风湿性心房颤动患者calpainⅠcalpastatin和caspase3与细胞凋亡的关系及其作用

·心房颤动研究·
风湿性心房颤动患者calpain-Ⅰ/calpastatin
和caspase-3与细胞凋亡的关系及其作用
陈运清王琳苏晞陶凉陈绪发
【摘要】目的检测在风湿性心脏病心房颤动（房颤）患者左心房中calpain-Ⅰ、calpastatin和
caspase-3的含量以及细胞凋亡的发生率，探讨它们之间的相互关系，研究它们在房颤发病机制中的
作用。

方法选择接受外科换瓣手术的风湿性心脏病患者共43例，分为三组；其中窦性心律组
15例，阵发性房颤（阵发房颤）组8例，永久性房颤（永久房颤）组20例。

在外科手术中取左心房组
织，应用免疫印迹法测定各组患者的calpain-Ⅰ、calpastatin和caspase-3的蛋白含量；应用TUNEL法检
测各组患者左心房肌细胞凋亡，计算其凋亡指数（AI），分析比较它们之间的关系。

结果与窦性心
律组比较：（1）永久房颤组的calpain-Ⅰ含量增加到（344.0±101.9）%，caspase-3含量增加到
（394.0±99.4）%（P<0.01），calpastatin含量降低到（27.0±12.8）%（P<0.01）；而阵发房颤组的各
蛋白含量则无明显变化；（2）永久房颤组左心房心肌细胞AI为（24.6±9.1）%，明显升高（P<0.01）；
（3）在永久房颤组中，calpain-Ⅰ和caspase-3的蛋白含量及AI分别与左心房内径、房颤持续时间呈明
显正相关（P<0.05～0.01）；calpastatin的蛋白含量却分别与两者呈明显负相关（P=0.007，P=
0.001）；（4）calpain-Ⅰ的含量分别与caspase-3的含量、AI呈明显正相关（均为P<0.01）；而
calpastatin的含量分别与calpain-Ⅰ、caspase-3的含量明显负相关（均为P<0.01）。

结论永久房颤
时，左心房组织心肌细胞凋亡增加，calpain-Ⅰ、caspase-3、calpastatin蛋白表达出现变化，并且它们之间
关系密切、相互影响，可能形成一个体系，使心房结构和功能改变，促使房颤发生和持续存在，可能是
房颤发病的重要机制之一。

【关键词】心房颤动；细胞凋亡；卡配因；蛋白酶抑制药；半胱氨酸内肽酶类
Calpain-!，calpastatin，caspase-3and apoptosis in the human left atrium in rheumatic atrial
fibrillation CHEN Yun-qing*，WANG Lin，SU Xi，TAO Liang，CHEN Xu-fa.*Department of
Cardiology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，
Wuhan430030，China（The present address：Department of Cardiology，Wuhan Asia Heart Hospital，430022，
China）
【Abstract】Objective The aim of the present study was to detect the expression of calpain-Ⅰ，
calpastatin，caspase-3and apoptosis in the left atria of patients with rheumatic heart disease（RHD），and to
find the association of these factors.Also，it was intended to investigate the effect of the above factors on the
mechanism of atrial fibrillation（AF）.Methods43patients with RHD undergoing valve-replacement were
included，15patients with regular sinus rhythm（Group RSR），8patients with paroxysmal AF（Group AF1）
and20patients with permanent AF（Group AF2）.Western blot was used to examine the content of calpain-
Ⅰ，caspase-3and calpastatin.The apoptosis index（AI）was measured by TUNEL.Results（1）
Expression of calpain-Ⅰin group AF2was increased to（344.0±101.9）%，and caspase-3was increased
to（394.0±99.4）%compared to group RSR（P<0.01，respectively）.Amount of calpastatin was reduced
to（27.0±12.8）%（P<0.01）.The expressions of these proteins were unchanged in group AF1.（2）AI
in group AF2was higher than that in groups RSR and AF1（P<0.01）.（3）In group AF2，the levels of
calpain-Ⅰ，caspase-3and AI were positively relative to left atrial dimension and AF duration，P<0.05-
0.01，respectively，whereas calpastatin was negatively correlated with left atrial dimension and AF duration
（P=0.007and P=0.001，respectively）.（4）The protein content of calpain-Ⅰwas positively related with
that of caspase-3and AI（P<0.01，respectively），and the content of calpastatin was negatively related with
that of calpain-Ⅰand caspase-3（P<0.01，respectively）.Conclusions Apoptosis of atrial cell increased
in left atria and the protein contents of calpain-Ⅰ，caspase-3and calpastatin significantly altered during AF
作者单位：430030武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科［陈运清（现在武汉亚洲心脏病医院
心内科，430022）、王琳］；武汉亚洲心脏病医院心内科（苏晞），心外科（陶凉、陈绪发）
in humans with RHD.The observed interactions suggest that these factors compose a system to cause the structural remodeling and dysfunction of atria.The course may play a key role in promoting the onset and maintenance of AF.
【Key words 】 Atrial fibrillation ； Apoptosis ； Calpain ； Protease inhibitors ； Cysteine endopeptidases
心房颤动（房颤）是临床上较为常见的一种心律失常，常常导致心排出量下降和栓塞事件出现。

