2章还有桃花运

DNA聚合酶III各亚基功能
DNA聚合酶III结构
DNApolymeraseIIIis thought to function as an asymmetric dimer: One monomer consisting of the core subunits, two β subunits and two τ subunits LEADING STRAND SYNTHESIS The other monomer consisting of the core subunits, two βsubunits and two copies of the γcomplex polypeptides LAGGING STRAND SYNTHESIS
一条短rna与一条dna互补取代了该区域原来的互补的dna链使得两条链的合成高度不对称一条链上迅速合成出互补链另一条链则为游离的原核生物和真核生物dna的复制特点dna聚合酶dna聚合酶i有3?5?核酸外切酶活性还有5?3?核酸外切酶的功能可作用于双链dna又可水解5?末端或距5?末端几个核苷酸处的磷酸二酯键因而该酶被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着重要的作用
• 真核生物DNA复制的起始,需要起始原点识别 复合物（ORC）参与。 • 真 核 生 物 DNA 复 制 叉 的 移 动 速 度 大 约 只 有 50bp/秒，还不到大肠杆菌的1/20，因此，人 类DNA中每隔30,000-300,000bp就有一个复制 起始位点。
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Eukaryotic enzymes: Much less is known, but five DNA polymerases are known in mammals. Polymerase (alpha): nuclear, DNA replication, no proofreading Polymerase (beta): nuclear, DNA repair, no proofreading
大肠杆菌中DNA复制的终止
• 引发体像火车头一样在滞后链分叉的方向上前 进，并在模板上断断续续地引发生成滞后链的 RNA引物短链，再由DNA聚合酶III作用合成DNA， 直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。 • 由RNaseH降解RNA引物并由DNA聚合酶I将缺口 补齐，再由DNA连接酶将两个冈崎片段连在一 起形成大分子DNA。 • 除Tus蛋白以外，链的终止不需要太多蛋白质 参与。当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子 序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉 的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在 DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释 放子链DNA
Do not forget:
• All nucleic acid synthesis proceeds by linking new nucleotides to free 3' OH group of a terminal pentose sugar • All DNA synthesis requires a short RNA primer to begin
– Helicases – Primases – Polymerases – ligases – Topoisomerases
• 真 核 生 物 DNA 的 复 制 子 被 称 为 ARS （autonomously replicating sequences），长 约150bp左右，包括数个复制起始必需的保守 区。
3)RNase H cut down RNA primer
4)DNA Polymerase I replaces DNA Polymerase III and replaces RNA primer with DNA 5)DNA Ligase replaces DNA Polymerase I and binds the two Okazaki fragments together.*
2.3.3复制的几种主要方式
2.3.3.1 线性DNA双链的复制 2.3.3.2 环状DNA双链的复制 (1)θ型 (2) 滚环型(rolling circle) (3) D-环型(D-loop)
环状DNA双链的复制-θ型
大肠杆菌质粒DNA双向复制的模式与实验验证。上：θ形复制模式图；下：3H 标记质粒DNA合成图。
复制的引发和终止
• DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成 一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3‘ 端开始 合成新的DNA链。 • 对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有 一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点一直合成 下去。 • 滞后链的引发过程往往由引发体（primosome）来完 成。引发体由6种蛋白质n、n'、n''、Dna B、C和I共 同组成，只有当引发前体（preprimosome）把这6种 蛋白质合在一起并与引发酶（primase）进一步组装 后形成引发体，才能发挥其功效。
DNA聚合酶的共同点：
1、都以dNTP为底物。 2、都需要Mg2+激活。 3、聚合时必须有模板链和具有3‘—OH 末端的引物链。 4、链的延伸都方向为5'→3'。
Review of the E. coli DNA polymerases
DNA Pol III: 合成大多数的DNA DNA Pol I: 切口平移和后继链引物 切除 DNA Pol II: DNA 修复（下一部分 的内容)
DnaB（解链酶）六体分别与单链DNA相结合（需要 DnaC的帮助）进一步解开DNA双链。
Initiation of replication at oriC
• DnaA binds and begins to melt double helix • Helicase (DnaB) continues to separate strands
部分生物复制子的比较
细菌、病毒和线粒体的DNA分子都 是作为单个复制子完成复制的；真 核生物基因组可以同时在多个复制 起点上进行双向复制，也就是说它 们的基因组包含有多个复制子。
真核生物的复制子
放射性标记实验证明DNA的复制是从固定的 起始点双向等速进行的
A.DNA仅用[3H]胸腺嘧啶标记10 min 即压X光片； B.DNA在[3H]标记10 min 后又继续非标记合成10 min，导致X光片上的复制叉变长， 银颗粒分布广而稀少。
DNA的半保留复制（semi-conservative replication）
DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链， 产生互补的两条链。这样新形成的两个DNA分子与 原来DNA分子的碱基顺序完全一样。因此，每个子 代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合 成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。
1958年，Meselson和Stahl研究了经N15标记3个世代的大肠杆 菌DNA,首次证明了DNA的半保留复制。
Hale Waihona Puke 2. 3. 2 复制的起点、方向和速度
复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行， 所以，复制起点呈叉子形式，被称为复制叉 (Replication fork)。DNA的复制是由固定的起 始点开始的。一般把生物体的复制单位称为 复制子（replicon），一个复制子只含一个复 制起点。
D loop
D loop是单向复制的特殊方 式。首先在动物线粒体中 被发现。一条短RNA与一条 DNA互补，取代了该区域原 来的互补的DNA链，使得两 条链的合成高度不对称， 一条链上迅速合成出互补 链，另一条链则为游离的 单环。
原核生物和真核生物 DNA的复制特点
DNA聚合酶
• DNA聚合酶I 有3'→5'核酸外切酶活性，还有5'→3'核 酸外切酶的功能，可作用于双链DNA，又可水解5'末 端或距5'末端几个核苷酸处的磷酸二酯键，因而该酶被 认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着 重要的作用。它也可用以除去冈崎片段5'端RNA引物， 使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来。
1)Short sections of DNA (Okazaki fragments) are produced and later linked together
2)Lagging strand is made by linking the Okazaki fragments together
DNA的复制分为三步
• 1 起始 • 2 延伸 • 3 终止
大肠杆菌DNA复制起始点（OriC）保 守序列分布图
OriC in E.coli chromosomal DNA
大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处 的4各9 bp保守序列相结合。
在Hu蛋白和ATP的共同作用下，DnaA复制起始复合 物使3x13 bp直接重复序列变形，形成开链。
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•
Polymerase (gamma): mitochondria, DNA repl., proofreading
Polymerase (delta): nuclear, DNA replication, proofreading
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Polymerase (epsilon): nuclear, DNA repair (?), proofreading
2.4.2 真核生物DNA的复制特点
Eukaryotic DNA synthesis
• DNA synthesis is very similar in prokaryotes and eukaryotes • Many of the same enzyme activities are present
DNA聚合酶的编辑功能
5’ to 3’ exonuclease: 是切除5’端的磷酸 核苷键，如后继链的RNA引物。
5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’

