第三章 基因工程菌发酵ppt课件
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IPTG的浓度在0.2和0.5mmol/L:
酶的活性下降 ● 采用trp启动子
色氨酸和吲哚丙烯酸（IAA）影响外源基因的表 达
● 酵母表达系统 毕赤酵母和汉逊酵母等甲醇营养酵母表达系统 具有高表达效率和分泌功能
表达阶段，需甲醇进行诱导，同时还作为碳源 若甲醇浓度过低，影响外源基因的表达 若甲醇浓度过高，产生抑制作用 利用甲醇传感器进行在线检测和补料控制 控制甲醇浓度在0.3%，蛋白产量可增加5倍
式中S为限制性基质浓度，X﹢和X－分别为带有和丢失 质粒菌体的浓度（初始浓度为X0﹢和X0－），a、b为 系数
带质粒pYEαa4的酿酒酵母： 质粒丢失的速率（以葡萄糖为限制性基质）
基本培养基﹥复合培养基
基本培养基： μ的差异 复合培养基： μ的差异及质粒丢失的速率 ■不同的限制性基质对重组菌存在不同的影响
3.4 基因工程菌发酵过程的工艺控制
1、高密度培养 ●重组菌生长的障碍
■重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢 ■重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合 成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高 度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作 用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌的 比生长速率往往远小于宿主菌
5、代谢副产物的影响 培养过程的代谢副产物积累对重组产物的生产
产生影响 大肠杆菌培养：
产生副产物醋酸 对外源基因的表达具有强烈的抑制作用 大肠杆菌W3110(pEC901)培养表达α2干扰素： 随着醋酸浓度的增加 干扰素的比生产速率急剧下降
因此，发酵过程应避免醋酸的生成
减少乙酸积累的对策
■宿主菌
才能保证工程菌顺利实现产业化
基因工程菌生产的产品 细胞因子、疫苗、酶
● 基因工程菌的稳定性因素 ■菌株的构建： 基因剂量 载体性能 宿主特性 启动子 ■发酵工艺条件 培养基 限制性基质 生长速率
● 基因工程菌的不稳定性 分为脱落性不稳定和结构不稳定 脱落性不稳定： 指由于在基因工程菌的培养过程中发生重组基
■降低培养温度
将温度从37℃降低到26-30 ℃可以降低菌体对营养 物的吸收率，从而减少有机酸的形成
■透析培养
在重组菌的培养过程中可以利用透析技术除去发 酵液中有害物质，降低乙酸的含量从而实现重组 菌的高密度发酵
■限制性流加葡萄糖
利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要控制其 浓度在较低的范围内，减少乙酸的生成。目前大 多数高密度发酵均采取了限制性流加葡萄糖的方 法
不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱变使乙酸生 成途径中的两个关键酶，有一个突变了或活性降 低了，使乙酸合成受阻。
■培养基
培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源的含 量影响最大。在基本培养基中大肠杆菌产生的乙 酸比在复合培养基中产生少。另外用甘油取代葡 萄糖可以降低乙酸的生成
■降低比生长速率
细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，一 般来说，在合成培养基中，当重组菌的生长速率 超过某个临界值便产生乙酸。因此选取合适的比 生长速率才能达到高密度、高表达发酵