目前，许多研究认为心房电生理重构和结构重构是
房颤发病机制的两大重要内容［1，2］。

心房结构和功
能的改变无疑是房颤发病和维持的滋生地。

calpains 和caspases 是半胱氨酸蛋白酶中的两大类。

calpains 的激活将降解细胞的骨架蛋白并参与细胞
凋亡过程［3，4］。

calpastatin 是calpains 的内源性阻滞
蛋白，伴随着calpains 无处不在。

caspases 的一个重要功能是促进细胞凋亡。

calpain-Ⅰ是calpains 家族中最具有代表性的蛋白激酶。

有研究报道，在房颤
的右心房组织中细胞凋亡增加
［5］
，并检测到它的激活，与房颤的发病关系密切［6］。

还有报道，在细胞
凋亡时caspases 介导裂解和阻滞calpastatin ，使之活
性降低，而导致calpains 的活性增加
［7］。

因此，在房颤时，calpains /calpastatin 和caspase 是否存在相互作用而促进房颤的发病以及calpain-Ⅰ与细胞凋亡之间的关系怎样，到目前尚无研究。

为此，本研究检测了风湿性心脏病患者左心房肌组织的calpain-Ⅰ、calpastatin 和caspase-3的蛋白含量，并对左心房细胞凋亡进行了原位检测。

旨在探讨永久性房颤患者心房组织的calpain-Ⅰ/calpastatin 、
caspase-3和心房肌细胞凋亡之间的相互关系，研究它们在心房结构重构和功能改变中的意义，以便于揭示房颤的发病机制。

资料与方法
一、研究对象
所有患者均通过超声心动图和临床表现明确诊断为风湿性心脏病，因病情需要行外科瓣膜置换手术。

共选择43例，其中窦性心律（窦律组）15例，阵发性房颤（阵发房颤组）8例，永久性房颤（永久房颤组）20例。

各组的临床资料见表1。

表1 各组临床资料的比较（-x ±s ）组别例数年龄（岁）男/女（例）房颤时间（月）Lad （mm ）Rad （mm ）Lvd （mm ）LVEF （%）永久房颤
2045.3±8.16/1458.3±54.461.1±10.1*
48.3±15.4*53.7±9.154.1±8.7阵发房颤850.3±9.32/6 3.4± 2.0
55.0±7.8*41.6± 6.353.1± 6.157.8± 3.8窦律
15
46.8±12.2
7/8
-
45.4± 6.3
35.9± 4.6
58.4±11.7
55.2±11.2
注：
Lad ：左心房内径；Rad ：右心房内径；Lvd ：左心室舒张末内径；LVEF ：左室射血分数；*
与窦性心律比较，P <0.01二、研究方法
1.超声心动图检查：所有患者在行外科手术前常规行超声心动图检查，测量其左右心房内径、左室舒张末内径和左室射血分数。

