梅毒脂质抗体自动化仪试剂的制备

·实验技术与检测·
梅毒脂质抗体自动化仪试剂的制备
张建军１，王永昌２，华凯１，曾艳１，沈瑛１
１ 绍兴市妇幼保健院，浙江绍兴　３１２０００；２ 上虞常春生物技术有限公司／中国科技大学生命科学学院摘要：目的　评价全自动生化分析仪试剂的初步研制方法。

方法　改进梅毒脂质抗体检验试剂为可在全自动生化分析仪上进行自动分析的试剂，并与手工法结果进行比较。

结果　自制定量试剂灵敏度在１Ｒ
Ｕ 时反应吸光度差值＞８０ｍＡｂｓ，线性可达８Ｒ Ｕ ，批内重复性＜４ ５％，批间＜１６％。

回收８８ ４％～１０９ ８％之间。

与手工法的符合程度８８ ６８％。

结论　自制的梅毒脂质体抗体定量试剂临床使用检测速度快、标本用量少、结果重现性好，但其诊断的灵敏度与特异度有待进一步评价。

关键词：梅毒；密螺旋体实验；自动化；乳胶凝集
中图分类号：Ｒ７５９ １ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００７－０９３１（２０１５）０８－０８６２－０３
基金项目：绍兴市公益性技术应用研究计划（２０１２Ｂ７００６１）作者简介：张建军，硕士，副主任技师，主要从事临床生物化学以
及试剂开发工作
通讯作者：张建军，Ｅ－ｍａｉｌ：３３４４６１７０＠ｑｑ ｃｏｍ
梅毒脂质抗体是一类能与广泛分布于组织中的类脂抗原（心磷脂、卵磷脂、胆固醇的混合物）发生非特异性反应的抗体，这类抗体统称为抗心磷脂抗体（反应素），常用于梅毒筛查及判定治疗的效果。

目前我国梅毒脂质抗体检验通常采用的是手工法，存在费时费力、难于标准化操作等问题。

本项目改进原有的手工试剂为可在全自动生化分析仪上进行自动分析的试剂，现将初步的实验结果报告如下。

１　材料与方法
１ １　材料和试剂　自制试剂的材料：心磷脂来自
ｓｉｇｍａ公司和ＡＬ公司。

卵磷脂、胆固醇、乙醇、ＢＳＡ来自国药集团。

载体来自ＢＡＮＧＳ公司的羧基乳胶颗粒（
４００ｎｍ，２６２ｕｅｑ／ｇ）。

ＰＢＳ缓冲液自配。

研究所用的检测标本为绍兴市妇幼保健院２０１２—２０１４年收集无明显溶血和乳糜用作梅毒脂质抗体检测的就诊病例的血清共４６８份。

高值患者标本１份，滴度为１∶６４。

校准品来源于日本积水化学株式会社，含５个浓度，分别为０、１ １、２ ０、４ １和８ ０Ｒ Ｕ 各１ｍＬ，溯源于ＷＨＯ的标准品Ｒ Ｕ （ＲＰＲＵＮＩＴＳ）
，质控品使用上海荣盛公司ＴＲＵＳＴ试剂盒中所配的阴阳质控品，对照所用定性脂质抗体试剂选用的上海荣盛公司ＴＲＵＳＴ试剂盒。

阴阳性对照
为该试剂盒配套。

确认梅毒方法使用ＴＰＰＡ试剂盒为日本富士公司生产。

离心机为中科中佳Ｈｃ－２５１８，混匀器为新康公司的ＸＫ－９７－２型双向恒温搅拌器，生化自动分析仪为日立７６０００２０。

１ ２　方法
１ ２ １　试剂的配置　Ｒ１试剂（缓冲液）配制：０ ０５Ｍ磷酸盐缓冲液中，加入１％ＢＳＡ（牛血清白蛋白）。

Ｒ２试剂（
乳胶试剂）的配制：取４０μＬ羧基乳胶颗粒，加入１ｍＬ去离子水，添加浓度为２０ｍｇ／ｍＬＢＳＡ５０μＬ，轻轻搅拌５ｍｉｎ，置３７℃水浴２ｈ，１００００ｒｐｍ２０ｍｉｎ离心，去除上清液，沉淀颗粒于磷酸盐缓冲液中混匀。

