携带质粒的PLGA纳米粒-超声微泡复合体的构建及细胞相容性研究
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关键词 ：纳米粒 ； 超声微泡造影剂 ； 组织型纤溶酶原激活因子 ； 抗凝治疗 ； 非病毒载体 中图分类号 ：Ｒ９７３ ＤＯＩ ：１０畅 ３８７０ ／ｊ畅 ｉｓｓｎ畅 １６７２‐０７４１畅 ２０１３畅 ０４畅 ００１
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２‐ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ＰＬＧＡ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ‐ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｈｅｉｒ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ； ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔ ； ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ‐ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ ； ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ； ｎｏｎｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ
程 龙 ＃ ， 刘成珪 ＃ ， 张凯伦 ＃ ， 胡志伟 △ ， 李 源
华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科 ，武汉 ４２００２２
摘要 ：目的 构建携带 ｔＰＡ 基因质粒的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物（ＰＬＧＡ ）纳米粒‐超声微泡复合体 ，检测其理化性质 、 体外缓释方式 、细胞相容性 。 方法 应用双次乳化法制备携有 ｔＰＡ 基因质粒的 ＰＬＧＡ 纳米粒 ；应用薄膜水化超声法制 备阳离子超声微泡 ；两者通过静电吸附作用 ，形成质粒‐纳米粒‐超声微泡复合体 （ｐｌａｓｍｉｄ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ‐ｍｉ‐ ｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ，ＰＥＮＭ Ｃ） 。 检测 ＰＬＧＡ 纳米粒的质粒载量 ，该复合体 ＰＥＮＭＣ 的质粒载量 ；检测 ＰＬＧＡ 纳米粒及复 合体体外缓释质粒的情况 ；ＣＣＫ‐８ 法检测纳米粒及复合体 ＰＥＮＭ Ｃ 的细胞毒性 。 结果 检测携带质粒的纳米粒粒径为 （２１７畅 ２ ± ２畅 ２）ｎｍ ，ｚｅｔａ 电位为（ － １５畅 ２４ ± ０畅 ８３）ｍＶ 。 微泡平均大小为 （３畅 ２ ± １畅 ５ ）μｍ ，ｚｅｔａ 电位为 （１３畅 ６６ ± ２畅 ０５ ）ｍＶ 。 微泡浓度为（４畅 ３ ± １畅 １） × １０８ ／ｍＬ 。 ＰＥＮＭ Ｃ 平均直径为 （４畅 ６ ± １畅 ７ ）μｍ ，ｚｅｔａ 电位为 （２畅 ２３ ± １畅 ４５ ）ｍＶ 。 浓度为 （３畅 ０ ± １畅 ３） × １０８ ／ｍＬ 。 １ ｍｇ ＰＬＧＡ 纳米粒载有质粒（４２畅 ３ ± ２畅 １）μｇ 。 １ ｍＬ ＰＥＮＭ Ｃ 中带有质粒 （２０畅 ５ ± ２畅 ７ ）μｇ 。 ＰＬＧＡ 纳米 粒及复合体 ＰＥＮＭＣ 前 ７ ｄ 累计释放量均为（５７ ± ３ ）％ 。 起始段短时间内快速释放 ，后呈现稳定 、缓慢释放 。 体外细胞 毒实验证实 ＰＬＧＡ 纳米粒及复合体 ＰＥＮＭ Ｃ 均未见明显细胞毒性效应 。 结论 所构建的纳米粒‐超声微泡复合体显示 出较好的缓释效果 ，较低的细胞毒性 ，为后续将其应用于基因治疗奠定了实验基础 。
纳米颗粒由于粒径较小可被大多数细胞摄取可通过调整纳米粒的基质构成比例分子量大小添加成分等调节其缓释的速率满足不同释放方式的要求达到控释的效果以期获得最好的疗效作为可生物降解的生物材料之一plga由于其可控的缓慢释放效用的确切性相对廉价及极低的副作用被广泛采用为成功的生物可降解的多聚物之一其水解后产生的代谢单体乳酸及乙醇酸是体内正常的代谢产物因此使用plga作为生物材料具有非常低的系统毒性故常被作为携带核酸蛋白多肽的载体材料应用于基因治疗及dna疫苗等通过将纳米粒与超声微泡相结合可以克服超声微泡载基因量少单纯纳米粒缺乏靶向性容易被网状内皮系统清除等缺点从而构建出高效持续靶向性可视化的靶向给药系统
