不同培养基组分对黄檗花粉离体萌发的影响

不同培养基组分对黄檗花粉离体萌发的影响
肖美林;孙悦;叶梅燕;陈婉霞;张金秋;秦佳梅;刘丽娟
【摘要】以期筛选出黄檗花粉离体萌发最适宜的培养基,以新鲜的黄檗花粉为研究对象,采用花粉离体培养的方法,通过L9(34)正交试验设计,探究蔗糖、硼酸和硝酸钙对黄檗花粉离体萌发的影响.结果表明:蔗糖对黄檗花粉萌发率的影响最大,而对花粉管长度无显著影响;硼酸对花粉管长度的影响最大,而对萌发率无显著影响;硝酸钙对二者均有影响.黄檗花粉离体萌发最适宜的培养基为:10％蔗糖+0.008％硼酸+0.02％硝酸钙.
【期刊名称】《人参研究》
【年(卷),期】2018(030)006
【总页数】4页(P15-18)
【关键词】黄檗;花粉;离体培养
【作者】肖美林;孙悦;叶梅燕;陈婉霞;张金秋;秦佳梅;刘丽娟
【作者单位】通化师范学院吉林通化·134002;通化师范学院吉林通化·134002;通化师范学院吉林通化·134002;通化师范学院吉林通化·134002;通化师范学院吉林通化·134002;通化师范学院吉林通化·134002;通化师范学院吉林通化·134002【正文语种】中文
黄檗（Phellodendron amurense Rupr.）属芸香科（Rutaceae）黄檗属植物，又名黄柏、黄波罗、关黄柏等[1]。

在我国主要分布在东北地区，河北、北京、内
蒙古、山西有少量分布[2]。

雌雄异株，虫媒花[3]。

以树皮入药，含小檗碱、药根碱、黄檗酮、黄檗内脂及少量防己碱等成分，有清热泻火、健脾止泻、燥湿解毒和抑菌等功效[4]。

由于20世纪80～90年代人类的严重破坏，野生黄檗资源急剧减少。

1987年《中国珍稀濒危保护植物名录》（第一册）将黄檗定为渐危种[5]。

植物花器官的正常发育、授粉和授精在植物的繁殖中是最重要和关键的过程[6]。

花粉是高等开花植物的重要雄性结构，花粉的正常萌发和花粉管生长是实现授粉和授精作用的前提[7]。

而野生黄檗多是零星分散在阔叶混交林中，为昆虫传粉带来不便，从而授粉受到一定的限制[3]。

本实验意在研究外源营养物质对黄檗花粉萌发和花粉管伸长影响，探索出黄檗花粉离体萌发最适宜的培养基，为黄檗的人工授粉提供理论基础。

1 材料与方法
1.1 实验材料
新鲜黄檗花粉，采自通化师范学院绿化美化校园的黄檗雄株。

1.2 实验方法
1.2.1 采集方法
在晴天上午8点，采集含苞待放的花蕾，参考李佛莲等方法[8]，收集黄檗花粉，待用。

1.2.2 培养方法
花粉离体萌发采用固体琼脂培养基萌发法。

将熬制好的培养基用胶头滴管均匀的滴在载玻片上，用牙签蘸取当日采集的花粉均匀涂抹到培养基表面，每个处理重复三次。

将载玻片放到垫有湿润滤纸的培养皿中[9]，置于25℃的恒温恒湿培养箱中培养，3h后统计花粉萌发率并测量花粉管长度。

1.2.3 实验处理
a.单因素实验
实验设置以下处理：不同蔗糖浓度（1%、2%、5%、10%、15%、20%）+0.01%硼酸+0.01%硝酸钙+5g/L琼脂；不同硼酸浓度（0.001%、0.004%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%）+10%蔗糖+0.01%硝酸钙+5g/L琼脂；不同硝酸钙浓
度（0.001%、0.004%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%）+10%蔗糖+0.01%硼酸+5g/L琼脂。

b.正交实验
在单因素实验基础上采用三因素三水平L9（34）正交实验设计，筛选出最适培养基。

1.2.3 数据统计与分析
在光学显微镜10×10倍下对花粉萌发情况进行观测并记录。

借鉴王玉林等[10]实
验方法，以花粉管长度等于或超过花粉粒直径视为已萌发，每处理每重复观察记录3个视野，每个视野统计约50粒花粉计算萌发率；每片随机选取10粒已萌发的
花粉测量花粉管长度。

花粉萌发率 =已萌发的花粉数/花粉粒总数×100%
采用Excel和SPSS统计软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析
2.1 单因素各处理对黄檗花粉萌发率的影响
2.1.1 不同蔗糖浓度对花粉萌发率的影响
蔗糖浓度对黄檗花粉萌发的影响极其显著，随着浓度的增加呈现先增加后减少的趋势，当蔗糖体积分数达10%时，花粉萌发率达最大为33.50%，之后随着蔗糖体
积分数的增大，花粉萌发率呈下降趋势，抑制了花粉的萌发（见图1）。

由此可见，适宜的蔗糖浓度能有效的促进花粉萌发。

2.1.2 不同硼酸浓度对花粉萌发率的影响
如图2所示，硼酸质量分数在0.001%～0.008%之间，花粉萌发率呈先增加后减
少的趋势，在质量分数为0.004%时达最大，为45.83%；之后随着硼酸浓度的增加，花粉萌发率再次呈现先增加后减少的趋势，在质量分数为0.01%时达最大为33.50%，但明显低于体积分数为0.004%时的花粉萌发率，且与体积分数为
0.008%的花粉萌发率差异性并不显著。