最佳比生长速率为0.2h－1
酶的比生产速率最高，达70u/(g·h)
● 诱导外源基因表达前、后的μ可能对外源基因表达 存在很大影响
大肠杆菌DH5α(pBV220)培养表达γ干扰素： 在30 ℃下连续培养，达稳态后 转到摇瓶42 ℃培养 表达前低μ具有较高的γ干扰素比生产速率
温度调控质粒复制重组大肠杆菌生产干扰素： μ为0.2h－1时升温比在0.025h－1时升温 干扰素产量提高4倍
●高表达的障碍 外源基因的不稳定，造成表达的下降。 高生长速率与高表达之间的矛盾 乙酸的产生 蛋白的降解
1、培养基 ●提供菌体必须的营养成分和适宜的环境 影响菌体的生长 影响产物的表达 ●重组菌培养 高菌体密度 高的产物生产速率（高表达）
生产速率： 指单位时间内单位发酵液体积的产物表达量
●均衡的培养基 实现菌体密度培养 减少代谢副产物积累 减少培养基的浪费
利用重组大肠杆菌生产荧光假单胞菌脂肪酶： 诱导后的比生长速率对酶的生产影响很大 低的μ0.1h－1比高的μ0.4h－1更有利于酶的生产
发酵过程中对重组菌的比生长速率进行控制 能较好地提高外源基因表达水平 提高重组产物的产量
3、培养条件 ● 溶氧DO的影响
重组菌的培养一般要求高密度培养 要求一定高的溶氧DO浓度 影响溶氧DO： 搅拌转速 罐压 空气流量 在进气中氧气含量 重组枯草杆菌生产α2干扰素： 较低的DO有利于生产
大肠杆菌AT2741(pSY130-14)生产苯丙氨酸： 38.5℃时产物产量最高，达18.6g/L
温度对重组蛋白降解也存在影响 重组枯草杆菌生产α2干扰素：
在37℃时干扰素发生降解 在25℃时干扰素稳定
● pH的影响 在重组菌的培养中需维持适宜的pH值 若产物为胞外产物， pH对重组蛋白的生产有很 大影响
不控制pH，但控制NH4+在10mmol/L 可将菌体浓度提高50%
NH4+高于170mmol/L 严重抑制菌体生长
在5~170mmol/L，随着NH4+升高，以氨为基准 的菌体得率下降（由24g/g下降为1g/g）
在大肠杆菌的高密度培养中， 应控制NH4+浓 度，以免发生抑制作用；
IAA用量增加 重组菌μ下降 分支酸合成酶（AS）和色氨酸合成酶（TS） 基因表达量较大提高 Trp－的比例上升
大肠杆菌DH5α(pBV857)培养表达γ干扰素： 温度由30 ℃升高到42 ℃ 随着γ干扰素的表达 带重组质粒的菌体的比例下降
3.3 影响外源基因表达的因素
●外源基因表达水平的影响因素 ■菌株的构建有关因素： 基因剂量、转录和翻译效率 重组DNA、mRNA及蛋白的稳定性 载体和宿主细胞特性 ■发酵工艺条件 培养基、生长速率等 ■反应器操作及过程控制和优化
大肠杆菌GM31(pBR325)在连续培养中：
限制性基质
影响
葡萄糖 氯化铵
低μ (0.15－1) 10代无四环素抗性
100代未失去抗性
高μ (0.55－1) 40代开始丢失质粒 10代开始失去耐药性
重组菌GY2345(pBR325)则表现不同
■质粒在不同的宿主中，有不同的稳定性 质粒pBR325在不同的宿主大肠杆菌中： 限制性基质：葡萄糖、镁盐、磷酸盐 稳定性有很大差异 葡萄糖和磷酸盐限制时最易发生质粒不稳定性 可能是它们提供合成DNA的材料和能量
增大比生速率μ，有利于提高质粒稳定性
● 其他培养条件 ■温度
变铅链霉菌66(pIJ2)，在连续培养中： 温度提高，质粒稳定性降低
重组酿酒酵母在分批补料培养中： 20℃下，重组质粒较稳定 温度升高，稳定性降低
■pH和DO ◆ pH
重组酿酒酵母： pH=6.0 重组菌的稳定性和乙肝表面抗原生产较好
