异比较明显。

图2玲珑山4种林分土壤氨氧化古菌群落的DGGE分析(a)以及条带图谱的聚类分析(b)
Fig.2 DGGE analysis (a) and cluster analysis (b) of AOA amoA gene in different forest soils of Linglong Mountain.
图中数字代表DGGE条带The number represented DGGE band. 下同The same below.
以杉木林CF1样品为基准，应用Quantity one 软件分析DGGE图谱，与基准样品相似度越高，说明古菌群落结构越相似。

结果表明，同一林分的CF2和CF3样品与基准样最为相近，表明重复性较好。

从图2b可以看出，杉木林与毛竹林土壤的氨氧化古菌群落结构相似度最低。

总体来说，阔叶林和马尾松林自身的3个重复之间相似度较低，而杉木林和毛竹林的3个重复之间相似度较高。

通过未加权算术平均对群法(UPGMA)进行聚类分析表明，12个样品归为一类的相似值仅为0.43，4种林分中仅杉木林和毛竹林的3个重复各自归为一类，说明其同一林分的土壤样品氨氧化古菌的群落结构较相似，同时这两种植被对土壤氨氧化古菌的影响比阔叶林和马尾松林大。

为更进一步考察不同林分土壤古菌群落之间的相对相似度，进行了基于DGGE条带位置和相对光密度值的主成分分析(PCA)。

主成分1和2对氨氧化古菌群落变异的解释量分别为28.7%和20.4%(图3)，杉木林和毛竹林的3个样品分别聚在一起，且与阔叶林和马尾松林的样品明显分开。

图3玲珑山4种林分土壤氨氧化古菌功能基因片段的DGGE条带图谱的主成分分析
Fig.3 Principal component analysis (PCA) of DGGE bands of AOA amoA gene profiles from different forest soils of Linglong Mountain.
Shannon指数反映了群落中物种的变化度或差异度，受样本总数和均匀度的影响，一般来说，物种丰富度高且分布较均匀的群落的Shannon指数较高。

对玲珑山4种林分土壤氨氧化古菌的DGGE条带进行的多样性指数分析发现(表2)，不同林分之间古菌多样性没有显著差异，马尾松林土壤古菌的多样性相对高于其他3种林分。

表 2玲珑山不同林分氨氧化古菌功能基因片段的DGGE条带图谱多样性指数
Table 2Diversity indices of DGGE bands of AOA amoA gene profiles from different forest soils of Linglong Mountain.
林分Forest stand Shannon指数
Shannon index (H)
丰富度指数
Richness index (D)
均匀度指数
Evenness index (E)
阔叶林Broad-leaved forest 2.936a0.99a 1.794a
杉木林Chinese fir forest 2.945a0.992a 1.795a
马尾松林Pinus massoniana forest 3.016a0.992a 1.962a
毛竹林 Moso bamboo forest 2.861a0.99a 1.653a
2.3 土壤性质对4种林分土壤氨氧化古菌群落结构的影响
以4种林分土壤氨氧化古菌的DGGE条带和土壤化学性质为两个变量组，进行冗余分析(RDA)。

从图4可以看出，土壤速效钾、pH和有机质是引起土壤氨氧化古菌群落结构及多样性变异的主要因素，其中速效钾对古菌群落结构的影响达到显著水平(P<0.05)，而碱解氮的影响最小。

杉木林受土壤速效磷影响较大；马尾松林受土壤有机质影响较大；毛竹林受土壤速效钾的影响较大；阔叶林受到除速效钾以外的其它因子的影响，且不同环境因子对古菌群落的影响有所差异。

RDA分析结果显示，第一排序轴(Axis 1)解释了样本中42.9%的变异，第二排序轴(Axis 2)解释了样本中27.6%的变异，两者合并解释了样本70.5%的总变异。

图 4氨氧化古菌功能基因片段的DGGE条带与土壤性质的冗余分析
Fig.4 RDA of amoA gene banding profiles of AOA and soil chemistry properties.
AK: 速效钾Available K; OM: 有机质Organic matter; AP: 速效磷Available P; HN: 碱解氮Hydrolyzed N.
3 讨论
氨氧化古菌和细菌能对各种环境条件的变化产生不同的响应，可作为潜在的环境条件变化的重要指标[5]。