图1 不同蔗糖浓度下花粉萌发率Fig.1 pollen germination rateunder differentsucroseconcentration
图2 不同硼酸浓度下花粉萌发率Fig.2 pollen germination rate under different boric acid concentration
2.1.3 不同硝酸钙浓度对花粉萌发率的影响
黄檗花粉萌发率在硝酸钙体积分数为0.02%时达最大，39.84%。

当质量分数为
0.03%，花粉萌发率明显降低，且低于体积分数为0.001%～0.01%之间的花粉萌
发率，因此，较低浓度的硝酸钙即可促进花粉萌发。

图3 不同硝酸钙浓度下花粉萌发率Fig.3pollengerminationrateunder differentcalciumnitrateconcentrations
图4 组合4花粉萌发情况Fig.4 Combination 4 pollen germination
图5 组合9花粉萌发情况Fig.5 Combination 9 Pollen germination
2.2 正交实验各处理对黄檗花粉萌发的影响
从单因素实验结果可知，适宜浓度的蔗糖，硼酸和硝酸钙对黄檗花粉萌发有促进作用，选取各因素适宜的浓度梯度进行三因素三水平L9（34）正交实验，根据花粉
萌发率和花粉管长度筛选最适宜培养基。

其培养基的基础成分为：5g/L琼脂+蒸
馏水。

各因素和水平如表1所示。

表 1 L9（34）正交实验设计Table 1 Orthogonal experiment Design L9 （34）水平因素factor Level （A）蔗糖/%Sucrose/%（B）硼酸/%H3BO3/%（C）硝酸钙/%Ca（NO3）2 1 5 0.001 0.01 2 10 0.004 0.02 3 15 0.008 0.03
2.2.1 实验各处理的花粉萌发率和花粉管长度
表 2 L9（34）正交实验结果Table 2 The results of Orthogonal experimental
L9 （34）
由表2可见，在25℃条件下培养3h后，不同处理的培养基中黄檗花粉都能萌发，但萌发率与花粉管长度有较明显的差异。

其中组合4花粉萌发率最高，达46.53%，且长势良好，如图4所示，组合2、6次之，平均为30.78%～38.68%，组合9、7花粉萌发率较低，平均为14.15%～18.62%；组合9花粉管长度最长，达
194.00μm，但萌发率较低，如图5所示，组合3次之，为155.38μm，组合1花粉管长度最短，为97.64μm。

2.2.2 不同浓度的培养基对花粉萌发率和花粉管长度的影响
通过对实验结果极差分析和方差分析（表3）可以看出，各因素对花粉萌发率的
影响为：A（蔗糖）＞C（硝酸钙）＞B（硼酸）；各因素对花粉管长度的影响为：B（硼酸）＞C（硝酸钙）＞A（蔗糖）。

然而硝酸钙对花粉萌发和花粉管长度的影响均达极显著水平，蔗糖对花粉萌发率的影响达极显著水平，对花粉管长度无显著影响，硼酸对花粉管长度的影响达极显著水平，对花粉萌发率无显著影响。

从各因素水平来看，3个因素对花粉萌发率的影响大小依次为A （2，1，3）、B（2，3，1）、C（1，2，3），对花粉管长度的影响大小依次为 A（3，1，2）、B（3，2，1）、C（2，3，1），由此可以得出，基于对黄檗花粉萌发率的影响，最优组合
培养基为A2B2C1，基于对花粉管长度的影响，最优组合培养基为A3B3C2。

表3 L9（34）正交实验结果极差分析和方差分析
Table3OrthogonalexperimentalresultsL9 （34）analysisandvarianceanalysis 2.2.3 各因素质量浓度的多重比较
表4 各因素质量浓度的多重比较Table 4 Multiplecomparisons of mass concentrations of factors
由以上方差分析已得出蔗糖和硼酸分别对花粉管长度和花粉萌发率无显著影响，通过对各质量浓度的多重比较（表4）发现，A2对萌发率的影响更好，B3对花粉管长度的影响更好。

对于硝酸钙各水平，C1、C2水平间萌发率无显著差异且优于
C3，但C2对花粉管长度的影响比其他2组更有优势，因此取C2水平。

由此，提出最适宜黄檗花粉离体萌发的培养基为A2B3C2，即10%蔗糖+0.008%硼酸
+0.02%硝酸钙。

3 结论
在花粉离体培养中，蔗糖可以为花粉萌发和花粉管壁的合成提供能源物质[10]，本实验中黄檗花粉萌发最适宜的蔗糖体积分数为10%，这与苗阳等[11]对野杏花粉
离体培7养的结果相同；硼的主要作用是参与花粉管顶端细胞壁的形成，增加糖
的吸收、运转和代谢，形成糖硼酸复合体，增加氧的吸收，对迅速伸长的花粉管膜中果胶物质的合成起作用[12]；钙在花粉萌发和花粉管生长中起重要作用，外源钙可以替代花粉萌发时的群体效应，离体花粉的培养基中必须有钙离子[13]，本试验表明适宜的蔗糖浓度可以促进花粉萌发，提高黄檗花粉的萌发率，而对花粉管长度则无显著性影响，硼元素对黄檗花粉管长度有极显著的影响，钙元素对黄檗花粉的萌发率和花粉管长度均有极显著影响，从而筛选出最适宜黄檗花粉萌发的培养基为：10%蔗糖+0.008%硼酸+0.02%硝酸钙。

黄檗花粉萌发还受培养基p H值，培养
温度，培养湿度等因素的影响，因此，还需要试验进一步探讨相关因子是如何参与黄檗离体花粉萌发和花粉管伸长过程。

参考文献
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