◆ DO 低DO限制能量供应，稳定性较差 维持DO在70%
果胶酸裂合酶生产： 因子设计法优化培养基 酶产量由10u/mL提高到210u/mL
重组黑曲霉生产葡萄糖氧化酶： 添加酵母2g/L提取物 酶活提高130%
枯草杆菌DB403(pWL267)表达中性蛋白酶： 使用酵母膏和酪胨 提高蛋白酶的比生产速率
●限制性营养的种类和浓度 影响菌体生长和产物表达
重组酵母Y33︰︰YFD71-3培养生产蛋白： 需加入组氨酸，亮氨酸和腺嘌呤
重组酿酒酵母生产甲状腺旁素激素： pH由5.6提高到7.2，可以抑制蛋白酶的活性 使激素的含量提高到12.1mg/L
4、外源基因表达的诱导强度 ● 采用lac启动子
加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） 诱导外源基因的表达
在0.025~0.1mmol/L，增加IPTG的浓度:
可以提高重组青霉素G酰化酶的活性
甲醇营养酵母： 给出了培养基元素组成的要求
：
■培养基的优化 工作量很大 可利用优化方法来提高效率 正交设计法 均匀设计法 响应面法 利用连续培养结合脉冲注射方法寻找限制性
基质 Reiling利用这种方法获得大肠杆菌B/r以各种元素为
基准的菌体得率 ■pH和铵离子的影响
用NaOH和HCl调节pH，可提高菌体密度 用氨水代替NaOH调节pH，效果较差
● 比生长速率μ 在一定温度和pH下，限制性基质浓度是决定μ的
主要因素 重组菌的μ对质粒的稳定性有很大影响
大肠杆菌W3110(pEC901)： 分批补料培养中：不存在质粒的稳定性问题
在连续培养中 低μ (0.302－1)：重组质粒维持20代 高μ (0.705－1)：重组质粒维持80代
变铅链霉菌： 较低温度（28℃），提高μ 质粒稳定性提高
不同的菌株对氧的需求不同，每个菌株都有自己适 宜的DO浓度
● 温度的影响 温度调控基因表达或质粒复制 发酵过程一般分为生长和表达期两个阶段 分别维持不同的温度 最佳诱导温度随产物而异
大肠杆菌AR58(pOTS207)生产疟疾抗原： RN1的最佳诱导温度为39.5℃ RN2的最佳诱导温度为41.0℃
对4株重组大肠杆菌进行分批补料培养： 比较不同DO下的生长、质粒含量及酶活
在厌氧和好氧条件下（ DO=50%）： 重组菌生长优于厌氧条件 质粒含量高于厌氧条件 酶活性：两株相近，一株好氧时高，一株厌氧
时高 当DO分别维持在50%和100%：
3株菌体密度接近，1株在高DO下菌浓更高 质粒含量：2株相同，2株在高DO下下降 酶活性：4株差别不大
2、比生长速率μ ● μ是影响外源基因表达水平的重要因素
不同的重组菌的最佳μ不同 大肠杆菌W3110(pEC901)培养表达α干扰素：
比生长速率μ增大 α干扰素比生产速率增大
大肠杆菌TG1(pBB210)培养表达α1干扰素： 较低比生长速率（0.15h－1）
具有较高的α1干扰素表达效率 枯草杆菌DB403(pWL267)培养表达中性蛋白酶：
●高密度培养方法 可以提高目标产物的浓度 同样生产量下可以减小反应器体积，减少设备投资 有利于产物的分离提取
采用补料分批培养方法来实现：
可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可弥补 低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了 菌体的生长过程，从而有效实现重组菌高密度培养 （E. coli DCW可达100g/L） 几种反馈控制方法： 控制基质浓度流加、恒pH流加、恒溶氧流加、 控制比生长速率的葡萄糖流加
■ 固定化 固定化可以提高重组大肠杆菌的稳定性