按以上步骤再次离心、去上清液及重悬２次。

将此产物孵育２０ｍｉｎ后上下混匀，加入０ ５ｍＬ脂质抗原溶液（心磷脂约０ ０５％，０ ２１％的卵磷脂，１％胆固醇组成，溶剂为乙醇）。

在３７℃中搅拌４ｈ。

之后将此原液进行离心处理，除去上清液，将沉淀物再用含１％ＢＳＡ的ＰＢＳ进行冲洗。

重复离心去上清一次，最后用含１％ＢＳＡ的ＰＢＳ５ｍＬ进行悬浊处理，即为仪器Ｒ２试剂。

１ ２ ２　仪器设置
１ ２ ２ １　仪器参数样本试剂比的确定　取原液ＴＲＵＳＴ弱阳性样本（对倍稀释后为阴性）。

取５ｍＬＲ２试剂离心去上清后加入１％ＢＳＡ的ＰＢＳ至１ ５ｍＬ作为Ｒ２手工液。

在玻片上用显微镜分别观察弱阳性标本（５０μＬ）与不同Ｒ２手工试剂量时（从２０μＬ到１００μＬ），每次增加１０μＬ的凝集情况（操作如ＴＲＵＳＴ手工法）。

获得凝集度最高时Ｒ２手工试剂量５０μＬ。

设置样本∶Ｒ１∶Ｒ２比例为１
∶９∶３（Ｒ２为仪器用试剂），分别为２０、１８０和６０μＬ。

这样试剂空白降低近手工空白的十分之一。

１ ２ ２ ２　测定波长设置　采用的胶乳颗粒大小为４００ｎｍ，在７００ｎｍ波长处胶乳颗粒大小的变化可以获得较大的浊度变化。

１ ２ ２ ３　测定方法选择　加入Ｒ２后，反应曲线并不平直。

测定方法选择终点法。

测定反应初和反应结束时吸光度值。

１ ２ ２ ４　吸光度读数点的设置　生化分析仪是日立７６００，其约１８ｓ自动测定一次吸光度，全程１０ｍｉｎ共测定３４个吸光点。

加入Ｒ２的时间是固定在１６点和１７点间即加入样本和Ｒ１试剂后的３００ｓ处。

初始吸光点选择加入Ｒ２后第一点，可以去除试剂空白。

终点吸光度选择３４点（加入Ｒ２后３００ｓ），可以获得最大吸光度变化量以提高试剂敏感度。

１ ２ ２ ５　校准　以５个浓度的标准品的吸光度变化量（Δａｂｓ）作校准曲线（ｙ＝０ ０５２８ｘ－０ ００４４，Ｒ２＝０ ９９２９），从而得出标本的浓度，见图１。

图１　标准曲线
１ ２ ３　测定　自制试剂测定：在全自动生化分析仪上按上述参数设置后，对待测血清进行检测。

对高值患者标本（滴度１∶６４）进行对倍稀释，得到分别为１∶６４、１∶３２、１∶１６、１∶８、１∶４、１∶２和１∶１七份样本，进行测定。

阳性ＣＵＴＯＦＦ值设在１Ｒ Ｕ 。

ＴＲＵＳＴ的测定：分别吸取５０μＬ梅毒阳性对照和阴性对照均匀铺加在纸卡的两个圆圈中；取待检血清５０μＬ置于纸卡的另一圆圈中；用专用滴管垂直分别滴加ＴＲＵＳＴ试剂１滴于上述血清中，以１００转／ｍｉｎ速度摇动８ｍｉｎ，肉眼观察结果。

ＴＰＰＡ实验方法：取一块Ｕ型板，从１～４标记好４孔；于第１孔加入样本稀释液１００μＬ，第２孔～第４孔分别加入２５μＬ稀释液；吸取２５μＬ待检血清加入第１孔中，混匀后吸出２５μＬ再加入第２孔中，以此类推，第４孔混匀后吸出２５μＬ弃去；于第３孔加入预先稀释好的未致敏粒子２５μＬ，第４孔加入至敏粒子２５μＬ，微量振荡器上混匀１０ｓ后放置孵育箱３７℃１ｈ，后观察结果。