Ｃｈｅｎｇ Ｌｏｎｇ ＃ ，Ｌｉｕ Ｃｈｅｎｇｇｕｉ ＃ ，Ｚｈａｎｇ Ｋａｉｌｕｎ ＃ ｅｔ ａｌ
Ｄｅ ｐ ａｒｔｍｅｎｔ ｏ ｆ Ｃａｒｄｉｏｖ ａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ ，Ｕｎｉｏｎ Ｈ ｏｓｐ ｉｔａｌ ，Ｔｏｎｇ ｊ ｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅ ｇｅ ，Ｈ ｕａｚ ｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ，Ｗ ｕｈａｎ ４３００２２ ，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２‐ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ‐ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ，ｔｈｅ ｉｎ ｖ ｉｔｒｏ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｍａｎｎｅｒ ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉ‐ ｔｙ畅 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２‐ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｍｅｔｈ ‐ ｏｄ畅 Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｔｈｉｎ‐ｆｉｌｍ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ畅 Ｐｌａｓｍｉｄ‐ｅｎｃａｐｓｕｌｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ‐ｍｉｃｒｏｂｕｂ‐ ｂｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ （ＰＥＮＭ Ｃ ） ｗ ｅｒｅ ｃｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ畅 Ｔ ｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｌｏａｄｓ ｉｎ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ＰＥＮＭ Ｃ ｗｅｒｅ ａｓｓａｙｅｄ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ畅 Ｔ ｈｅ ｉｎ ｖ ｉｔｒｏ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｍａｎｎｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ＰＥＮＭ Ｃ ｗｅｒｅ ｅｘａｍ ‐ ｉｎｅｄ畅 Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔ ｈｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ‐ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ （２１７畅 ２ ± ２畅 ２ ） ｎｍ ａｎｄ （ － １５畅 ２４ ± ０畅 ８３） ｍＶ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ畅 Ｔ ｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ ｗｅｒｅ （３畅 ２ ± １畅 ５ ） μｍ ａｎｄ （１３畅 ６６ ± ２畅 ０５） ｍＶ ，ｗ ｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ （４畅 ３ ± １畅 １） × １０８ ／ｍＬ畅 Ｔ ｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ＰＥＮＭＣ ｗａｓ （４畅 ６ ± １畅 ７ ） μｍ ，ｔｈｅ ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ （２畅 ２３ ± １畅 ４５） ｍＶ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （３畅 ０ ± １畅 ３） × １０８ ／ｍＬ畅 Ｔ ｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｌｏａｄｓ ｗｅｒｅ （２０畅 ５ ± ２畅 ７） μｇ ／ｍＬ ａｎｄ （４２畅 ３ ± ２畅 １） μｇ ／ｍｇ ｉｎ ＰＥＮＭ Ｃ ａｎｄ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ畅 Ｔ ｈｅ ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｒａｔｅ ｗａｓ （５７ ± ３ ）％ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｅｖｅｎ ｄａｙｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ＰＥＮＭ Ｃ ｇｒｏｕｐｓ畅 Ｔ ｈｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ ａｎｄ ａ ｓｈｏｒｔ ｔｉｍｅ ｌａｔｅｒ ，ｓｌｏｗ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｗａｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ畅 Ｔ ｈｅｒｅ ｗａｓ ｌｉｔｔｌｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ＰＥＮ ‐ Ｍ Ｃ畅 Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔ ｈｅ ＰＥＮＭＣ ｗｉｔｈ ａ ｇｏｏｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｐａｔｔｅｒｎ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｍａｙ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ畅
１畅 ２ 方法
１畅 ２畅 １ 携带 ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ＤｓＲｅｄ‐Ｅｘｐｒｅｓｓ２ 质 粒 的 ＰＬＧＡ 纳米粒的制备 本实验使用双次乳化法制备 携带有 ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ＤｓＲｅｄ‐Ｅｘｐｒｅｓｓ２ 质粒的 ＰＬＧＡ 纳米粒 。 具体方法如下 ：将 ３０ ｍｇ ＰＬＧＡ 溶于 ２ ｍＬ 二氯甲烷 （ＤＣＭ ）中 ；将含有 ０畅 ５ ｍｇ 质粒的 Ｔ ｒｉｓ‐ ＨＣｌ（ｐＨ ７畅 ６）溶液 ４００ μＬ 加入上述溶有 ＰＬＧＡ 的 ＤＣＭ 中 。 冰浴 ，超声破碎仪 （ＸＬ２０００ ，美国 Ｍ ｉｓｏ‐ ｎｉｘ 公司）超声功率设置为 Ｌｅｖｅｌ ２０ ，超声探头超声 １０ ｓ ，冷却 １０ ｓ ，循环 ３ 次 ，形成初次乳化液 。 将超 声后的初次乳化液加入到 ３０ ｍＬ ２％ ＰＶ Ａ 水溶液 中 。 冰浴下 ，超声 ２ ｍｉｎ ，功率为 Ｌｅｖｅｌ ２０ ，形成复乳 液 。 室温万下方磁数子据搅拌 １２ ｈ ；双蒸水重悬 ，１０ ０００ｇ 离
第 ４２ 卷第 ４ 期第 ２０１３ 年 ８ 月
３７７
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Ａｃｔａ
华中科技大学学报（医学版 ） Ｍ ｅｄ Ｕ ｎｉｖ Ｓｃｉ Ｔ ｅｃ ４ Ｐ畅 ３７７ Ａ ｕｇ畅 ２０１３
论 著
携 带 质 粒 的 Ｐ Ｌ Ｇ Ａ 纳 米 粒‐超 声 微 泡 复 合 体 的 构 建 及细胞相容性研究 倡
；张凯伦 ，男 ，１９５１ 年生 ｒ ，Ｅ‐ｍａｉｌ ：ｈｕｚｈｉｗ ｅｉｘ ｈ＠
，教授 ，Ｅ‐ｍａｉｌ １６３畅 ｃｏｍ
：Ｐ ｒ ｏ ｚ ｋｌ ＠
１６３畅 ｃｏ ｍ
· ３７８ ·
华中科技大学学报 （医学版 ） ２０１３ 年 ８ 月第 ４２ 卷第 ４ 期
