基因工程大题

1.什么是密码子偏好性，在基因工程中如何解决密码子偏好性问题？
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。

解决方法：A外源基因全合成。

按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法。

B同步表达相关tRNA编码基因。

对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利
2.简述DNA测序的原理和方法。

其基本原理是DNA的复制反应体系中需要存在DNA聚合酶、DNA模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3'f 5’的方向移动，dNTP按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3’一OH末端。

1、末端终止法
2、化学裂解法
3、DNA测序自动化
2.什么是基因治疗，基因治疗能治疗哪些疾病？
基因治疗是指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗的目的。

复合免疫缺陷综合征、乙型血友病、黑色素瘤
2.说明Sanger DNA测序法的原理。

每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’ -OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。

每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。

它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

2.什么是重组率，如何提高重组率？
重组率：连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比。

a提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1
b载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：
c加装同聚尾末端：
3.为了使一个天然的质粒能够用做载体，主要进行哪几个方面的改造?
修改复制起始位点
添加抗生素抗性基因
添加多克隆位点
敲除转座子
敲除不用的蛋白编码段
5.简单说明缺刻平移法标记探针的过程。

反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5 ’ f 3’外切酶活性，在缺口处按5'f 3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I 有5’ f 3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。

随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。

DNA 聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。

6.PCR体系中都有哪些成分？当PCR出带不理想的时候，主要进行哪些方面的
调整？
引物、Tap DNA聚合酶、4种dNTP混合物、模板和缓冲液
PCR的反应条件和很多参数有着密切的关系。

在实验设计中我们要考虑到模板
浓度的大小，设计引物时也要主要引物长度适当以及恰当的GC含量，在PCR 体系中引物浓度，dNTPs浓度相对要均衡，选取的taq DNA聚合酶，缓冲液的离子含量也是影响产物的结果，另外就是要根据产物大小设定适当的变性时间，退火温度及时间，延伸的时间。

6.简述锚定PCR的原理和方法。

原理：一段引物已经确定，另一端引物待定时(人工合成的特异引物)，使用一
条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA。

方法：已知序列3’端区域的扩增
先以mRNA为模板，以Oligo(dT)为引物，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后将RNA-cDNA杂合体变性后，加入特异的5’端引物，使之和Oligo(dT)一起在TaqDNA聚合酶的作用下扩增特异引物3’端下游区域。

为了提高特异性，人们往往在这一轮PCR后用另外一个特异5’端引物进行第二轮PCR 扩增
9.什么是基因沉默？基因沉默的原因有哪些？
由于转基因的拷贝数和构型、环境条件和发育因子，以及DNA的甲基化等作用导致基因失活的现象。

1位置效应：
2 DNA甲基化：
3重复序列诱发基因沉默:
4共抑制
10.简述酵母双杂交系统的基本原理。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白一蛋白的相互
作用。

主要有二类载体：a含DNA结合结构域的载体；b含转录激活结构域的载体。

上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。

融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。

8.如何利用T-DNA插入法克隆植物基因？
具体思路是将外源T—DNA转入植物基因组，以T—DNA作为插入标记，来分离或克隆因为插入而失活的基因并研究基因功能。

由于T—DNA左右边界及内
部的基因结构是已知的，因此对获得的转基因T-DNA插入突变体就可以通过已知的外源基因设计引物，利用相应的PCR策略进行突变基因的克隆和序列分析，对比突变的表型进而研究基因的生理生化功能。

9.载体的功能与应具备的条件。

具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
具有较高的外源DNA的装载能力
具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点
具有合适的筛选标记
10.什么是蓝白斑筛选法？
答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。

主要是在载体的非必要区
插入一个带有大肠杆菌一半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的载体转入lac的宿主菌后，在含有X-ga 1平板上形成浅蓝色的噬菌斑。

外源基因插人lac或1 ac基因部分被取代后，重组的噬菌体将丧失分解X-ga 1的能力，转入X-gal 平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。