结核分枝杆菌CFP10和ESAT6优势肽段融合蛋白的表达及其免疫学研究

结核分枝杆菌CFP10和ESAT6优势肽段融合蛋白的表达及其免疫学
研究
目的:构建结核分枝杆菌分泌蛋白的重组质粒及工程菌,获得纯化的CFP10-ESAT6P蛋白抗原,制备初步用于检测结核病患者的特异性抗体。

方法:根据编码结核分枝杆菌基因序列设计引物,克隆表达结核CFP10-ESAT6重组蛋白,表达产物免疫新西兰大白兔,其中80%可产生高价的抗体。

利用产物建立IgG间接ELISA方法鉴定其抗原性及实用性。

结果:应用ELISA法,通过检测113例结核病患者、82例非结核病患者及健康献血员,CFP10-ESAT6P和对照PPD对结核病患者血清检测的敏感性分别为89.4%和79.6%,特异性分别为96.3%和93.9%。

结论:高效表达纯化的CFP10-ESAT6蛋白抗原性强,可用于结核病患者抗体的检测,用于结核病的辅助诊断。

[Abstract] Objective: To construct the recombinant plasmid and engineering bacteria for expression of Mycobacterium tuberculosis secretion protein CFP10-ESAT6P and produce antibody for testing human tuberculosis antisera. Methods: DNA encoding protein CFP10 and ESAT6-peptide were amplified from Mycobacterium tuberculosis H37Rv chromosomal by PCR using primers which were designed in accordance with the reported gene sequence. The purified protein was injected into New Zealand rabbits and 80% showed high valence. Then antibody was analyzed by ELISA depended on IgG for testing the antigenicity and practicality. Results:By testing 113 cases of TB patients, 82 cases of none TB patients and healthy candidates by using ELISA, the sensitivity and specificity of CFP10-ESAT6P and control PPD to the antisera were compared, the sensitivity was 89.4% and 79.6% respectively, and the specificity was 96.3% and 93.9% respectively. Conclusion: The results show high titer polyclonal antibody against CFP10-ESAT6 fusion protein was obtained. It can be used for human tuberculosis antisera testing and aided diagnosis by IgG depended ELISA.
[Key words] Mycobacterium tuberculosis; CFP10; ESAT6; Recombinant expression; Antibody
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是一种重要的人类及动物致病菌,严重威胁着人类的健康。

目前,结核分枝杆菌的检测方法主要有细菌学、免疫学和分子生物学方法[1]。

免疫学检查的诊断价值虽然不如细菌学检查,但其诊断既简便、快速,又有一定的敏感性和特异性,是诊断结核病的有效方法。

建立此类方法的关键是获得高纯度的特异性诊断用抗原。

近年来,人们分离出多种结核杆菌分泌蛋白MPB64、MPB70、Ag85、CFP10、早期分泌性抗原靶(ESAT6)等,其中,CFP10和ESAT6具有良好的免疫原性,且为结核分枝杆菌所特有,结核菌疫苗及非致病分枝杆菌则缺乏该蛋白[2]。

因此,可以此区别是结核分枝杆菌感染还是结核菌疫苗接种。

ESAT6蛋白质由结核分枝杆菌
RD1位点上的ESAT6基因(288 bp)编码,它在结核分枝杆菌感染早期即能被机体的免疫系统识别,引发强烈的免疫反应。

由于特异性细胞表位可以引发专一性的免疫反应,避免非特异性表位的影响[3],因此,截取包含优势特异性细胞表位的区域进行功能研究和应用具有一定的优势。

本研究成功构建表达CFP10-ESAT6蛋白的工程菌,建立了纯化方法,获得了高纯度CFP10-ESAT6P蛋白,与传统的结核杆菌纯蛋白衍生物(PPD)相比有较好的抗原特异性,可作为抗原检测结核抗体。

1 材料与方法
1.1材料
pET30a载体、结核分枝杆菌H37Rv标准菌株和大肠埃希菌DH5α、BL21(华美生物技术有限公司),pMD18-T载体(大连宝生物工程有限公司),限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4連接酶、DNA快速纯化试剂盒(北京天根生化科技公司),琼脂糖、IPTG、蛋白质相对分子质量marker(美国Sigma公司),其他试剂为进口或国产分析纯。

78例结核涂片阴性、35例涂片阳性、50例健康献血员、32例非结核病患者(肺炎、肺癌、其他呼吸道疾病患者)均为我院住院及查体人员。

新西兰大白兔购自上海生旺实验动物养殖有限公司,普通等级,体重 2.0～2.5 kg;弗氏佐剂、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和羊抗人IgG购自美国Sigma公司;底物四甲基联苯胺(TMB)购自北京奇华盛生物技术发展中心;镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA)购自Novagen公司。