瓣膜性心脏病 ，是当今成人心脏病中占较大比 例的疾病之一 。 心脏瓣膜置换术后 ，为避免植入物 血栓形成 ，患者术后需要接受抗凝治疗 。 如何避免 术后抗凝及减少抗凝相关并发症的发生 ，仍是人们 需要面临的一道难题 。 将基因治疗技术应用于术后 瓣膜抗凝治疗 ，以期达到局部抗凝强度增高 、减量或 不使用系统抗凝药物 ，从而减少甚至避免术后抗凝 相关并发症的发生 。 但要达到换瓣术后的长期局部 有效抗凝 ，则需要局部组织细胞长期 、持续 、稳定 、适 当的高表达抗凝因子 。 本实验拟构建携带有 ｔＰＡ 基因质粒的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物 （ＰＬＧＡ ）纳米 粒 ，而后应用静电吸附原理 ，将其与含气脂质微泡结 合 ，形成质粒‐纳米粒‐超声微泡复合体 （ＰＥＮＭ Ｃ ） ， 以期该复合物具有一定的载药量 、缓释药物 、较好的 生物相容性 ，为后续将该质粒‐纳米粒‐超声微泡复 合体应用于基因治疗提供实验依据 。
１ 材料和方法
１畅 １ 材料
ＰＬＧＡ ，购自山东医疗器械研究所 ；ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ ＤｓＲｅｄ‐Ｅｘｐｒｅｓｓ２ 质粒由本课题组保存 ；二硬脂酸磷 脂酰 胆 碱 （ＤＳＰＣ ） 及 １ ，２‐硬 脂 酰‐３‐三 甲 基 丙 烷 （ＤＳ Ｔ Ａ Ｐ ）购自于 Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ 公司 ；聚乙烯 醇 （ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ，ＰＶ Ａ ，ａｖｅｒａｇｅ Ｍ ｗ ８５ ０００ — １２４ ０００） ，聚乙二醇（４００）单硬脂酸酯 （ＰＥＧ‐４０ Ｓｔｅ‐ ａｒａｔｅ ，ＰＥＧ４０Ｓ）购于 Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ 公司 ；二氯甲烷 （Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ ，ＤＣＭ ） ，购于国药集团化学试剂 有限公司 ；全氟丙烷 （Ｃ３ Ｆ８ ）购于北京特种气体厂 ； 香豆素‐６（Ｃｏｕｍａｒｉｎ‐６ ） ，购于上海佳禾生物科技有 限公 司 ；ＰＢＳ 、ＤＭ ＥＭ ／Ｆ１２ 基 础 培 养 液 购 自 Ｈｙ‐ ｃｌｏｎｅ 公司 ；０畅 ２５％ Ｔ ｒｙｐｓｉｎ‐ＥＤ Ｔ Ａ 、胎牛血清购于 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司 。
倡 国家自然科学基金资助项目 （Ｎ ｏ畅 ３０８７２５４３ ）
＃ 同为第一作者 ，程 龙 ，男 ，１９８３ 年生 ，博士研究生 ，Ｅ‐ｍａｉｌ ：ｄｏｃｃｈｅｎｇｌｏｎｇ ＠ １６３畅 ｃｏｍ ；刘成珪 ，男 ，１９６２ 年生 ，副教授 ，
△
通
Ｅ‐ｍ ａｉｌ 讯作者
：ｌ万，Ｃｉｕｏｃ方ｒｇｒ１ｅ９数ｓ６ｐ２ｏ据＠ｎｄｓｉｎｉｎｇａ畅ａ ｕｃｏｔ ｈｍｏ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２‐ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ＰＬＧＡ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ‐ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｈｅｉｒ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ； ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔ ； ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ‐ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ ； ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ； ｎｏｎｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ
程 龙 ＃ ， 刘成珪 ＃ ， 张凯伦 ＃ ， 胡志伟 △ ， 李 源
华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科 ，武汉 ４２００２２
