雌激素受体α异构体在子宫内膜癌组织中表达及与肿瘤预后的相关性分析

雌激素受体α异构体在子宫内膜癌组织中表达及与肿瘤预后
的相关性分析
欧阳一芹;杨敏;李莉;李怀芳;童晓文;高阗;朱新贤
【摘要】目的探讨雌激素受体α (ERα)不同异构体在子宫内膜癌(EC)中的生物学作用及对EC患者预后的影响.方法对116例雌激素依赖型EC患者进行回顾性研究,分析EC组织中ERα表达谱与肿瘤临床病理指标、预后的相关性.采用Real-Time PCR检测患者肿瘤组织石蜡切片中RNA的目标基因表达量.结果ERα表达与EC的分化程度(rs=-0.214,Spearman's test)、淋巴转移(rs=-
0.186,Spearman's test)及国际妇产科联盟(FIGO)分期(rs=-0.221,Spearman's test)相关.ERα7号外显子缺失表型(Δ7)是表达量最多的一种异构体,其表达量与肿瘤的分化及FIGO分期相关,且Δ7表达量高者较表达量低者预后佳(疾病特异性生存率P=0.026,疾病无进展生存率P=0.038).结论ERαΔ7异构体的表达是决定EC 预后的独立危险因子,影响肿瘤患者预后.
【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2014(034)003
【总页数】5页(P338-342)
【关键词】子宫内膜癌;雌激素受体;预后
【作者】欧阳一芹;杨敏;李莉;李怀芳;童晓文;高阗;朱新贤
【作者单位】同济大学附属同济医院妇产科,上海200065;同济大学医学院,上海200092;同济大学附属同济医院妇产科,上海200065;同济大学附属同济医院妇产
科,上海200065;同济大学附属同济医院妇产科,上海200065;同济大学附属同济医
院妇产科,上海200065;同济大学附属同济医院妇产科,上海200065
【正文语种】中文
【中图分类】R737.33
子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)是常见的妇科恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤
的6%［1］。

其发病率为每年15～20/10万女性，通常发病于围绝经期及绝经后女性。

约89%的病例是65～69岁女性［2，3］。

尽管其平均5年生存率较前改善，但一些特殊病理类型、临床分期晚的EC预后仍很差［4］。

按分化程度由高
到低5年生存率分别为87%、75%及58%［5］。

国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期Ⅰ～Ⅳ期的EC，其5年生存率从85%～90%依次递减至20%～25%［6］。

EC通常被分为雌激素依赖型(Ⅰ型EC)及雌激素非依赖型［7］。

Ⅰ型EC通常发生在较为年轻、肥胖及围绝经
期女性，发病基础往往是体内有雌激素过度表达。

目前关于EC组织中雌激素受体α(estrogen receptor α，ERα)不同异构体表达谱及其与肿瘤预后相关的研究较少。

尽管其发病的分子生物学基础并不明朗，但有一点较明确:从正常内膜到癌症的转
化包含了从正常到癌前组织到癌的阶梯性变化。

且有多个基因(包括细胞增殖基因、血管形成基因及细胞凋亡基因)的变异导致细胞增殖，凋亡抑制，肿瘤新生血管形
成等［8］。

Ⅰ型EC与雌激素的关系表明，若肿瘤细胞缺乏ERα则其分化及预后往往不良。

目前已知在正常组织及癌组织中ERα的表达包含了其各种异构体，且
与其野生型不同，其不同异构体能起到不同的生物学作用。

本研究通过检查EC组织中ERα表达谱，了解ERα不同异构体对EC预后的影响。

1 材料与方法
1.1 病理资料及标本
回顾性分析2003—2012年在同济医院行子宫及双附件切除的116名EC患者临
床及预后资料(淋巴结的切除按照临床病理类型及分期而定)，患者病理分期及类型由病理科按照WHO(2003)分类体系分类，分为高分化(G1)(n=33)、中分化
(G2)(n=59)和低分化(G3)(n=24)。

以肿瘤组织石蜡切片作为实验材料。

1.2 RNA提取及cDNA合成
切片总RNA提取用High Pure RNA Paraffin试剂盒(Roche)，按照说明书进行。

每个提取的RNA样本均用2.0 U DNaseⅠ(Roche)消化45 min降低基因组DNA 的污染。

RNA质量控制在OD260/OD280＞1.7。

以2 μg纯化的RNA被用于合
成cDNA，M-MLV逆转录酶(Promega)及10 pmol/L random hexamer引物(New England Biolabs GmbH)用于逆转录。