3’ to 5’ exonuclease: 切除3’端的核苷，在核酸 复制中起校正作用。
5’ 3’ 5’ 3’
5’
5’
5’ 3’
5’
• 在真核细胞中主要有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶α 、β 、 γ 、δ 和ε 。 • DNA聚合酶α 的功能主要是引物合成。DNA聚合酶β 活性水平稳定， 可能主要在DNA损伤的修复中起作用。DNA聚合酶δ 是主要负责 DNA复制的酶，参与先导链和滞后链的合成。而DNA聚合酶ε 的主 要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口补全。
• DNA聚合酶II 具有5‘→3’方向聚合酶活性，酶活性很 低。其3‘→5’核酸外切酶活性可起校正作用。目前认为 DNA聚合酶II生理功能主要是修复DNA的作用。
• DNA聚合酶III 包含有7种不同的亚单位和9个亚基。生 物活性形式为二聚体。它有5'→3'方向聚合酶活性，也 有3'→5'核酸外切酶活性。是大肠杆菌DNA复制中链延 长反应的主导聚合酶。
2. 3 DNA的复制
生命的遗传实际上是染色体DNA自我复制的结 果，而染色体DNA的自我复制主要是通过半保 留复制(Semi-conservative)来实现的，是一个 以亲代DNA分子为模板合成子代DNA链的过程。 由于DNA是遗传信息的载体，因此亲代DNA必 须以自身分子为模板来合成新的分子——准确 地复制成两个拷贝，并分配到两个子代细胞中 去，才能真正完成其遗传信息载体的使命。
(2)DNA解链酶（DNA helicase） DNA解链酶能通过水解ATP获得能量来解开双链 DNA。大部分DNA解链酶（包括大肠杆菌解链酶 II、III、T4噬菌体dda、T4基因41和人解链酶等） 可沿滞后链模板的5'→3'方向并随着复制叉的前 进而移动，只有另一种解链（Rep蛋白）是沿前 导链模板的3'→5'方向移动。因此推测Rep蛋白和 特定DNA解链酶分别在DNA的两条母链上协同作 用，以解开双链DNA。

(1)单链结合蛋白（SSB蛋白）
• 最初发现噬菌体T4的基因32蛋白可以在远低于解链温度 时使双链DNA分开，并牢牢地结合在单链DNA上，后来 发现许多生物中都有这类蛋白。 • 从原核生物得到的SSB蛋白与DNA结合时还表现出协同 效应：如第一个SSB蛋白结合到DNA上去的能力为1，第 二个SSB结合能力则可高达103；真核生物牛、鼠和人细 胞中的SSB蛋白与单链DNA结合时，则不表现上述协同 效应。 • SSB蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成 前能保持单链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处， 待单链复制后才掉下，重新循环。所以，SSB蛋白只保 持单链的存在，并不能起解链的作用。