摘要 ：目的 构建携带 ｔＰＡ 基因质粒的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物（ＰＬＧＡ ）纳米粒‐超声微泡复合体 ，检测其理化性质 、 体外缓释方式 、细胞相容性 。 方法 应用双次乳化法制备携有 ｔＰＡ 基因质粒的 ＰＬＧＡ 纳米粒 ；应用薄膜水化超声法制 备阳离子超声微泡 ；两者通过静电吸附作用 ，形成质粒‐纳米粒‐超声微泡复合体 （ｐｌａｓｍｉｄ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ‐ｍｉ‐ ｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ，ＰＥＮＭ Ｃ） 。 检测 ＰＬＧＡ 纳米粒的质粒载量 ，该复合体 ＰＥＮＭＣ 的质粒载量 ；检测 ＰＬＧＡ 纳米粒及复 合体体外缓释质粒的情况 ；ＣＣＫ‐８ 法检测纳米粒及复合体 ＰＥＮＭ Ｃ 的细胞毒性 。 结果 检测携带质粒的纳米粒粒径为 （２１７畅 ２ ± ２畅 ２）ｎｍ ，ｚｅｔａ 电位为（ － １５畅 ２４ ± ０畅 ８３）ｍＶ 。 微泡平均大小为 （３畅 ２ ± １畅 ５ ）μｍ ，ｚｅｔａ 电位为 （１３畅 ６６ ± ２畅 ０５ ）ｍＶ 。 微泡浓度为（４畅 ３ ± １畅 １） × １０８ ／ｍＬ 。 ＰＥＮＭ Ｃ 平均直径为 （４畅 ６ ± １畅 ７ ）μｍ ，ｚｅｔａ 电位为 （２畅 ２３ ± １畅 ４５ ）ｍＶ 。 浓度为 （３畅 ０ ± １畅 ３） × １０８ ／ｍＬ 。 １ ｍｇ ＰＬＧＡ 纳米粒载有质粒（４２畅 ３ ± ２畅 １）μｇ 。 １ ｍＬ ＰＥＮＭ Ｃ 中带有质粒 （２０畅 ５ ± ２畅 ７ ）μｇ 。 ＰＬＧＡ 纳米 粒及复合体 ＰＥＮＭＣ 前 ７ ｄ 累计释放量均为（５７ ± ３ ）％ 。 起始段短时间内快速释放 ，后呈现稳定 、缓慢释放 。 体外细胞 毒实验证实 ＰＬＧＡ 纳米粒及复合体 ＰＥＮＭ Ｃ 均未见明显细胞毒性效应 。 结论 所构建的纳米粒‐超声微泡复合体显示 出较好的缓释效果 ，较低的细胞毒性 ，为后续将其应用于基因治疗奠定了实验基础 。
纳米颗粒由于粒径较小可被大多数细胞摄取可通过调整纳米粒的基质构成比例分子量大小添加成分等调节其缓释的速率满足不同释放方式的要求达到控释的效果以期获得最好的疗效作为可生物降解的生物材料之一plga由于其可控的缓慢释放效用的确切性相对廉价及极低的副作用被广泛采用为成功的生物可降解的多聚物之一其水解后产生的代谢单体乳酸及乙醇酸是体内正常的代谢产物因此使用plga作为生物材料具有非常低的系统毒性故常被作为携带核酸蛋白多肽的载体材料应用于基因治疗及dna疫苗等通过将纳米粒与超声微泡相结合可以克服超声微泡载基因量少单纯纳米粒缺乏靶向性容易被网状内皮系统清除等缺点从而构建出高效持续靶向性可视化的靶向给药系统
Ｃｈｅｎｇ Ｌｏｎｇ ＃ ，Ｌｉｕ Ｃｈｅｎｇｇｕｉ ＃ ，Ｚｈａｎｇ Ｋａｉｌｕｎ ＃ ｅｔ ａｌ
Ｄｅ ｐ ａｒｔｍｅｎｔ ｏ ｆ Ｃａｒｄｉｏｖ ａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ ，Ｕｎｉｏｎ Ｈ ｏｓｐ ｉｔａｌ ，Ｔｏｎｇ ｊ ｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅ ｇｅ ，Ｈ ｕａｚ ｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ，Ｗ ｕｈａｎ ４３００２２ ，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２‐ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ‐ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ，ｔｈｅ ｉｎ ｖ ｉｔｒｏ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｍａｎｎｅｒ ，ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉ‐ ｔｙ畅 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ２‐ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｍｅｔｈ ‐ ｏｄ畅 Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｔｈｉｎ‐ｆｉｌｍ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ畅 Ｐｌａｓｍｉｄ‐ｅｎｃａｐｓｕｌｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ‐ｍｉｃｒｏｂｕｂ‐ ｂｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ （ＰＥＮＭ Ｃ ） ｗ ｅｒｅ ｃｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ畅 Ｔ ｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｌｏａｄｓ ｉｎ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ＰＥＮＭ Ｃ ｗｅｒｅ ａｓｓａｙｅｄ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ畅 Ｔ ｈｅ ｉｎ ｖ ｉｔｒｏ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｍａｎｎｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ＰＥＮＭ Ｃ ｗｅｒｅ ｅｘａｍ ‐ ｉｎｅｄ畅 Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔ ｈｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ‐ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅ （２１７畅 ２ ± ２畅 ２ ） ｎｍ ａｎｄ （ － １５畅 ２４ ± ０畅 ８３） ｍＶ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ畅 Ｔ ｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ ｗｅｒｅ （３畅 ２ ± １畅 ５ ） μｍ ａｎｄ （１３畅 ６６ ± ２畅 ０５） ｍＶ ，ｗ ｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ （４畅 ３ ± １畅 １） × １０８ ／ｍＬ畅 Ｔ ｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ＰＥＮＭＣ ｗａｓ （４畅 ６ ± １畅 ７ ） μｍ ，ｔｈｅ ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ （２畅 ２３ ± １畅 ４５） ｍＶ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （３畅 ０ ± １畅 ３） × １０８ ／ｍＬ畅 Ｔ ｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｌｏａｄｓ ｗｅｒｅ （２０畅 ５ ± ２畅 ７） μｇ ／ｍＬ ａｎｄ （４２畅 ３ ± ２畅 １） μｇ ／ｍｇ ｉｎ ＰＥＮＭ Ｃ ａｎｄ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ畅 Ｔ ｈｅ ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｒａｔｅ ｗａｓ （５７ ± ３ ）％ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｅｖｅｎ ｄａｙｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ＰＥＮＭ Ｃ ｇｒｏｕｐｓ畅 Ｔ ｈｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ ａｎｄ ａ ｓｈｏｒｔ ｔｉｍｅ ｌａｔｅｒ ，ｓｌｏｗ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｗａｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ畅 Ｔ ｈｅｒｅ ｗａｓ ｌｉｔｔｌｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ＰＥＮ ‐ Ｍ Ｃ畅 Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔ ｈｅ ＰＥＮＭＣ ｗｉｔｈ ａ ｇｏｏｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｐａｔｔｅｒｎ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｍａｙ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ畅
１畅 ２ 方法