通过荧光定量PCR手段研究自然环境中氨氧化菌关键功能基因amoA 拷贝数，发现氨氧化古菌数量通常高于氨氧化细菌，且相差几个数量级[24]。

Leininger等[25]首次报道了细菌和古菌关键功能基因amoA的相对丰度，发现多数土壤中硝化古菌数量多
于细菌；最近的研究也表明，农田土壤硝化古菌amoA基因约为细菌amoA数量的几十到上千倍[26]。

但是在森林土壤中目前相关研究不多[27]，本研究结果显示，在玲珑山不同林分土壤中，氨氧化古菌amoA基因拷贝数在1.62×106~1.88×107copies·g-1干土之间，明显高于相应土壤中细菌amoA数量(2.41×105~4.36×105 copies·g-1干土)，且在数量级上存在差异。

在典型的微生物群落中，氨氧化细菌所占的比例<0.1%[28]，相比之下，在低pH、贫瘠土壤中，氨氧化古菌不论是在数量、多样性及其栖居范围各方面都胜于氨氧化细菌[5]。

由此可见，与氨氧化细菌相比，氨氧化古菌在亚热带主要林分土壤中表现出明显优势。

环境的pH高低会影响氨的存在形态，有检测表明氨氧化细菌的生长速率及代谢在pH 低于7时有所降低[29]，氨氧化细菌的适合生长酸度范围是pH7.0~8.5，当pH小于6.5时，多数氨氧化细菌难以生长，这可能是因为NH3会在低pH条件下转变成NH4+，影响了氨氧化细菌对底物氨的吸收[30]。

本文中4种林分土壤pH值在4.07~4.16，通过荧光定量PCR手段尚能检测到氨氧化细菌，但由于数量较少，普通的PCR扩增并未能得到理想的结果。

同时，pH是影响古菌amoA基因拷贝数的环境因子[15]。

Nicol等[16]发现，在土壤pH值为4.9~7.5时，随土壤pH值的降低，氨氧化古菌的amoA基因的拷贝数以及表达活性反而升高，而碱性土壤中，pH值(8.3~8.7)对氨氧化古菌的丰度和群落结构没有显著影响[31]。

因此，酸性土壤中的硝化作用可能主要由氨氧化古菌来承担，本文的结果也在一定程度上印证了该推论。

研究表明，不同覆被类型林地土壤微生物和细菌的相对生物量大小均表现为针阔混交林>阔叶林>针叶林[32]。

而本文中土壤氨氧化古菌的数目，毛竹林显著高于杉木林，二者又显著高其他两种林分。

毛竹特有的地下鞭系统生物量大，每年都有老鞭死亡、腐烂，从而补充了土壤碳库，使得毛竹林土壤的自肥能力强于一般针叶林土壤[33]。

此外，该区域毛竹林是毛竹入侵阔叶林、逐渐替代阔叶林后形成的，成林历史仅有30多年，而土壤有机质的循环缓慢，可能阔叶林碳源还存在于毛竹林土壤中，因此毛竹林地的碳源比阔叶林更为丰富些。

而杉木林由于其根系分泌出酚类物质以及枯枝落叶的分解导致土壤pH降低，反而可能有利于氨氧化古菌生长。

与此同时，毛竹林和杉木林的氨氧化古菌群落结构也迥异于阔叶林和马尾松林，暗示毛竹林和杉木林土壤中硝化潜力较高且氮循环活跃。

本研究采用冗余分析方法探讨了环境因子对土壤氨氧化古菌群落结构的影响，发现土壤速效钾、pH 和有机质是引起土壤氨氧化古菌群落结构及多样性变异的主要因素。

但氨氧化古菌和细菌群落在不同林分土壤硝化过程中的作用尚不清楚，氨氧化古菌群落对增加氨氧化速率的贡献也有待于进一步研究，这些都对合理搭配亚热带地区造林树种、构建健康稳定的生态系统具有重要的意义。

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作者简介李永春，男，1979年生，博士，讲师. 主要从事土壤与环境微生物学研究，发表论文10余篇. E-mail: yongchun101@
责任编辑肖红。