２　结　果
２ １　质控结果　阴性质控结果全部为０Ｒ Ｕ 。

阳性质控结果平均值为２ ４８Ｒ Ｕ ，结果在２～３Ｒ Ｕ 之间。

２ ２　分析灵敏度实验　使用值＞１Ｒ Ｕ 样本测试，记录在吸光度改变，换算为１Ｒ Ｕ 的吸光度变化（ΔＡ）＞８０ｍＡｂｓ。

２ ３　线性实验　对高值患者标本（滴度１∶６４）进行对倍稀释，得到分别为１∶６４、１∶３２、１∶１６、１∶８、１∶４、１∶２和１∶１七份样本，进行测定，结果见图２。

图２　不同稀释时的测定结果
２ ４　重复性试验　取高、低ＲＰＲ浓度的血清各一份，批内各重复测定２０次，得ｘｌ＝４ ６Ｒ Ｕ ，ｓ１＝０ １７２Ｒ Ｕ ，ＣＶ
１批内
＝３ ８１％和ｘ２＝１ １Ｒ Ｕ ，
ｓ２＝０ ０４９Ｒ Ｕ ，ＣＶ
２批内
＝４ ４５％。

批间各重复测定４０次（血清分装，－２０℃保存，每天各２次，共测２０ｄ），得ｘｌ＝４ ５Ｒ Ｕ，ｓ１＝０ ５６Ｒ Ｕ ，
ＣＶ
１批间
＝１２ １％和ｘ２＝１ ０Ｒ Ｕ ，ｓ２＝０ １５４
Ｒ Ｕ ，ＣＶ
２批间
＝１５ ４％。

２ ５　回收试验　取值约２ ６Ｒ Ｕ 的混合血清３份，每份０ ９ｍＬ依次加入的１Ｒ Ｕ 标准血清０ １ｍＬ，测得回收率为８８ ４％～１０９ ８％。

２ ６　自制试剂上机和ＴＲＵＳＴ手工的检测结果比较对于自制试剂上机法检测结果，若以手工法为评价
标准，２２例上机法假阴性以及３１例上机法假阳性，两者符合程度为８８ ６８％，但由于手工法并非金标准，故自制试剂上机法的诊断灵敏度和特异度尚有待进一步研究。

见表１。

表１　自制试剂上机和ＴＲＵＳＴ手工的检测结果比较
自制试剂上机法
＞１Ｒ．Ｕ．＜１Ｒ．Ｕ．
合计
ＴＲＵＳＴ手工法阳性１９５２２２１７
阴性３１２２０２５１
３　讨　论
在临床实验室常用的梅毒检测方法一般需手工进行，肉眼或显微镜观察结果，容易误判，而且不能准确定量，很难量化疗效。

国外已开始研究自动化检测梅毒的方法，自动化定量检测必将成为梅毒检测的发展趋势。

另一方面，我国梅毒感染呈上升趋势［１－２］，甚至胎传梅毒感染也呈逐年上升趋势［３］，不仅关系到患者本身，还关系到我国出生人口素质，因此，尽快提高梅毒的自动化检测手段已是近年的研究热点。

本研究主要集中在国产自动化免疫浊度定量分析试剂的研发。

由于进口试剂价格昂贵，很难在临床开展。

急需开发价格低廉的国产试剂；目前国内尚无定量梅毒脂质体抗体定量试剂盒。

本研究旨在开发稳定可靠的国产试剂，更好地应用于临床。

光散射中，当颗粒直径大于波长时，属于Ｍｉｅ反射。

颗粒直径变化将产生非常强烈光信号变化。

颗粒大小与所采用的波长相近时所呈现的散射光最为强烈，故本研究中使用４００ｎｍ微球。

并且在微球聚集时，使用７００ｎｍ处测定其光信号。

为了使有效信号处于仪器合理的范围，Ｒ２试剂的浊度（主要由颗粒多少决定）应该尽可能低（即空白低），但在另一方面，Ｒ２中太低的致敏胶乳浓度不利于悬浊，从而降低反应体系的稳定性和重现性。