１畅 ２畅 １ 携带 ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ＤｓＲｅｄ‐Ｅｘｐｒｅｓｓ２ 质 粒 的 ＰＬＧＡ 纳米粒的制备 本实验使用双次乳化法制备 携带有 ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ＤｓＲｅｄ‐Ｅｘｐｒｅｓｓ２ 质粒的 ＰＬＧＡ 纳米粒 。 具体方法如下 ：将 ３０ ｍｇ ＰＬＧＡ 溶于 ２ ｍＬ 二氯甲烷 （ＤＣＭ ）中 ；将含有 ０畅 ５ ｍｇ 质粒的 Ｔ ｒｉｓ‐ ＨＣｌ（ｐＨ ７畅 ６）溶液 ４００ μＬ 加入上述溶有 ＰＬＧＡ 的 ＤＣＭ 中 。 冰浴 ，超声破碎仪 （ＸＬ２０００ ，美国 Ｍ ｉｓｏ‐ ｎｉｘ 公司）超声功率设置为 Ｌｅｖｅｌ ２０ ，超声探头超声 １０ ｓ ，冷却 １０ ｓ ，循环 ３ 次 ，形成初次乳化液 。 将超 声后的初次乳化液加入到 ３０ ｍＬ ２％ ＰＶ Ａ 水溶液 中 。 冰浴下 ，超声 ２ ｍｉｎ ，功率为 Ｌｅｖｅｌ ２０ ，形成复乳 液 。 室温万下方磁数子据搅拌 １２ ｈ ；双蒸水重悬 ，１０ ０００ｇ 离
第 ４２ 卷第 ４ 期第 ２０１３ 年 ８ 月
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Ａｃｔａ
华中科技大学学报（医学版 ） Ｍ ｅｄ Ｕ ｎｉｖ Ｓｃｉ Ｔ ｅｃ ４ Ｐ畅 ３７７ Ａ ｕｇ畅 ２０１３
论 著
携 带 质 粒 的 Ｐ Ｌ Ｇ Ａ 纳 米 粒‐超 声 微 泡 复 合 体 的 构 建 及细胞相容性研究 倡
；张凯伦 ，男 ，１９５１ 年生 ｒ ，Ｅ‐ｍａｉｌ ：ｈｕｚｈｉｗ ｅｉｘ ｈ＠
，教授 ，Ｅ‐ｍａｉｌ １６３畅 ｃｏｍ
：Ｐ ｒ ｏ ｚ ｋｌ ＠
１６３畅 ｃｏ ｍ
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华中科技大学学报 （医学版 ） ２０１３ 年 ８ 月第 ４２ 卷第 ４ 期
瓣膜性心脏病 ，是当今成人心脏病中占较大比 例的疾病之一 。 心脏瓣膜置换术后 ，为避免植入物 血栓形成 ，患者术后需要接受抗凝治疗 。 如何避免 术后抗凝及减少抗凝相关并发症的发生 ，仍是人们 需要面临的一道难题 。 将基因治疗技术应用于术后 瓣膜抗凝治疗 ，以期达到局部抗凝强度增高 、减量或 不使用系统抗凝药物 ，从而减少甚至避免术后抗凝 相关并发症的发生 。 但要达到换瓣术后的长期局部 有效抗凝 ，则需要局部组织细胞长期 、持续 、稳定 、适 当的高表达抗凝因子 。 本实验拟构建携带有 ｔＰＡ 基因质粒的聚乳酸‐羟基乙酸共聚物 （ＰＬＧＡ ）纳米 粒 ，而后应用静电吸附原理 ，将其与含气脂质微泡结 合 ，形成质粒‐纳米粒‐超声微泡复合体 （ＰＥＮＭ Ｃ ） ， 以期该复合物具有一定的载药量 、缓释药物 、较好的 生物相容性 ，为后续将该质粒‐纳米粒‐超声微泡复 合体应用于基因治疗提供实验依据 。
１ 材料和方法
１畅 １ 材料
ＰＬＧＡ ，购自山东医疗器械研究所 ；ｐＩＲＥＳ‐ｔＰＡ‐ ＤｓＲｅｄ‐Ｅｘｐｒｅｓｓ２ 质粒由本课题组保存 ；二硬脂酸磷 脂酰 胆 碱 （ＤＳＰＣ ） 及 １ ，２‐硬 脂 酰‐３‐三 甲 基 丙 烷 （ＤＳ Ｔ Ａ Ｐ ）购自于 Ａｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ 公司 ；聚乙烯 醇 （ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ，ＰＶ Ａ ，ａｖｅｒａｇｅ Ｍ ｗ ８５ ０００ — １２４ ０００） ，聚乙二醇（４００）单硬脂酸酯 （ＰＥＧ‐４０ Ｓｔｅ‐ ａｒａｔｅ ，ＰＥＧ４０Ｓ）购于 Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ 公司 ；二氯甲烷 （Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ ，ＤＣＭ ） ，购于国药集团化学试剂 有限公司 ；全氟丙烷 （Ｃ３ Ｆ８ ）购于北京特种气体厂 ； 香豆素‐６（Ｃｏｕｍａｒｉｎ‐６ ） ，购于上海佳禾生物科技有 限公 司 ；ＰＢＳ 、ＤＭ ＥＭ ／Ｆ１２ 基 础 培 养 液 购 自 Ｈｙ‐ ｃｌｏｎｅ 公司 ；０畅 ２５％ Ｔ ｒｙｐｓｉｎ‐ＥＤ Ｔ Ａ 、胎牛血清购于 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司 。
倡 国家自然科学基金资助项目 （Ｎ ｏ畅 ３０８７２５４３ ）
＃ 同为第一作者 ，程 龙 ，男 ，１９８３ 年生 ，博士研究生 ，Ｅ‐ｍａｉｌ ：ｄｏｃｃｈｅｎｇｌｏｎｇ ＠ １６３畅 ｃｏｍ ；刘成珪 ，男 ，１９６２ 年生 ，副教授 ，
△
通
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