重组大肠杆菌W3110(pTG201): 37℃ 连续培养时
游离细胞：260代13%质粒丢失 固定化细胞：240代无质粒丢失 固定的菌体在培养过程中逐渐释放使质粒的稳定性提高 ● 外源基因的表达 外源基因的表达引起重组质粒的不稳定性 大肠杆菌MV12(pVH5)： 吲哚丙烯酸（IAA）为trp操纵子阻遏物的部分阻遏去 剂
腺嘌呤为10mg/L： 菌量和产物变化不大，不限制
腺嘌呤继续减少： 菌量减少，蛋白量增加 单位菌体生产的蛋白大幅度提高
限制组氨酸： 对蛋白生产影响不大
限制亮氨酸： 对菌体生长和蛋白生产有明显影响
保持较低的腺嘌呤和较高的氨基酸浓度： 可以限制生长，而有利于将氨基酸用于蛋白生产
重组毕赤酵母： 添加有机氮源如蛋白胨 减少蛋白的分解 提高重组蛋白的生产
因的丢失造成的 结构不稳定： 指由于基因的突变造成的
研究基因工程菌的不稳定性 连续培养方式
3.2 基因工程菌的稳定性
1 工程菌稳定性对群体组成变化的影响 ● 工程菌的脱落性不稳定的模型 假定：
质粒丢失的概率为p， 重组菌和质粒丢失的宿主菌的比生长速率恒定 （分别为μ﹢和μ－）,
aS+X﹢→(2－ p) X﹢ +X－ bS+X－→2X－
但是过高的重组菌密度，并不意味着外源基因 的高表达 如大肠杆菌DH5α(pBV220)培养表达γ干扰素：
流加葡萄糖时的菌体密度比流加复合培养基低 但产物的产量反而更高
●高密度培养，要了解菌株的营养需求，对培养基 进行优化
■对细菌和所用的基本培养基的元素组成进行统计： 一些元素大大过量，如P、K、S、Na 另一些元素不足，如Cu、Zn
第三章 基因工程菌发酵
3.1 3.2 3.3 3.4
概述 基因工程菌的稳定性 影响外源基因表达的因素 基因工程菌发酵过程的工艺控制
3.1 概 述
利用基因工程菌： 生产各种蛋白 改造现有工业生产菌株
基因工程菌发酵水平： 菌种遗传特性 发酵工艺及控制 发酵罐的性能与操作
掌握工程菌的发酵特性、过程控制和优化及放 大特点：
酶的活性下降 ● 采用trp启动子
色氨酸和吲哚丙烯酸（IAA）影响外源基因的表 达
● 酵母表达系统 毕赤酵母和汉逊酵母等甲醇营养酵母表达系统 具有高表达效率和分泌功能
表达阶段，需甲醇进行诱导，同时还作为碳源 若甲醇浓度过低，影响外源基因的表达 若甲醇浓度过高，产生抑制作用 利用甲醇传感器进行在线检测和补料控制 控制甲醇浓度在0.3%，蛋白产量可增加5倍
式中S为限制性基质浓度，X﹢和X－分别为带有和丢失 质粒菌体的浓度（初始浓度为X0﹢和X0－），a、b为 系数
带质粒pYEαa4的酿酒酵母： 质粒丢失的速率（以葡萄糖为限制性基质）
基本培养基﹥复合培养基
基本培养基： μ的差异 复合培养基： μ的差异及质粒丢失的速率 ■不同的限制性基质对重组菌存在不同的影响
3.4 基因工程菌发酵过程的工艺控制
1、高密度培养 ●重组菌生长的障碍
■重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢 ■重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合 成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高 度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作 用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌的 比生长速率往往远小于宿主菌
5、代谢副产物的影响 培养过程的代谢副产物积累对重组产物的生产
产生影响 大肠杆菌培养：
