高效液相色谱法测定左旋尤利沙星的含量及有关物质

高效液相色谱法测定左旋尤利沙星的含量及有关物质
满凤;安穗伟;梁北梅;彭锋;刘学斌;李发美
【摘要】目的建立测定左旋尤利沙星含量及有关物质的高效液相色谱方法.方法采用Diamonsil C_(18)柱(250mm×4.6mm,5μm),以乙腈-0.2%三乙胺和0.1%庚烷磺酸钠水溶液(用磷酸调节pH 2.5)(25:75)为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为275nm,柱温为35℃.结果主峰能与相邻杂质峰达基线分离,左旋尤利沙星的浓度在10～200μg/ml范围内线性关系良好,相关系数为0.9996,最低检测限为
0.2ng.结论该法简便、准确,灵敏度高,专属性强,可以用于左旋尤利沙星的含量及有关物质的测定.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2010(035)002
【总页数】3页(P108-110)
【关键词】左旋尤利沙星;HPLC;含量测定;有关物质
【作者】满凤;安穗伟;梁北梅;彭锋;刘学斌;李发美
【作者单位】沈阳药科大学药学院,沈阳,110016;广州市医药工业研究所,广
州,510240;广州市医药工业研究所,广州,510240;广州市医药工业研究所,广
州,510240;广州市医药工业研究所,广州,510240;沈阳药科大学药学院,沈
阳,110016
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
左旋尤利沙星（levoulifloxacin），化学名(S)-6-氟-1-甲基-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-1H,4H-[1，3]硫氮杂环丁烷并[3，2-a]喹啉-3-羧酸，是一种喹诺酮类化合物（图1）。

左旋尤利沙星对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及金葡菌均有较强的体外抗菌活性，且为右旋尤利沙星抗菌活性的4-11倍，亦明显强于消旋尤利沙星[1]。

目前，笔者未见国内外有关HPLC法测定左旋尤利沙星含量与有关
物质的报道。

为此，本文建立了测定左旋尤利沙星含量和有关物质检查的高效液相色谱方法。

1 仪器与试药
1.1 仪器
戴安SUMMIT P680A型高效液相色谱仪，PDA-100紫外/可见二极管阵列检测器，Chromeleon色谱工作站。

1.2 试药
图1 左旋尤利沙星的化学结构式
左旋尤利沙星样品（批号：090513，090514，090515）及左旋尤利沙星对照品（HPLC归一化法纯度：99.4%），广州市医药工业研究所合成室；乙腈为色谱纯；磷酸、三乙胺及庚烷磺酸钠，分析纯；超纯水。

2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性
色谱柱：Diamonsil C18（250mm×4.6mm,5µm）；流动相：乙腈-0.2%三乙胺和0.1%庚烷磺酸钠水溶液（用磷酸调节pH 2.5）（25：75）；流速：
1.0ml/min；检测波长：275nm；柱温：35℃；进样量：20µl；在上述条件下，
左旋尤利沙星与其有关物质实现基线分离，理论塔板数（左旋尤利沙星）不低于7000。

2.2 溶液的配制
2.2.1 对照品溶液取左旋尤利沙星对照品约25mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解，再用流动相稀释至刻度，混合均匀作为对照品储备液。

精密量取上述储备液1ml置于10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液取左旋尤利沙星样品约25mg，精密称定，按“2.2.1”项下方
法制备，即得。

2.3 专属性试验
2.3.1 酸破坏实验取左旋尤利沙星样品约10mg，加入0.1mol/L盐酸溶液10ml
溶解，于80℃水浴加热3h，放冷后，加流动相稀释制成0.5mg/ml的供试品溶液，进样10µl，记录色谱图，结果见图2A。

2.3.2 碱破坏实验取左旋尤利沙星样品约10mg，加入0.1mol/L 氢氧化钠溶液
10ml溶解，于80℃水浴加热3h，放冷后，加流动相稀释制成0.5mg/ml的供试品溶液，进样10µl，记录色谱图，结果见图2B。

2.3.3 光照破坏实验取左旋尤利沙星样品适量，强光照射24h，用流动相溶解制成0.5mg/ml的供试品溶液，进样10µl，记录色谱图，结果见图2C。

2.3.4 氧化破坏实验取左旋尤利沙星样品约10mg，加入5%过氧化氢10ml溶解，于80℃水浴加热3h，放冷后，加流动相稀释制成0.5mg/ml的供试品溶液，进样10µl，记录色谱图，结果见图2D。

2.3.5 加热破坏实验取左旋尤利沙星样品适量，于120℃烘箱中放置4h，用流动
相溶解制成0.5mg/ml的供试品溶液，进样10µl，记录色谱图，结果见图2E。

结果表明，各杂质峰与主峰有较好分离，分离度大于1.5，通过二极管阵列检查左旋尤利沙星主峰纯度，结果大于999.0。

2.4 线性关系
分别精密量取“2.2.1”项下储备液适量，用流动相定量稀释，配制成浓度为
10.74，21.48，53.70，107.4，161.1，214.8µg/ml的系列标准溶液。

在上述色谱条件下，进样测定。

以左旋尤利沙星浓度（C，µg/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程A=2.558C-8.177,r=0.9996。

结果表明，左旋尤利沙星在10～200µg/ml范围内，峰面积与浓度线性关系良好。

2.5 检测限
取“2.4线性”项下最低浓度（10.74µg/ml）的对照品溶液，逐级稀释，按信噪
比（S/N）为3时计算，测得左旋尤利沙星的最低检测限为0.2ng。

2.6 重复性试验
取“2.2.1”项下对照品溶液20µl，连续进样6次，峰面积的RSD为0.8%，表明进样精密度良好。

2.7 稳定性试验
取对照品溶液分别于室温放置0，2，4，6，8，12，24h后进样测定，峰面积的RSD为0.5%，表明样品溶液在24h内稳定。

2.8 精密度试验
取本品（批号为090514），照“2.2”项下方法配制供试品溶液（50µg/ml）6份，并配制对照溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，按外标法计算含量，计算日
内精密度；同法连续测定3天，计算日间精密度，结果日内、日间RSD均小于
0.5%。

2.9 样品含量测定
分别取左旋尤利沙星对照品及样品三批（批号为090513，090514，090515），按“2.2”项下配制溶液，照“2.1”项下色谱条件，进样20µl。

按外标法计算供
试品左旋尤利沙星的含量，结果见表1。

2.10 有关物质测定
取左旋尤利沙星样品适量，加0.1mol/L盐酸溶液溶解，再用流动相稀释制成
0.5mg/ml的供试品溶液，精密量取1ml至100ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。

精密量取对照溶液10µl注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%～30%。

再分别取供试品溶液
和对照溶液各10µl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算有关物质的量。

供试品溶液色谱图中如显杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液（已按1×10-2稀释）主峰
面积的1.5倍（1.5%）。

3批样品的有关物质测定结果见表1。

图2 左旋尤利沙星专属性试验色谱图
3 讨论
3.1 检测波长的选择
本实验利用二极管阵列检测器对左旋尤利沙星对照品及样品在200～400nm范围内进行光谱扫描，发现左旋尤利沙星在277nm处为最大吸收，但其几个主要杂质的最大吸收在272～277nm之间，故选定275nm作为测定波长。

3.2 流动相的选择
左旋尤利沙星为两性化合物，分子结构中含有氨基和羧基，能在水溶液中解离，单独以乙腈-水为流动相洗脱时，色谱峰拖尾严重。

本实验通过在流动相中加入离子
对试剂（庚烷磺酸钠），与左旋尤利沙星中的氨基形成离子对；并选用酸性条件（pH2.5），抑制羧基解离而加强保留；流动相中加入三乙胺，有改善峰形的作用。

本文还曾采用枸橼酸盐缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液作为流动相，结果分离效果均不理想，且色谱峰拖尾。

表1 3批样品的含量测定及有关物质检查结果批号含量（%）有关物质（%）090513 99.32 0.98 090514 99.24 0.96 090515 99.28 0.99
3.3 样品溶剂的选择
根据本品的溶解特性，本品易溶于酸，而在流动相中溶解性较差。

因此本实验中先用0.1mol/L盐酸溶液溶解，再加流动相进一步稀释。

3.4 色谱峰纯度的检查
本文利用二极管阵列检测器在200～400nm范围内进行扫描，对破坏试验中左旋尤利沙星主峰纯度进行检查，结果表明本法色谱条件下能有效分离降解产物，可有效控制杂质含量，不影响含量测定。

参考文献
[1]朱少璇，王玉平，曾琳玲，等.具有光学活性的葡萄糖酸尤利沙星制备及体外抗菌活性初步研究[J].中国抗生素杂志，2008，33（12）：S1.。