1.2 方法
1.2.1引物设计与合成参考GenBank中的结核分枝杆菌标准株H37Rv的ESAT6(216 bp)及CFP10(303 bp)基因序列设计引物,在CFP10上游引入EcoRⅠ酶切位点,下游引入5个甘氨酸柔性接头(序列为GGA GGT GGA GGT GGA);在ESAT6上游同样引入5个甘氨酸柔性接头,下游引入XhoⅠ酶切位点。

CFP10上游引物:5’-GCG AAT TCA TGG CAG AGA TGA AG-3′,CFP10下游引物:5’-GGA GGT GGA GGT GGA GAA GCC CAT TTG CG-3′;ESAT6上游引物:5’-GGA GGT GGA GGT GGA ATG ACA GAG CAG CAG TGG AAT-3′,ESAT6下游引物:5’-CCG CTC GAG TGC AGC GCG TTG TTC AGC T-3′[4],引物由宝生物(大连)公司合成。

1.2.2 CFP10-ESAT6P基因的构建及克隆以结核分枝杆菌基因组的DNA为模板,分别以ESAT6和CFP10引物进行PCR扩增。

产物经琼脂糖凝胶电泳割胶回收,各取1 μl,分别以CFP10上游引物和ESAT6下游引物进行重叠PCR扩增,反应条件同上,产物经琼脂糖凝胶电泳割胶回收,得到目的基因,与pMD18-T在16℃下连接转化感受态细胞DH5α后,涂板于含氨苄青霉素100 μg/ml的LB平板上,挑选单菌落抽提质粒进行酶切鉴定,将目的片段与pET30a载体在T4 DNA连接酶的作用下16℃连接过夜,转化于DH5α中,阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序,测序结果用Staden Package软件分析,并用Clustal Ⅹ与原始序列进行比对。

序列
正确的克隆转化到大肠埃希菌BL21中,证实重组表达质粒构建成功。

1.2.3工程菌构建挑取BL21(DE3)/pET30a-CFP10-ESAT6P单菌落接种于含50 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃培养过夜;次日以1%的接种量加入20 ml LB液体培养基中,37℃摇床培养至A600为0.6～0.8时,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续诱导4 h,取少量菌液进行SDS-PAGE鉴定,考马斯亮蓝R2250染色。

1.2.4 重组结核蛋白的制备和纯化经小量表达鉴定后进行大量表达,挑取单克隆菌落于20 ml含氨苄青霉素100 μg/ml的LB培养基中,37℃摇床培养过夜,次日转接于300 ml LB培养基中,摇床培养2 h,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导4 h,用8 mol/L的尿素溶解过夜,Ni-NTA纯化重组蛋白,透析复性后,-20℃保存。

1.2.5 蛋白抗原ELISA法检测用碳酸盐包被液稀释重组结核蛋白,包被酶标板,4℃过夜;次日每孔加入100 μl待检血清,37℃反应60 min;PBS-T洗板5次,加入100 ml HRP-羊抗人酶标液,37℃反应60 min;PBS-T洗板5次,每孔加A、B显色液各50 ml,37℃显色15 min,每孔加50 ml 2 mmol/L H2SO4溶液终止反应,测定A450值。

1.2.6 Western blot分析SDS-PAGE后进行电转印,封闭后加入人抗结核阳性血清,4℃过夜后加羊抗人IgG,37℃孵育2 h,经DAB染色后照相,观察结果。

1.2.7 兔抗血清的制备及抗体效价检测用PBS将蛋白稀释为300 μg/ml,共免疫5只兔子。

首次免疫用2 ml注射器吸取0.5 ml蛋白和0.5 ml弗氏不完全佐剂,充分混匀,乳化后,每只动物注射1 ml。

注射方法为脊柱两侧皮下多点注射。

共免疫3次,放血,取上清,分装后-20℃保存。

2 结果
2.1 pET30a-CFP10-ESAT6P克隆构建
ESAT6、CFP10和CFP10-ESAT6P经PCR扩增,分别获得216 bp、303 bp和540 bp的片段,重组质粒pET30a-CFP10-ESAT6P经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,获得5 422 bp的pET30a载体片段和540 bp的融合基因片段,与预期大小一致。

见图1。

图1 pET30a-CFP10-ESAT6P克隆构建过程电泳结果
[M:DL2000 DNA分子marker;1:ESAT6P基因PCR产物(216 bp);2:CFP10基因PCR产物(303 bp);3:CFP10-ESAT6P融合基因PCR产物(540 bp);4:pET30a-CFP10-ESAT6P重组质粒的EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切产物]
2.2 重组蛋白的定量表达和纯化
CFP10-ESAT6P重组蛋白经SDS-PAGE分析,获得约22 ku的目的条带,与预
计大小相符。