2.标本的采集：在外科手术中收集患者左心房游离壁的组织共500mg ，在生理盐水中洗净后，一部分立即置入10%的甲醛中固定，一部分立即放入液氮中储存备用。

3.免疫印迹法（Western blot ）检测：在液氮中取出冻存的心肌组织，取其100mg 溶解于免疫放射沉淀测定缓冲液［radioimmunoprecipitation assay （RIPA ）buffer ］；成分参照文献［8］制成匀浆，在4℃下以100000g 离心30min ，上清液用Lowry 法按蛋白质分析试剂盒（Sigma ，美国）的要求测定蛋白质含量。

各标本取等量蛋白质样品煮沸5min （95℃），加入12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，将蛋白质从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素滤膜上，在脱脂奶粉磷酸缓冲液中封闭1h 。

分别加入兔抗人calpain-Ⅰ多克隆抗体、
大鼠抗人caspase-3单克隆抗体、大鼠抗人calpastatin 单克隆抗体（均购于Santa Cruz Biotec.California ，美国），置37℃水浴摇床温育2h 。

再加入相应的二抗、
37℃温育1h ，化学发光试剂显色，X 线片感光显影，在Image Master VDS-CL 凝胶成像系统上对条带灰度进行密度测定。

与窦律组的条带灰度值相比，为目的基因的相对表达含量。

4.TUNEL 法：检测细胞凋亡所用的TUNEL 试剂盒购自晶美生物工程武汉分公司，检测方法参照试剂盒说明书进行。

主要步骤为：切片脱蜡至水，3%过氧化氢、甲醇处理10min ，蛋白酶K 室温消化20min ，蒸馏水洗后加标记缓冲液1min 后甩干；加反应液（TdT 和DIGdUTP 各1µl 加入18µl 标记缓冲液中），37℃孵育1h ；0.1mol /L TBS ［100mmol /L
Tris-HCl，0.9%（W/V）NaCl，0.1%（V/V）Tween 20，pH7.5］洗后用封闭液封闭20min；加用封闭液稀释的Anti-DIG-Biotin，37℃反应30min；TBS洗涤后加链酶亲和素-生物素-过氧化物酶（SABC）室温孵育30min；TBS洗涤后用DBA显色，苏木精复染，分化，脱水，中性树胶封固。

阴性对照组：在实验中以TBS代替TDT酶切片；阳性对照组：在反应前用DNasel常温下孵育10min，其他步骤同实验组。

在40×10的高倍光镜下观察阳性细胞的核染成棕色。

随机观察5个视野，记录总细胞数和阳性细胞数，计
算凋亡指数（AI），AI为阳性细胞数占总细胞数的比率。

5.统计学处理：所有数据采用统计软件SPSS 11.0分析，均采用均数±标准差表示。

多组数据的均数比较采用one-Way ANOVA检验（F检验），若差异有统计学意义，则进一步采用q检验进行两两比较。

两组间数据的数量关系用直线相关分析。

以P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1.永久房颤组的左、右心房内径均较窦律组明显增大（均为P<0.01），且左心房内径比右心房扩大更明显（P=0.005）。

阵发房颤组的左心房扩大明显（P<0.01），而右心房扩大不明显，与窦律组比较差异无统计学意义。

左心房内径与房颤持续时间呈明显正相关（r=0.611，P=0.004）。

而在左室舒张末内径、左室射血分数值、年龄、性别等方面差异均无统计学意义（表1）。

2.Western blot检测：与窦律组比较，永久房颤组的calpain-Ⅰ含量增加到（344.0±101.9）%；caspase-3的含量增加到（394.0±99.4）%（P< 0.01）；calpastatin的含量则降低到（27.0±12.8）%（P<0.01），而阵发房颤组的各蛋白含量则无明显变化。