仪器法测量凝集时需要更低的空白吸光度，一般约为手工空白的十分之一［４］。

本研究对自制试剂的灵敏度、线性、重复性、准确性方面进行初步的评价［５］。

从目前初步的实验结果来看，目前自制定量试剂灵敏度在１Ｒ Ｕ 时反应吸光度差值＞８０ｍＡｂｓ，线性可达８Ｒ Ｕ ，批内重复性＜４ ５％，批间＜１６％。

回收率在８８ ４％～１０９ ８％之间。

另外，手工法操作繁琐，结果判定影响因素多，人为因素干扰大，结果重现性不好。

在疗效评估上，由定性改为定量，手工改为仪器自动化，使操作更易标准化，效果明显优于手工法。

绍兴市妇幼保健院自制的梅毒脂质体抗体定量试剂很好地满足了临床使用要求，速度快，标本用量少，结果重现性好，临床疗效容易评估和比较。

另外，其试剂用量更省、更经济。

ＶＲＤＬ抗原衍生的方法技术对于梅毒的诊断都存在特异性低的缺点，这个是由梅毒疾病本身决定。

在ＶＲＤＬ抗原衍生的方法技术与梅毒特异抗原衍生的方法技术之间做比较没有太多的意义。

所以建议脂质抗体的检查，应放在结合特异性梅毒抗体检测对梅毒诊断上，更主要的应放在疗效的评估上，这一点也与国外专家观点类似［６］。

本研究目前仍存在一些问题，就是试剂无法很好地悬浮混匀，临用前必须经过振荡混匀后使用，所以表现为批内精密度较好，而批间精密度有待提高。

如何解决这个问题，有待于进一步研究和改进。

另外，本研究仅涉及初步的评估，在有条件时还应该进行干扰实验、加速实验等实验，从而全面评估定量试剂盒的性能。

参考文献
［１］ＴｕｃｋｅｒＪＤ，ＹｉｎＹＰ，ＷａｎｇＢ，ｅｔａｌ．ＡｎｅｘｐａｎｄｉｎｇｓｙｐｈｉｌｉｓｅｐｉｄｅｍｉｃｉｎＣｈｉｎａ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌｒｉｓｋａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ
ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｗｉｔｈａｆｏｃｕｓｏｎｌｏｗ－ｔｉｅｒｆｅｍａｌｅｓｅｘｗｏｒｋｅｒｓａｎｄｍｅｎ
ｗｈｏｈａｖｅｓｅｘｗｉｔｈｍｅｎ［Ｊ］．ＳｅｘＴｒａｎｓｍｉｎｆｅｃｔ，２０１１，８７
（Ｓｕｐｐｌ２）：１６－１８．
［２］ＭｕｅｓｓｉｑＫＥ，ＣｏｈｅｎＭＳ．Ｅｄｉｔｏｒｉａｌｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ：Ｃｈｉｎａ，ＨＩＶ，ａｎｄｓｙｐｈｉｌｉｓａｍｏｎｇｍｅｎｗｈｏｈａｖｅｓｅｘｗｉｔｈｍｅｎ：ａｎｕｒｇｅｎｔｃａｌｌｔｏ
ａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓ，２０１３，５７（２）：３１０－３１３．［３］张建军，曾艳，张秀兰，等．苍白密螺旋体及ＲＣＨ母婴垂直传播的研究［Ｊ］．中华医院感染学杂志，２０１１，２１（１３）：２６６７－２６６８．
［４］ＦｒａｎｃｅｓｃｏＤａｔｉａｌ．蛋白质实验室检测项目临床应用指南［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，２００８：１０．
［５］国家食品药品监督管理局医疗器械技术审评中心．体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则（征求意见稿）［Ｚ］．２００９
－０６－０１．
［６］ＬｏｅｆｆｅｌｈｏｌｚＭＪ，ＢｉｎｎｉｃｋｅｒＭＪ．Ｉｔｉｓｔｉｍｅｔｏｕｓｅｔｒｅｐｏｎｅｍａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｅｓｔｓｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｆｏｓｙｐｈｉｌｉｓ［Ｊ］．Ｊ
ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１２，５０（１）：２－６．
收稿日期：２０１４－０７－１７　修回日期：２０１４－０９－２３　本文编辑：吴陈军。