产生副产物醋酸 对外源基因的表达具有强烈的抑制作用 大肠杆菌W3110(pEC901)培养表达α2干扰素： 随着醋酸浓度的增加 干扰素的比生产速率急剧下降
因此，发酵过程应避免醋酸的生成
减少乙酸积累的对策
■宿主菌
才能保证工程菌顺利实现产业化
基因工程菌生产的产品 细胞因子、疫苗、酶
● 基因工程菌的稳定性因素 ■菌株的构建： 基因剂量 载体性能 宿主特性 启动子 ■发酵工艺条件 培养基 限制性基质 生长速率
● 基因工程菌的不稳定性 分为脱落性不稳定和结构不稳定 脱落性不稳定： 指由于在基因工程菌的培养过程中发生重组基
■降低培养温度
将温度从37℃降低到26-30 ℃可以降低菌体对营养 物的吸收率，从而减少有机酸的形成
■透析培养
在重组菌的培养过程中可以利用透析技术除去发 酵液中有害物质，降低乙酸的含量从而实现重组 菌的高密度发酵
■限制性流加葡萄糖
利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要控制其 浓度在较低的范围内，减少乙酸的生成。目前大 多数高密度发酵均采取了限制性流加葡萄糖的方 法
不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱变使乙酸生 成途径中的两个关键酶，有一个突变了或活性降 低了，使乙酸合成受阻。
■培养基
培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源的含 量影响最大。在基本培养基中大肠杆菌产生的乙 酸比在复合培养基中产生少。另外用甘油取代葡 萄糖可以降低乙酸的生成
■降低比生长速率
细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，一 般来说，在合成培养基中，当重组菌的生长速率 超过某个临界值便产生乙酸。因此选取合适的比 生长速率才能达到高密度、高表达发酵
最佳比生长速率为0.2h－1
酶的比生产速率最高，达70u/(g·h)
● 诱导外源基因表达前、后的μ可能对外源基因表达 存在很大影响
大肠杆菌DH5α(pBV220)培养表达γ干扰素： 在30 ℃下连续培养，达稳态后 转到摇瓶42 ℃培养 表达前低μ具有较高的γ干扰素比生产速率
温度调控质粒复制重组大肠杆菌生产干扰素： μ为0.2h－1时升温比在0.025h－1时升温 干扰素产量提高4倍
●高表达的障碍 外源基因的不稳定，造成表达的下降。 高生长速率与高表达之间的矛盾 乙酸的产生 蛋白的降解
1、培养基 ●提供菌体必须的营养成分和适宜的环境 影响菌体的生长 影响产物的表达 ●重组菌培养 高菌体密度 高的产物生产速率（高表达）
生产速率： 指单位时间内单位发酵液体积的产物表达量
●均衡的培养基 实现菌体密度培养 减少代谢副产物积累 减少培养基的浪费
利用重组大肠杆菌生产荧光假单胞菌脂肪酶： 诱导后的比生长速率对酶的生产影响很大 低的μ0.1h－1比高的μ0.4h－1更有利于酶的生产
发酵过程中对重组菌的比生长速率进行控制 能较好地提高外源基因表达水平 提高重组产物的产量
3、培养条件 ● 溶氧DO的影响
重组菌的培养一般要求高密度培养 要求一定高的溶氧DO浓度 影响溶氧DO： 搅拌转速 罐压 空气流量 在进气中氧气含量 重组枯草杆菌生产α2干扰素： 较低的DO有利于生产
大肠杆菌AT2741(pSY130-14)生产苯丙氨酸： 38.5℃时产物产量最高，达18.6g/L
温度对重组蛋白降解也存在影响 重组枯草杆菌生产α2干扰素：
在37℃时干扰素发生降解 在25℃时干扰素稳定
● pH的影响 在重组菌的培养中需维持适宜的pH值 若产物为胞外产物， pH对重组蛋白的生产有很 大影响
不控制pH，但控制NH4+在10mmol/L 可将菌体浓度提高50%