各组的calpain-Ⅰ、caspase-3和calpastatin的Western blot条带见图1，其含量比值见图2。

3.通过TUNEL检测左心房肌细胞凋亡：在永久房颤组，见凋亡细胞经TUNEL检测其阳性细胞的核染成棕色、呈散在分布，AI为（
4.6±9.1）%，与阵发房颤组（9.4±3.3）%和窦律组（6.1±2.4）%比较明显升高，均为P<0.01。

4.与左心房内径和房颤持续时间的关系：在永久房颤组中，calpain-Ⅰ和caspase-3的蛋白表达量及AI分别与左心房内径呈明显正相关（r=0.557，P=0.011；r=0.591，P=0.006；r=0.384，P=0.04），
图1各组中calpain-Ⅰ、caspase-3和calpastatin蛋白的
免疫印迹条带（典型例子）
*与窦律组比较，P<0.01
图2各组中calpain-Ⅰ、caspase-3和calpastatin蛋白的OD
值
且与房颤持续时间也呈明显正相关（r=0.78，P< 0.01；r=0.703，P=0.001；r=0.624，P=0.003）；calpastatin的蛋白含量却与左心房内径和房颤持续时间呈明显的负相关（r=-0.58，P=0.007；r= -0.663，P=0.001）。

5.calpain-Ⅰ、caspase-3、calpastatin和AI之间的相互关系：在永久房颤组中，左心房的calpain-Ⅰ的蛋白表达含量与caspase-3的蛋白表达含量以及其与AI之间分别呈明显正相关（r=0.93，P<0.01；r=0.887，P<0.01）；而calpastatin的蛋白含量分别与calpain-Ⅰ和caspase-3呈明显的负相关（r= -0.87，P<0.01；r=-0.92，P<0.01）。

讨论
本研究发现，在风湿性心脏病伴永久房颤患者的左右心房均明显扩大，尤以左心房扩大明显。

而且左心房内径与房颤持续时间明显正相关。

因此，了解左心房的病理改变可能更能真实地反映房颤的
发病机制。

因此，本研究对左心房组织相关的蛋白表达及其细胞凋亡进行研究，力求发现房颤发病的机制。

calpains是一组以钙离子依赖的中性蛋白酶，与细胞的分化、凋亡和坏死有关［3，4］。

calpain-Ⅰ是calpains家族中最具有代表性的成员。

静息状态时在细胞中它以酶原形式存在，当组织和细胞内钙离子浓度增高，calpains部分或全部被活化。

房颤时心房肌细胞内出现钙超载，这将激活calpain-Ⅰ。

本研究中发现，在永久房颤组的左心房组织中calpain-Ⅰ的蛋白含量明显升高，与相关文献报道一致［6，9］；并且，calpain-Ⅰ的蛋白含量与左心房内径以及房颤持续的时间呈明显正相关。

这表明，在房颤时出现calpain-Ⅰ的激活，并与心房的扩大和房颤的持续有密切的关系。

有研究发现，calpain的激活可降解cTnI和cTnT［9］。

因此，房颤时calpain-Ⅰ蛋白介导心肌收缩蛋白降解，导致心房肌收缩功能的减退，心房内负荷增加，心房扩大，心肌纤维化增加［10］，心房内各向传导差异明显，为房颤提供有利的基质，促进房颤的发生和维持。

同时，以上病理改变导致房颤的心房即使在转复治疗后的一定时间内仍不能恢复其收缩功能［11］，不利于心房内负荷、电生理重构和结构的恢复。

因此，在房颤过程中，由于L型钙离子通道的降解［6］和肌浆网钙泵摄取钙离子减少或释放增多导致钙离子超载，介导calpain-Ⅰ激活，引起胞质支架蛋白的降解［9］和抑制心肌收缩-兴奋偶联［12］以及连接蛋白43的降解［13］，使心房结构和功能改变，促进房颤的发生和持续存在。