纯化产物经SDS-PAGE电泳分析,在22 ku处有目的条带出现。

见图2。

图2包涵体和纯化后CFP10-ESAT6E1蛋白的SDS-PAGE检测
(M:标准蛋白;1:全菌体溶解上清液;2:包涵体;3:纯化后)
2.3兔血清抗体效价的测定
见表1。

结果表明,抗CFP10-ESAT6P蛋白抗体在1∶8 000稀释条件下,仍然能获得较高的吸光度值,证明成功地获得了高效价的特异性免疫血清。

2.4 表达产物的Western blot分析
经DAB染色后在22 kD处出现棕色条带,见图3。

可见结核CFP10-ESAT6蛋白在表达载体中得到表达。

图3 表达产物的Western blot分析结果
(M:标准蛋白;1:上清;2:表达产物)
2.5应用间接ELISA法检测结核抗体IgG
用重组蛋白包被酶标板建立间接ELISA法,与PPD为抗原的ELISA试剂盒同时检测,结果见表2。

表2 CFP10-ESAT6用ELISA法检测人血清[n(%)]
由表1、2可知,CFP10-ESAT6和对照PPD应用ELISA法对结核病患者血清检测敏感性分别为89.4%[(66+35)/(78+35)]和79.6%[(56+34)/(78+35)];特异性分别为96.3%和93.9%。

结果表明,CFP10-ESAT6作为结核诊断的抗原比传统的PPD 具有更好的敏感性和特异性。

3讨论
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病,是危害人类健康的重要传染病之一,对结核分枝杆菌的研究是全球研究的热点。

控制结核病的流行与蔓延的关键在于找到简便、快速、靈敏度高、特异性强的诊断方法。

免疫学检查以其诊断简便、快速,又有一定的敏感性和特异性,成为较为常用的结核病诊断方法之一[5]。

对特异性抗原的筛选一直是结核分枝杆菌免疫学研究的重点,CFP10和
ESAT6基因都位于结核分枝杆菌的RD1区,CFP10基因位于ESAT6基因上游[6]。

由于CFP10和ESAT6基因的位置相互邻近,又是同时转录,所以有学者认为这种蛋白不仅能协同表达[7],而且在功能上有可能相互作用。

通过对结核分枝杆菌基因组的研究发现,这个基因为牛型和人型结核杆菌所特有,结核菌疫苗及其他非致病性分枝杆菌都缺乏这个基因。

因此,该基因一直是结核杆菌诊断和致病性研究的重点。

国外许多研究人员利用基因工程手段来克隆、表达ESAT6蛋白。

2005年,Kulshrestha等[3]利用带有T7启动子的表达载体成功表达纯化了ESAT6蛋白。

ESAT6具有多个与T、B细胞反应的表位,其主要的免疫优势细胞表位位于蛋白分子前70位氨基酸(aa)内,是结核分枝杆菌特异性非常高的蛋白[8],有较高的诊断价值。

本实验构建了CFP10和ESAT6免疫优势肽段的亚分子融合蛋白原核表达系统,表达CFP10和多表位肽ESAT6P。

5个柔性氨基酸的多肽接头能减少甘氨酸的抗原性。

本实验的主要目的之一是作为结核抗体检测的重要抗原,用于结核病的早期诊断,检测结果显示,以CFP10-ESAT6和对照PPD为抗原,应用ELISA法对结核病患者血清进行检测,敏感性分别为89.4%[(66+35)/(78+35)]和79.6%[(56+34)/(78+35)];特异性分别为96.3%和93.9%,表明以CFP10和ESAT6免疫优势肽段的亚分子融合蛋白作为抗原,避免了非特异性表位的影响,充分发挥了特异性细胞表位引发的专一性免疫反应,比传统的检测方法具有更高的敏感性和特异性。

本实验的另一个目的是获得该融合蛋白的特异性抗体,并将其作为诊断试剂在临床上运用。

在免疫实验中,有4只兔子的抗CFP10-ESAT6P蛋白抗体在1∶8 000稀释条件下,仍然能获得较高的吸光度值,证明成功地获得了高效价的特异性免疫血清,为结核分枝杆菌的血清学诊断奠定了基础。

国内外虽已有很多学者通过免疫印迹或者直接用此类蛋白作为抗原,通过ELISA直接检测人和动物的抗体水平[9-10],但是这些方法都是用抗原来检测抗体。

用抗体来检测抗原比用抗原来检测抗体更具优势,因为机体受到结核分枝杆菌感染后,体内首先出现的是抗原,因此,通过ELISA法检测抗原所具有的早期诊断价值更大[11]。

本实验在国内首次得到抗CFP10-ESAT6P融合蛋白的抗血清,为结核分枝杆菌疫苗和免疫诊断试剂的研发打下基础,对人结核病的快速诊断及器官移植术后并发结核感染的免疫诊断和鉴别也有重要意义。

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