NH4+高于170mmol/L 严重抑制菌体生长
在5~170mmol/L，随着NH4+升高，以氨为基准 的菌体得率下降（由24g/g下降为1g/g）
在大肠杆菌的高密度培养中， 应控制NH4+浓 度，以免发生抑制作用；
IAA用量增加 重组菌μ下降 分支酸合成酶（AS）和色氨酸合成酶（TS） 基因表达量较大提高 Trp－的比例上升
大肠杆菌DH5α(pBV857)培养表达γ干扰素： 温度由30 ℃升高到42 ℃ 随着γ干扰素的表达 带重组质粒的菌体的比例下降
3.3 影响外源基因表达的因素
●外源基因表达水平的影响因素 ■菌株的构建有关因素： 基因剂量、转录和翻译效率 重组DNA、mRNA及蛋白的稳定性 载体和宿主细胞特性 ■发酵工艺条件 培养基、生长速率等 ■反应器操作及过程控制和优化
大肠杆菌GM31(pBR325)在连续培养中：
限制性基质
影响
葡萄糖 氯化铵
低μ (0.15－1) 10代无四环素抗性
100代未失去抗性
高μ (0.55－1) 40代开始丢失质粒 10代开始失去耐药性
重组菌GY2345(pBR325)则表现不同
■质粒在不同的宿主中，有不同的稳定性 质粒pBR325在不同的宿主大肠杆菌中： 限制性基质：葡萄糖、镁盐、磷酸盐 稳定性有很大差异 葡萄糖和磷酸盐限制时最易发生质粒不稳定性 可能是它们提供合成DNA的材料和能量
增大比生速率μ，有利于提高质粒稳定性
● 其他培养条件 ■温度
变铅链霉菌66(pIJ2)，在连续培养中： 温度提高，质粒稳定性降低
重组酿酒酵母在分批补料培养中： 20℃下，重组质粒较稳定 温度升高，稳定性降低
■pH和DO ◆ pH
重组酿酒酵母： pH=6.0 重组菌的稳定性和乙肝表面抗原生产较好
◆ DO 低DO限制能量供应，稳定性较差 维持DO在70%
果胶酸裂合酶生产： 因子设计法优化培养基 酶产量由10u/mL提高到210u/mL
重组黑曲霉生产葡萄糖氧化酶： 添加酵母2g/L提取物 酶活提高130%
枯草杆菌DB403(pWL267)表达中性蛋白酶： 使用酵母膏和酪胨 提高蛋白酶的比生产速率
●限制性营养的种类和浓度 影响菌体生长和产物表达
重组酵母Y33︰︰YFD71-3培养生产蛋白： 需加入组氨酸，亮氨酸和腺嘌呤
重组酿酒酵母生产甲状腺旁素激素： pH由5.6提高到7.2，可以抑制蛋白酶的活性 使激素的含量提高到12.1mg/L
4、外源基因表达的诱导强度 ● 采用lac启动子
加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） 诱导外源基因的表达
在0.025~0.1mmol/L，增加IPTG的浓度:
可以提高重组青霉素G酰化酶的活性
甲醇营养酵母： 给出了培养基元素组成的要求
：
■培养基的优化 工作量很大 可利用优化方法来提高效率 正交设计法 均匀设计法 响应面法 利用连续培养结合脉冲注射方法寻找限制性
基质 Reiling利用这种方法获得大肠杆菌B/r以各种元素为
基准的菌体得率 ■pH和铵离子的影响
用NaOH和HCl调节pH，可提高菌体密度 用氨水代替NaOH调节pH，效果较差
● 比生长速率μ 在一定温度和pH下，限制性基质浓度是决定μ的
主要因素 重组菌的μ对质粒的稳定性有很大影响
大肠杆菌W3110(pEC901)： 分批补料培养中：不存在质粒的稳定性问题
在连续培养中 低μ (0.302－1)：重组质粒维持20代 高μ (0.705－1)：重组质粒维持80代
变铅链霉菌： 较低温度（28℃），提高μ 质粒稳定性提高
不同的菌株对氧的需求不同，每个菌株都有自己适 宜的DO浓度
● 温度的影响 温度调控基因表达或质粒复制 发酵过程一般分为生长和表达期两个阶段 分别维持不同的温度 最佳诱导温度随产物而异