calpain-Ⅰ的激活可能是房颤发病的重要机制之一。

房颤的发病机制与心房电重构、结构重构和离子通道重构等具有明确的关系。

心房的扩大和纤维化是结构重构和功能下降的重要原因［14］。

本研究用TUNEL法对风湿性心脏病患者的左心房组织的心肌细胞凋亡进行了检测，发现了不同程度的细胞凋亡，在永久房颤组中尤为明显，其凋亡指数增加了3～4倍。

在本研究中，还应用免疫印迹法检测了促进细胞凋亡的关键酶caspase-3的蛋白表达明显增多，这与文献［5］发现一致；并且其蛋白含量和左心房内径以及房颤持续的时间分别呈明显正相关。

这表明，左心房心肌细胞凋亡增加，有效的心肌细胞丢失，心肌细胞间质纤维化增多，造成心房有效收缩功能下降，出现心房扩大以及心房纤维化成分增加；后者是心房结构重构的重要内容［14］。

因此，心肌细胞凋亡参与了永久性房颤的心房结构和功能改变，为房颤的发病提供了基础。

同时，心房肌细胞凋亡导致心房结构和功能出现不可逆改变，也是房颤难以转复或即使转复后难以维持窦律的重要因素之一。

细胞凋亡的发生机制可能为：（1）缺血［15］；（2）通过血管紧张素Ⅱ2型受体（AT2-R）介导，抑制细胞外信号调节激酶（EKP）活性，阻止Bcl-2磷酸化而失活［16］；（3）AT2-R介导的激活细胞凋亡过程中的关键酶caspase-3而参与细胞凋亡［17］。

本研究还发现，calpain-Ⅰ的含量与心房肌细胞凋亡呈明显正相关，说明calpain-Ⅰ与心房肌细胞凋亡密切相关，呈并行关系。

两者之间是否存在因果关系，目前尚不明确。

一方面，calpain-Ⅰ的活性增加可能是永久性房颤患者心房肌细胞凋亡另外的机制之一［4］。

有研究发现，calpain-Ⅰ在房颤的心房肌细胞核中明显增多，且通过免疫组化显示其含量明显增加，这导致细胞核变性，细胞凋亡增加［6］。

另一方面，在本研究中，calpains的内源性拮抗剂calpastatin蛋白的表达明显减少和促进细胞凋亡的关键酶caspase-3蛋白表达在房颤组中明显增加，并且calpastatin的蛋白含量与左心房内径以及房颤持续时间呈明显的负相关。

同时，caspase-3和calpastatin明显负相关，caspase-3对calpain-Ⅰ和calpastatin具有调节作用，直接上调calpains［18］，降解calpastatin，使其活性下降［7］，间接地介导calpain-Ⅰ的活性和含量增加［8］。

因此，在房颤时，心房的结构和功能出现了变化，其组织中的calpain-Ⅰ、caspase-3、calpastatin等蛋白与细胞凋亡也出现了相应改变。

细胞凋亡增加，细胞核中的calpain-Ⅰ活性和含量增加进一步促进凋亡；同时，细胞凋亡的关键酶caspase-3活性和表达的增加，直接或间接地通过阻滞calpastatin的活性和表达，来促进calpain-Ⅰ的活性和表达增加。

它们之间的关系密切，可能互为因果，出现恶性循环；同时，他们可能形成一个体系而在房颤的发病机制中起着相当重要的作用。

但是，它们在房颤的发病中的具体作用有待进一步和更多的研究来证实。

有研究表明，抑制caspase-3的活性和caspase-3的蛋白表达可以减少细胞凋亡［7］。

在心离体再灌注模型中，应用calpains的不同抑制剂可以减轻心肌收缩功能受损的程度［19，20］。

虽然细胞凋亡、caspase-3、calpastatin和calpain-Ⅰ在房颤发病中的具体作用尚不明确，但是通过控制以上这个恶性循环体系中的任何一个环节，有望减少和防治房颤的发生和持续存在，对防治房颤具有很重要的临床意
义。