1.3 Real-time PCR
因ERα 1号外显子在各种异构体中均有表达，因此我们将ERα standard引物设
计在ERα1号外显子处。

Δ代表缺失，ERα外显子缺失异构体均用Δ加对应的外
显子号码表示，如4号外显子缺失表型为ERα Δ4。

为避免基因组DNA对结果的影响，实验将引物设计在各外显子的连接部位，使用在线设计程序自行设计，PCR 产物进行了测序，确认引物正确性［9］。

Real-Time PCR反应运用体系运用Quanti-Tect SYBR GreenPCR试剂盒(Qiagen)，Real-time PCR反应体系20 μL，反应条件:95℃ 10 s预变性，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共 45个循环。

Real-time PCR反应在Mastercycler eppendorf realplexdetection
system(Eppendorf)机器上进行。

研究选取RPS18作为Real-Time PCR的内参。

比较并用以下公式算出相对表达量:Ratio=2-［CtTarget-CtHKG］［10］。

1.4 统计学处理
Real-Time PCR结果与患者临床病理结果相关性研究运用Spearman's相关分析
及Kruskal-Wallis H test.各个指标对患者预后的影响运用Kaplan-Meier life-table curves分析。

P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
2.1 ERα及其异构体在EC患者中表达情况
ERα免疫组化病例切片见图1。

Real-Time PCR ERα及其异构体表达情况:ERαstandard mRNA在87例(75%)患者中表达。

所检测的各种ER异构体均能在组织中检测出相应的mRNA。

ERα standard mRNA表达阳性的患者中ERαΔ4 mRNA在22个(25.3%)标本中表达阳性，Δ6在8个(9.2%)样本中表达阳性。

Δ7
在71个(81.6%)标本中表达阳性。

Δ4-7在43个(49.4%)样本中表达阳性，Δ6-7
在5个(5.7%)样本中表达阳性。

ERα mRNA含量同EC的分化情况(rs=-0.243，Spearman's test)、淋巴结转移(rs=-0.186，Spearman's test)和FIGO分期(rs= -0.211，Spearman's test)呈负相关。

71例患者肿瘤组织石蜡切片中含有Δ7 mRNA，说明Δ7是表达最为多的一种缺
失异构体。

内膜癌中高分化患者与低分化患者Δ7 mRNA表达量差别有统计学意义:ERα的表达量及Δ7异构体的表达情况与肿瘤的分化程度均成负相关(P＜
0.001)。

但中分化与高分化间差别无统计学意义。

同时FIGO分期Ⅰ/Ⅱ的组织中
Δ7 mRNA含量较FIGO分期Ⅲ/Ⅳ期的高。

因ERα standard阳性标本的平均mRNA水平为0.81，以此为界ERαstandard无表达为0，≤0.81为表达水平1，＞0.81为表达水平2。

Kaplan-Meier生存曲线显示ERα mRAN含量高低与内膜癌疾病无进展生存率相关性(图2)。

ERα mRNA(阳性VS阴性):ERα mRNA阳性的患者其疾病特异性生存率及疾病无进展生存率均较ERα mRNA阴性的患者高。

其中两者在疾病无进展生存率的方面差别有统计学意义(P=0.035)。

2.2 ERα Δ7 mRNA水平与EC相关性
Δ7 mRNA表达水平与肿瘤的分化程度呈反比(rs=-0.214，Spearman's test)，与
淋巴转移呈反比(rs=-0.186，Spearman's test)，与FIGO分期呈反比(rs=-0.221，Spearman's test)。

Δ7相对于ERα表达率也得出同样的结果:包括中/高分化EC
与低分化EC中的差别(rs=-0.213，Spearman's test)，FIGOⅠ/Ⅱ与FIGOⅢ/Ⅳ
对比 (rs=-0.218，Spearman's test)，与淋巴结转移同样呈反比(rs= -0.270，Spearman's test)。

Δ7mRNA表达量在EC不同分化程度及FIGO分期组间的差异有统计学意义:分化
程度高的较分化程度低的EC患者，Δ7 mRNA表达高(P=0.008，Mann-Whitney U test)，分化程度中等的EC患者Δ7 mRNA表达亦较分化程度低的 EC 患者高(P= 0.003，Mann-Whitney U test)。