大肠杆菌AR58(pOTS207)生产疟疾抗原： RN1的最佳诱导温度为39.5℃ RN2的最佳诱导温度为41.0℃
对4株重组大肠杆菌进行分批补料培养： 比较不同DO下的生长、质粒含量及酶活
在厌氧和好氧条件下（ DO=50%）： 重组菌生长优于厌氧条件 质粒含量高于厌氧条件 酶活性：两株相近，一株好氧时高，一株厌氧
时高 当DO分别维持在50%和100%：
3株菌体密度接近，1株在高DO下菌浓更高 质粒含量：2株相同，2株在高DO下下降 酶活性：4株差别不大
2、比生长速率μ ● μ是影响外源基因表达水平的重要因素
不同的重组菌的最佳μ不同 大肠杆菌W3110(pEC901)培养表达α干扰素：
比生长速率μ增大 α干扰素比生产速率增大
大肠杆菌TG1(pBB210)培养表达α1干扰素： 较低比生长速率（0.15h－1）
具有较高的α1干扰素表达效率 枯草杆菌DB403(pWL267)培养表达中性蛋白酶：
●高密度培养方法 可以提高目标产物的浓度 同样生产量下可以减小反应器体积，减少设备投资 有利于产物的分离提取
采用补料分批培养方法来实现：
可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可弥补 低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了 菌体的生长过程，从而有效实现重组菌高密度培养 （E. coli DCW可达100g/L） 几种反馈控制方法： 控制基质浓度流加、恒pH流加、恒溶氧流加、 控制比生长速率的葡萄糖流加
■ 固定化 固定化可以提高重组大肠杆菌的稳定性
重组大肠杆菌W3110(pTG201): 37℃ 连续培养时
游离细胞：260代13%质粒丢失 固定化细胞：240代无质粒丢失 固定的菌体在培养过程中逐渐释放使质粒的稳定性提高 ● 外源基因的表达 外源基因的表达引起重组质粒的不稳定性 大肠杆菌MV12(pVH5)： 吲哚丙烯酸（IAA）为trp操纵子阻遏物的部分阻遏去 剂
腺嘌呤为10mg/L： 菌量和产物变化不大，不限制
腺嘌呤继续减少： 菌量减少，蛋白量增加 单位菌体生产的蛋白大幅度提高
限制组氨酸： 对蛋白生产影响不大
限制亮氨酸： 对菌体生长和蛋白生产有明显影响
保持较低的腺嘌呤和较高的氨基酸浓度： 可以限制生长，而有利于将氨基酸用于蛋白生产
重组毕赤酵母： 添加有机氮源如蛋白胨 减少蛋白的分解 提高重组蛋白的生产
因的丢失造成的 结构不稳定： 指由于基因的突变造成的
研究基因工程菌的不稳定性 连续培养方式
3.2 基因工程菌的稳定性
1 工程菌稳定性对群体组成变化的影响 ● 工程菌的脱落性不稳定的模型 假定：
质粒丢失的概率为p， 重组菌和质粒丢失的宿主菌的比生长速率恒定 （分别为μ﹢和μ－）,
aS+X﹢→(2－ p) X﹢ +X－ bS+X－→2X－
但是过高的重组菌密度，并不意味着外源基因 的高表达 如大肠杆菌DH5α(pBV220)培养表达γ干扰素：
流加葡萄糖时的菌体密度比流加复合培养基低 但产物的产量反而更高
●高密度培养，要了解菌株的营养需求，对培养基 进行优化
■对细菌和所用的基本培养基的元素组成进行统计： 一些元素大大过量，如P、K、S、Na 另一些元素不足，如Cu、Zn
第三章 基因工程菌发酵
3.1 3.2 3.3 3.4
概述 基因工程菌的稳定性 影响外源基因表达的因素 基因工程菌发酵过程的工艺控制
3.1 概 述
利用基因工程菌： 生产各种蛋白 改造现有工业生产菌株
基因工程菌发酵水平： 菌种遗传特性 发酵工艺及控制 发酵罐的性能与操作
掌握工程菌的发酵特性、过程控制和优化及放 大特点：