这将为房颤的药物治疗提供新的途径，有待进一步的实验研究来探讨。

参考文献
1Allessie M，Ausma J，Schotten U.Electrical，contractile and structural remolding during atrial fibrillation.Cardiovasc Res，2002，54：230-246.
2Xu J，Cui G，Esmailian F，et al.Atrial extracellular matrix remodeling and the maintenance of atrial fibrillation.Circulation，2004，109：363-368.
3汤永健，朱文玲，周兴文，等.钙蛋白酶参与心力衰竭患者心肌重构的信号传导.中华心血管病杂志，2005，33：247-250.
4Wang KK.Calpain and caspase：can you tell me the difference？
Trends Neurosci，2000，23：20-26.
5Aime-Sempe C，Folliguet T，Rücker-Martin C，et al.Myocardial cell death in fibrillating and dilated human right atria.J Am Coll Cardiol，1999，34：1577-1586.
6Brundel BJ，Ausma J，van Gelder IC，et al.Activation of proteolysis by calpains and structural changes in human paroxysmal and persistent atrial fibrillation.Cardiovasc Res，2002，54：380-389.
7Wang KK，Posmantur R，Nadimpalli R，et al.Caspase-mediated fragmentation of calpain inhibitor protein calpastatin during apoptosis.Arch Biochem Biophys，1998，356：187-196.
8Shi Y，Melnikov VY，Schrier RW，et al.Downregulation of the calpain inhibitor protein calpastatin by caspases during renal ischemia-reperfusion.Am J Physiol Renal Physiol，2000，279：F509-F517.
9Goette A，Arndt M，Rocken C，et al.Calpains and cytokines in fibrillating human atria.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283：H264-H272.
10Nakano Y，Niida S，Dote K，et al.Matrix metalloproteinase-9 contributes to human atrial remodeling during atrial fibrillation.J Am Coll Cardiol，2004，43：818-825.11Schotten UL，Ausma JN，Stellbrink CH，et al.Cellular mechanisms of depressed atrial contractility in patients with chronic atrial fibrillation.Circulation，2001，103：691-698.
12Laing JG，Tadros PN，Saffitz J，et al.Proteolysis of connexin43-containing gap junctions in normal and heat-stressed cardiac myocytes.Cardiovasc Res，1998，38：711-718.
13Laflamme MA，Becker PL.G（s）and adenylyl cyclase in transverse tubules of heart：implications for cAMP-dependent signaling.Am J Physiol，1999，277：H1841-H1848.
14柯丹，许春萱，张建成，等.心房颤动患者心房组织中明胶酶的基因表达及活性变化.中华心血管病杂志，2005，33：137-142.
15Jayachandran JV，Winkle W，Zipes DP，et al.Chronic atrial fibrillation from rapid atrial pacing is associated with reduced atrial blood flow：a position emission tomography study.Circulation，2000，98：201-209.
16Horiuchi M，Hayashida W，Kambe T，et al.Angiotensin type2 receptor dephosphorylates Bcl-2by activating mitogen-activated protein kinase phosphatase-1and induce apoptosis.J Biol Chem，1997，272：19022-19026.
17Dimmeler S，Rippmanr V，Weiland U，et al.Angiotensin induces apoptosis of human endothelial cell：protective effect of nitric oxide.
Circ Res，1997，81：970-976.
18Edelstein CL，Shi Y，Schrier RW.Role of caspases in hypoxia-induced necrosis of rat renal proximal tubules.J Am Soc Nephrol，1999，10：1940-1949.
19Matsumura Y，Kusuoka H，Inone M，et al.Protective effect of the protease inhibitor leupeptin against myocardial stunning.J Cardiovasc Pharmacol，1993，22：135-142.
20Urthaler F，Wolkowicz P，Dignerness S，et al.MDL-28170，a membrane permeant calpain inhibitor，attenuates stunning and PKC epsilon proteolysis in reperfused ferret heart.Cardiovasc Res，1997，35：60-67.
（收稿日期：2005-06-29）
（本文编辑：郭林妮）
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