FIGOⅠ/Ⅱ期的患者较FIGOⅢ/Ⅳ
期患者，Δ7 mRNA表达高(P=0.040，Mann-Whitney U test)。

Δ7 mRNA阳性的标本其Δ7 mRNA平均水平为0.8，界定Δ7 mRNA水平0:无
法检测出Δ7 mRNA;水平1:Δ7 mRNA量≤0.80;水平2:Δ7 mRNA量＞0.80，以
上界定利于生存曲线分析。

Kaplan-Meier生存曲线显示对于有Δ7 mRNA表达的患者群中，Δ7 mRNA含量越高生存率越高。

Δ7 mRNA(阳性VS阴性):比较Δ7 mRNA表达阳性的患者与表达阴性的患者，可见表达阳性的患者其总的生存率及
疾病无进展生存率较总的人群高(图3)。

在ERΔ7阳性的患者群中，ERΔ7的含量
与患者总生存率及疾病无进展生存率相关，且两者的差别均有统计学意义
(P=0.026，P=0.038，图4)。

图1 ERα免疫组化病理切片×400Fig 1 Immunohistochemical staining of ERα in EC tissue ×400注:A.子宫内膜癌组织1中ERα表达情况，细胞核染为棕色;B.
子宫内膜癌组织2中ERα表达情况，细胞核染为棕色
图2 ERα阳性与ERα阴性患者的Kaplan-M eier生存曲线Fig 2 Kaplan-Meier survival curve of ERα positive and negative pat ients注:A.疾病特异性生存率;B.疾病无进展生存率。

图3 ERα Δ7的Kaplan-Meier生存曲线Fig 3 Kaplan-Meier survival curve of ERΔ7注:A.疾病特异性生存率;B.疾病无进展生存率。

图4 Δ7 m RNA阳性标本Kap lan-M eier生存曲线Fig 4 Kaplan-Meier survival curve of Δ7 mRNA positive patients注:A.疾病特异性生存率;B.疾病无进展生存率。

2.3 其他类型ERα外显子缺失表型
统计分析Δ4，Δ6，Δ4-7及Δ6-7等四种表型，发现此几种异构体与EC临床病理资料无明显相关性。

3 讨论
Ⅰ型EC发病的病理基础往往为子宫内膜增生，其肿瘤分化及5年生存率均较雌激素非依赖型EC好。

尽管分子病理学改变并不清楚，但是与其他恶性肿瘤一样，从正常内膜到癌症的转化包含了多种基因的变化，包括细胞增殖及凋亡的异常，肿瘤新生血管的形成等［11］。

Ⅰ型 EC的预后与其表达ERα相关。

其表达ERα的量及类型决定了肿瘤的形成、发展及预后。

ERα在正常组织及肿瘤组织中的表达是其不同表型的综合，不同表型α的ER与野生型ERα均能结合发挥作用，但不同异构体在体内发挥的作用可能迥异。

例如:ERαΔ7是最常见的异构体，其表达的蛋白缺失ERα AF-2结构域，因此不能结合雌激素［12，13］。

Δ7在增生期内膜中的表达量较分泌期内膜多［14］，且在中高分化的内膜癌组织中表达量较低分化组织中多［15］。

ERαΔ5在正常内膜中无表达，但是在内膜癌组织中表达量较增生内膜组织中明显增加［15］。

实际上，Δ5能在缺乏雌激素的情况下持续地激活雌激素受体调控的基因［16，17］，其过度表达可导致子宫内膜不断增生。

尽管ERα的表达与EC预后相关，但其在癌肿中的意义，与临床病理资料的相关性研究仍少。

本实验揭示了雌激素受体异构体的表达情况及其与肿瘤的相关性。

Δ7是ERα常见的异构体，对于肿瘤的临床病理资料及预后的相关性仍未知。

Gotteland等［18］在正常乳腺组织及乳腺肿瘤中发现 ERα mRNA的不同异构体，他们相信ERα mRNA的不同异构体的形成与RNA剪接相关。

研究［12］显示对于激素依赖型内膜癌，Δ7表达量高者较表达量低者预后佳，同时对于Δ7均
呈阳性的患者群，高表达的较低表达的预后好。

本研究显示雌激素受体的表达是决定EC预后的独立危险因子，不同类型的异构体表达谱可能决定肿瘤的预后。

两种RNA剪辑因子hnRNP G及hTra2β1在EC预后中起相反的作用，不排除RNA剪接因子作为基因调控的因子通过其靶基因的变化控制肿瘤的生物学行为影响患者预后。

实验结果为进一步研究不同RNA剪接因子对EC的靶基因作用机制提供了新的实验依据。

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